1型核糖体失活蛋白的制备和应用的制作方法

专利名称：1型核糖体失活蛋白的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及重组1型核糖体抑制蛋白的制备和/或在治疗癌症及传染性疾病的中的应用。
背景技术：
广泛存在于植物中的核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins,RIPs) 因其药用性能，自古以来便一直被应用。南瓜蛋白(cucurmosin)是1型RIP的一个示例。 1型RII3S是约3万道尔顿(kDa)的单体，而2型RII3s是异源二聚体。1型RII3S对正常细胞的毒性通常比2型Rib小。南瓜蛋白从南瓜(pumpkin)种子中分离得到一人类食用天然的南瓜子说明了它的低毒本性。与培养液中的正常细胞比较而言，南瓜蛋白通过诱导细胞凋亡对肿瘤细胞有选择毒性。RIf3S如南瓜蛋白除了具有治疗肿瘤的潜力外，还可用于抗病毒制剂和抗真菌制剂。RIPs是一大类蛋白，通常存在于植物体的一种或几种组织中。基于蛋白亚基的数目和结合方式，它们可以分为三大类型。I型RIPs(60种以上)含有^KBlkDa的单肽链。 II型RH3S (约克隆了 15种)包括蓖麻毒素(ricin)化合物，具有两个二硫键连接的肽链一一个有酶活性的A肽链和一个含凝集素的B肽链使得它与许多类型的细胞相互作用。III型 RII3S是另一种非典型性的，比类I型或II型RIf3S的特性了解少许多的RIPs，它们含有内部抑制肽或未知功能的蛋白肽链。RIP在其天然宿主中的表达通常是受到多种恶劣环境对植物的刺激引起的，包括病毒感染。经常在细胞衰老时看到它的表达。这些观察表明RIf3S是植物体内保持适当细胞增长的特有的防御机制，而这一假设强调了它具有可作为人类抗肿瘤及传染性疾病药物的潜力。RIf3S抑制蛋白质合成。通过和许多核糖体蛋白相互作用，RIPs以核糖体为目标具有N-糖苷酶的作用，切掉^S核糖体RNA(rRNA)保守“sarcin/ricin”环上43M位点的腺苷酸。除了该rRNA切割活性外，Rib还具有其它酶的活性。它能特异性去除参与DNA修复的多腺苷二磷酸多聚酶(PARP)蛋白的腺苷二磷酸核糖链上的腺嘌呤。两个RII^s与DNA 损伤有关，表明半胱氨酸天冬氨酸酶活性导致细胞凋亡。一些RIPs具有糖苷酶-非依赖型核酸酶活性以及超氧化物歧化酶/抗氧化活性。有报道RIf3S能和mRNAs的5’端帽子结构相互作用，因为真核生物帽子结合蛋白eIF4E可以转化细胞，与翻译缺陷有关联的转化和某些癌症有关(例如，乳腺癌)。总之，虽然rRNA修饰活性研究得最深入，Rib在细胞中似乎具有其它活性以发挥它的生物学效应。RIPs能保护植物免受各种感染疾病(例如，病毒)。导入RIP基因到商品化的作物中可能防御一些这样的疾病。发明概述在一些实施方案中，制备基本纯化的重组1型核糖体失活蛋白(RIP)的方法包括获得蛋白序列。该蛋白序列包括至少部分重组1型RIP。该方法包括采用在宿主细胞中表达1型RIP的基因优化序列合成编码1型RIP的核酸。该方法包括克隆核酸到合适的表达载体。该方法包括转化表达载体到合适的蛋白表达系统中。该方法包括诱导重组1型RIP 的表达。在一些实施方案中，该方法包括基本纯化表达的重组1型RIP。在一些实施方案中，重组1型RIP可以用来治疗癌症和/或感染性疾病，包括对将受益于该治疗的病人施以有效量的组合物。所述组合物包括重组1型RIP和/或其功能衍生物。在一些实施方案中，药物组合物可适用于治疗癌症。该药物组合物包括有效量的天然南瓜蛋白、重组南瓜蛋白和/或其功能衍生物。该药物组合物可包括适合的药用载体介质。在一些实施方案中，重组南瓜蛋白的功能衍生物包括一个或多个与配体结合的南瓜蛋白，截短的南瓜蛋白多肽和/或南瓜蛋白多肽。南瓜蛋白多肽可包括在序列中含有一个以上突变的序列。在一些实施方案中，诱导癌细胞凋亡的方法包括将至少部分纯化的重组南瓜蛋白和/或其功能衍生物的制剂与癌细胞接触。在一些实施方案中，制备基本纯化的重组南瓜蛋白的方法包括得到核酸序列。该核酸序列包括编码至少部分重组南瓜蛋白的序列。该方法包括克隆核酸到合适的表达载体。该方法包括转化表达载体到合适的蛋白表达系统中。该方法包括诱导重组南瓜蛋白的表达。该方法包括基本纯化表达的重组南瓜蛋白。


下列详细描述和参考附图将清楚呈现本发明的其它目的和优点。图1描述了通过尾静脉注射重组南瓜蛋白治疗小鼠HMEL肿瘤的结果。本发明可以进行多种修改和改进，本发明的特定实施方案通过附图中的示例呈现并将作详细描述。然而应理解，所述附图和详细描述并非限制于发明公开的特定形式，相反地，其旨在包括如权利要求所定义的，落入本发明精神和范围内的所有修改、等同和替代。发明详述应理解本发明并非限制于特定的装置或生物系统，它当然是可以改变的。也必须理解这里应用的术语只是用于描述特定的实施方案，并非限制。本发明及所附权利要求中单数形式“一个、一种(a) ”，“一个、一种(an)”和“这个、这种(the) ”，如文中无明确指出， 包括单数和复数。因此，比如说” 一个接头”包括一个或多个接头。在一些实施方案中，提供制备至少部分纯化的重组1型RIP和/或其功能衍生物的方法。该方法包括获得含有至少部分1型RIP开放阅读框(ORF)的表达载体，所述开放阅读框(ORF)含有优化的基因序列，并将表达载体导入到合适的宿主细胞。该方法包括分离由宿主细胞表达的重组蛋白。在一些实施方案中，提供制备至少部分纯化的重组南瓜蛋白的方法。该方法包括获得含有至少部分南瓜蛋白ORF序列的表达载体，并将表达载体导入到合适的宿主细胞。 该方法还包括分离由宿主细胞表达的重组蛋白。本文提到的“1型核糖体失活蛋白”(Rib)，是指植物界中的一个蛋白家族，其为具有细胞毒性的酶。RII3S可能是多聚核酸腺苷酸糖苷酶，它切掉真核生物核糖体a-sarcin/ ricin(S/R)环保守序列GAGA的糖苷键。通常，无论核糖体蛋白是否存在，1型Rib可以对原核生物和真核生物的核糖体RNA(rRNA)脱嘌呤。但并非所有的1型RII3s能对全部原核生物的rRNA脱嘌呤。那些对大肠杆菌(E. coli)rRNA有活性的1型RIP切割A4660和 23SrRNA核糖间的键。rRNA脱嘌呤使核糖体失活并抑制细胞内蛋白合成。1型Rib也可以使DNA、多聚(A)、病毒RNA和mRNA脱嘌呤。天然植物来源的1型RII^s包括分子量约3万道尔顿(kDa)的单链多肽。1型 Rib可以前体原形式表达，具有N-端信号肽序列(前)和C-端序列(原)。这些序列可被切割产生成熟蛋白。1型RII3S可包括，但不限于南瓜蛋白(cucurmosin)、中国南瓜蛋白(moschatin)、ME1、天花粉蛋白(tricosanthin)、石竹素(dianthin)、三角梅蛋白(bouganin)、泻根蛋白(bryodin)、多花白树毒蛋白(gelonin)、美洲商陆抗病毒蛋白 (pokeweed antiviral protein, PAP)、月巴阜草素(saporin)、佛手瓜蛋白(sechiumin)、苦瓜蛋白(momorcharin)、丝瓜蛋白(luffin)、CAP30、绞股蓝蛋白(trichoanguin)、甜菜素 (beetin)、karasurin-A、clavin 禾口剪秋罗试(Iychnin)。在一些实施方案中，1型RIP可以是1型RIP的衍生物。在一个实施方案中，它可以是前体原-RIP。在一个实施方案中，它可能是前体-RIP。在一个实施方案中，它可能是原-RIP。任何这些衍生物都可用亲和处理(即标签)来简化提纯。在一个实施方案中，1 型RIP包括在N端或C端的多聚组氨酸序列。另一些可用来纯化1型RIP的标签包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)、生物素等。在一个实施方案中，1型RIP可包括在N端或C端的麦芽糖结合蛋白。本领域技术人员应知道还有许多可采用的亲和提纯的方法。当连上亲和配体后，带有标签的1型RIP可以通过亲和柱得到纯化。纯化后可采用已知的去偶联方法去掉 1型RIP上的标签。在一些实施方案中，1型RIP可包括非糖基化的RIP蛋白(例如，南瓜蛋白，来源于中国南瓜果肉的1型RIP，见本文下述的kq ID No. 5)。可对1型RIP的结构进行翻译后修饰。例如，糖基(如N-乙酰基-D-葡萄糖胺、β -D-甘露糖、α -D-甘露糖和吡喃木糖) 可连在一起形成一条链并连接到天冬氨酸225的侧链上(在VQITNVTSNV序列的中间)。在一个实施方案中，与天然分离得到的蛋白或从cDNA翻译的蛋白序列相比，可对 1型RIP序列中进行一个或几个氨基酸替换。在一个实施方案中，与天然分离得到的蛋白或从cDNA翻译的蛋白序列相比，可对1型RIP序列缺失或添加氨基酸。在一个实施方案中，1型RIP可能是对大肠杆菌无致死作用但对哺乳动物细胞有细胞毒性的突变体。本文使用的“宿主细胞”一般是指重组蛋白在其中表达的细胞。宿主细胞可以是原核生物的、酵母的、植物的、昆虫的细胞和/或哺乳动物的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞可以是大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞可能是大肠杆菌BL21(DE3)pLys S。在一个实施方案中，酵母可能是Pichia。在一个实施方案中，昆虫细胞可包括Sf9细胞。在一个实施方案中，宿主细胞可以包括烟草。在一个实施方案中，宿主细胞可以是普通烟草 (Nicotiana tabacum)0在一个实施方案中，宿主细胞可以是含有不被1型RIP失活的突变核糖体的大肠杆菌株。在一个实施方案中，通常对大肠杆菌有毒性1型RIP可以在这些大肠杆菌中表达。本文所用的“基因优化”通常是指产生可以在宿主细胞中生成最佳产量的基因产物的序列的方法。本领域技术人员应知道许多方法可以进行基因优化。Optimum Gene 由GenScript公司(Piscataway，NJ)提供。该算法涉及的因素包括但不限于，密码子使用偏差，mRNA结构、GC含量、宿主细胞的启动子序列和终止子序列。本文所用的配体，一般是指能与细胞表面特异性结合的分子。通常，配体特异性结合细胞受体。配体包括但不限于蛋白质、糖蛋白、糖类、适体或脂类。在一个实施方案中，配体可以包括单克隆抗体(MAB)。MAB可以从动物(例如，小鼠或大鼠)腹水中分离得到。MAB也可以从细胞培养的上清液中分离得到。可用作配体的 MAB可以是IgG亚型，也可以是IgM、IgE或IgA亚型。通常，使用蛋白A或蛋白G葡聚糖对 IgGMAB进行亲和纯化。在其它实施方案中，MAB可通过盐析法分离。MABs还有许多商业化来源。在一些实例中，根据其识别细胞受体的天然结构来选择MAB。在许多实例中，MAB只识别变性形式的细胞受体，用于诸如免疫印迹或固定的免疫荧光试验(IFA)。在一些实施方案中，MAB用于免疫沉淀或非固定的IFA最能发挥功能。在一个实施方案中，配体是含有互补决定区或抗原结合位点的MAB衍生物。在一些方面，MAB片段可以是重组蛋白。本领域技术人员应知道有许多方法可以产生和修饰 MAB。在一些实施方案中，MAB片段可以被重组表达并纯化成单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，重组MAB可以通过遗传操作使其更易与载体结合。在一些实施方案中，重组 MAB可以用蛋白酶消化产生可以结合抗原的MAB片段(Fab)。在一个实施方案中，MAB上的糖基可以进行化学或酶法处理使其易与载体结合。在一个实施方案中，配体可以是多克隆抗体。IgG片段可以从血清中分离。在这些实施方案中，IgG的Fc部分可以被巨噬细胞类的细胞上的Fc受体识别。在一个实施方案中，配体可以是细胞受体的天然配体。天然配体可包括肽激素 (如胰岛素)、生长因子(如上皮细胞生长因子)、小分子(如叶酸)、蛋白质和/或糖蛋白 (如血清粘蛋白)。配体可以是天然配体的衍生物(如可以结合到细胞受体的配体片段)。 在一个实施方案中，天然配体包括天然配体的重组蛋白。在一个实施方案中，天然配体可以被修饰。例如，血清粘蛋白，由肝细胞识别的一个糖蛋白，用温和酸水解可将其末端的唾液酸残基去掉形成无唾液酸血清粘蛋白。本文的“免疫偶联物”，通常是指连接有配体的1型RIP。在一个实施方案中，这一连接可以使用交联剂经过化学反应实现。在一个实施方案中，交联剂可以是异双功能基团，包括但不限于芳基叠氮、碳二亚胺、胼、亚氨酸酯、异氰酸盐、马来酰亚胺、N-羟基丁二酰亚胺(MB)-酯和磺基-NHS-酯。它们产生的键可包括但不限于酰胺键、二硫键、腙键和酯键。交联剂的示例包括但不限于琥珀酰亚胺基4-甲酰基苯甲酯(SFB)、琥珀酰亚胺基 4-胼基烟酸酯丙酮腙(SANH)U-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N_琥珀酰亚胺基3- (2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)、2_亚氨基硫烷(Traut，s试剂)、SATA和3- (2-吡啶二硫代)_丙酰胼(PDPH)。在一个实施方案中，当引入反应性醛基时，SFB和1型RIP的游离伯胺基反应。当引入反应性胼基时，SANH和配体的游离伯胺基反应。SFB活化的1型RIP与SANH活化的配体混合。活化的醛基和胼基反应产生腙键，从而产生免疫偶联物。在一个实施方案中，配体和1型RIP的结合可以通过遗传操作产生融合蛋白。配体可以在氨基和羧基末端融合。在一个实施方案中，对融合蛋白的基因序列进行优化以适于在宿主中表达。在一个实施方案中，治疗癌症或感染性疾病的方法可能包括对将受益于该治疗的病人施以有效量的含有1型RIP或南瓜蛋白，和/或其功能衍生物的组合物。在一个实施方案中，防止植物感染性疾病的方法可能包括向目标植物体引入带有优化密码序列的1型RIP或南瓜蛋白基因或其部分，其中，基因产物在植物中表达。在一个实施方案中，用于治疗癌症的药物组合物可包括有效量的重组1型RIP或南瓜蛋白或其功能衍生物及药用载体介质。在一个实施方案中，这些蛋白质可用优化的密码序列表达。在一个实施方案中，重组1型RIP或南瓜蛋白的衍生物可包括结合南瓜蛋白的免疫毒剂、截短的南瓜蛋白多肽和/或其多肽序列中含有至少有一个突变的南瓜蛋白多肽。在一个实施方案中，分离的核酸序列可编码1型RIP的衍生物、截短的1型RIP多肽和/或其多肽序列中含有至少有一个突变的1型RIP多肽。核酸序列可包括适于在宿主细胞中表达的优化的密码子。在一个实施方案中，分离的核酸序列可编码南瓜蛋白多肽的衍生物、截短的南瓜蛋白多肽和/或其多肽序列中含有至少有一个突变的南瓜蛋白多肽。在一个实施方案中， 核酸序列可包括适于在宿主细胞中表达的优化的密码子。在一个实施方案中，杀死癌细胞的方法可包括用至少部分纯化的重组南瓜蛋白和 /或其功能衍生物的制剂作用于癌细胞。在一个实施方案中，方法可包括向个体中引入编码南瓜蛋白衍生物的核酸序列， 使得带有核酸序列的细胞产生有效量的有利于个体的南瓜蛋白多肽。可考虑将本文公开的和本文公开的方法制备的Rib用于以下用途，但不限于此 抗寄生虫，堕胎药，从培养物中去除细胞，抗炎症，抗哮喘，抗过敏，眼科学治疗，农业应用，
兽医应用。在另一个实施方案中，可考虑制备对1型RIP具备特异性的抗体。这一抗体可以用来检测产生这一抗体的RIP。另外，产生的抗体可以用来纯化RIP，例如结合RIP后的亲禾口介质(affinity matrix)。在另一个实施方案中，可以制备基因工程有机体包括标签化的1型RIP及其衍生物和产生方法。这种基因工程有机体可以用来，例如，过表达1型RIP以治疗癌症或其它疾病。
具体实施例方式该发明经过描述，通过参考以下实施例更容易理解，这些实施例通过提供图解的方法但不用来限制本发明。虽然这里描述的类似或等同的方法和材料可以应用或用于测试本发明的实施例，适合的方法和材料描述如下。实施例1 南瓜蛋白cDNA的克隆及测序从南瓜(Cucurbita moschata)子中分离总RNA。叶子冷冻后研磨。向叶子粉末中加入Iml的TRIzol (Invitrogen)并在玻璃勻浆器中混合。不溶解的物质通过离心去除。 溶解相和氯仿混合后，21°C保温2分钟，然后12000rpm离心15分钟。去除上面的水相，和异丙醇混合后离心。RNA沉淀用75%乙醇洗后溶于75 μ 1的洗脱液(Ambion，RNAqueous试剂盒 #AM19U)。用以前公开的南瓜蛋白的蛋白和DNA序列，设计了寡聚核苷酸引物用于从南瓜 RNA中合成南瓜蛋白的cDNA。根据试剂盒厂家的说明书使用FirstChoice RLM-Race 试剂盒(Ambion，#AM1700)产生了 5’和3’末端的PCR产物。PCR产物测序并得到全长 cDNA序列(Seq ID No. 1)和此序列翻译的蛋白序列(Seq ID No. 2)。根据N末端序列数据和成熟蛋白的X射线晶体结构，推断南瓜蛋白为含有245个氨基酸的蛋白，与其它1型 RIPs (Seq ID No. 5)的数据一致。另一方面，蛋白(Seq ID No. 2)在N端含有23个氨基酸的信号肽序列(前序列，pre-sequence)和在C端含有额外的44个氨基酸残基(前体序列，pro-sequence)。这一克隆方法使得我们可以鉴定在南瓜蛋白的C端含有44个额外的氨基酸残基及在N端含有23个氨基酸残基，这些序列可能对活性起关键作用。实施例2 用pUC57载体在大肠杆菌中表达南瓜蛋白为了在大肠杆菌中最大限度地表达南瓜蛋白，我们将要表达的蛋白序列给 GenScript公司(Piscataway，新泽西)合成适于在大肠杆菌中表达的优化的南瓜蛋白基因。Ger^cript公司应用OptimumGene 算法，考虑包含在蛋白表达的不同阶段中的多种关键因素，如密码适应性、GC含量和mRNA结构。在这一实施例中，合成带有5’ T7启动子和C 端组氨酸标签(Seq ID No. 3)的南瓜蛋白前体，并克隆到pUC57载体(Ger^Cript，#SD1176) 的EcoRV位点.该基因序列翻译出含有297个氨基酸的蛋白(Seq ID No. 4)。重组质粒pUC57-RIP转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中。DE3是带有T7RNA聚合酶和IacItl的前噬菌体。对带有T7启动子的转化质粒进行抑制，直到异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)被加入到培养基。PLysS产生Τ7溶菌酶，为胞壁质酶，其切割(水解)蛋白多糖。使用这一系统，重组蛋白表达量在IPTG加入前可被最小化。含pUC57-RIP的克隆在丰富诱导培养基O0g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/ L NaCl, 5N NaOH 1. 2mL/L，1 %葡萄糖，100 μ g/mL氨苄青霉素和氯霉素)上生长。细胞在 37°C摇床长到A600读数达到0. 56。取出少量未诱导的细胞，离心并将冷冻的细胞沉淀用于后面的分析。一半的剩余培养物在25°C培养，另一半在37°C的摇床中培养。IPTG加到两培养物至终浓度为0. 8mM，培养3小时和约18小时.培养完毕后，收获细胞，通过离心沉淀细胞并冷冻于_20°C。全部沉淀的细胞以1/20体积的初始培养物体积在裂解缓冲液(40mM Tris-Cl ρΗ7· 5,0. 5% Triton X-100,0. 5mg/mL溶菌酶，0. OlM NaCl)中裂解。沉淀物经过剧烈震荡直至裂解物粘稠到无法用移液管吸取。此时，加入核酸酶每升培养物)并在冰中放置直至样品可以自由流动(即，不那么粘稠)。样品在Sorvall离心机中10°C离心40分钟。将上清液移至新管，用相同体积的缓冲液重悬浮沉淀。使用SDS-PAGE和免疫印迹法进行样品分析。将样品从SDS-PAGE凝胶上转移至PVDF膜上并用抗组氨酸标签抗体进行探针标记。在25°C生长的细胞中主要检测到前体南瓜蛋白，其分子量为38kDa。该重组RIP的分子量比天然植物蛋白大，这可能是由于实施例1所述的克隆方法中发现的C端氨基酸序列更长的缘故。另外，细胞生长约18小时比诱导3小时产生更多的前体南瓜蛋白。实施例3 用pET24b载体在大肠杆菌中表达与分离前体南瓜蛋白前体南瓜蛋白基因从pUC57-RIP被亚克隆到pET24b。将pUC57-RIP质粒用Nde I和Β ο I消化以切除前体南瓜蛋白基因。将该DNA片段克隆到pET24b的Nde I和Bio I 位点，编码C末端带有6个组氨酸标签的297个氨基酸的前体南瓜蛋白产物，以介导纯化。 将pET24b-RIP载体转化到BL21 (DE3) pLysS细胞中。转化的细胞在37°C下培养于一升的丰富诱导培养基中至A600值为1.0。向培养基中加入IPTG至终浓度为0.8mM，于25°C振荡培养约18小时。沉淀培养物中的细胞，并于50ml的裂解缓冲液中裂解。将裂解物的氯化钠浓度调到300mM并用0. 45 μ m的滤膜进行注射器过滤。组氨酸标签化的前体南瓜蛋白用Talon金属亲和树脂(ClonTech)分离。Iml Talon树脂床用5倍柱体积的IOOmM NaCl :20mMMES pH5. O清洗。树脂柱用4倍柱体积的洗脱缓冲液平衡(300mM NaCl，50mM磷酸钠(单碱的)pH 8.0)。过滤后的裂解物流经树脂柱并收集流出物。然后用 2倍柱体积的洗脱缓冲液及6倍柱体积的洗脱缓冲液(300mM NaCl, 50mM Na3P04pH 7.0)洗柱。样品用2倍柱体积的150mM咪唑洗脱。洗脱液中所含蛋白具有如实施例2中观察到的相同的移动性(比37kDa的标记物稍大些)。每升培养液可分离出约4-10mg的蛋白。实施例4 前体南瓜蛋白对体外癌细胞的细胞毒件将人乳腺癌细胞，MDA 231和BT 474，于组织培养液中生长以测定能够抑制50% 细胞生长的浓度(IC50)。将细胞接种在96孔板上，每孔5000个细胞并在添加有10%胎牛血清和15μ g/ml胰岛素的PMI 1640中过夜培养。换掉培养液。将不同浓度的重组南瓜蛋白、天然南瓜蛋白和长春碱加到细胞中。同样的，非癌细胞L02和淋巴细胞也用这些不同浓度的药物处理。细胞继续培养72小时，然后每孔加入20μ 1的T0X8。细胞在37 °C，5% (X)2 继续培养8小时使其代谢T0X8指示剂。测定每孔在600nm的吸光度。600nm吸光度的降低表明细胞存活。重组南瓜蛋白对这两个癌细胞系的IC50值稍高于20nM (表1)，其与天然南瓜蛋白和常用的癌症药物长春碱非常相似。然而，与长春碱相比，重组南瓜蛋白与天然南瓜蛋白对非癌细胞具有更高的IC50值。这些数据表明重组南瓜蛋白可以是很有用的癌症药物，因为它对癌细胞毒性大于正常细胞，这点不同于长春碱。表1.重组南瓜蛋白的IC50
权利要求
1.制备基本纯化的重组1型核糖体失活蛋白(RIP)的方法，包括 获得包括至少部分重组1型RIP的蛋白序列；采用表达1型RIP的基因序列合成编码1型RIP的核酸序列； 将核酸克隆到合适的表达载体； 转化表达载体到合适的蛋白表达系统中； 诱导重组1型RIP的表达；以及基本纯化表达的重组1型RIP。
2.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白表达系统包括无细胞表达系统。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中蛋白表达系统包括宿主细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中1型RIP包括南瓜蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其中南瓜蛋白包括多聚组氨酸序列。
7.根据权利要求5所述的方法，其中南瓜蛋白包括南瓜蛋白的衍生物。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中1型RIP包括前南瓜蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中前南瓜蛋白包括多聚组氨酸序列。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中1型RIP包括麻疯树核糖体失活蛋白 (trichobakin)。
11.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中1型RIP包括MEl。
12.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中1型RIP包括美洲商陆抗病毒蛋白 (PAP)。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中1型RIP不使宿主核糖体脱嘌呤。
14.根据权利要求1-13任一项所述的方法，其中约>50%的重组1型RIP在可溶的部分。
15.根据权利要求1-14任一项所述的方法，其中重组1型RIP已经突变，因此不使宿主核糖体脱嘌呤。
16.根据权利要求1-15任一项所述的方法，其中1型RIP包括非糖基化的RIP蛋白。
17.根据权利要求1-16任一项所述的方法，其中1型RIP包括标签化的RIP蛋白，其中，标签用于纯化或在作治疗剂时用于直接靶向。
18.根据权利要求1-17任一项所述的方法，其中重组1型RIP用于治疗癌症或感染性疾病，包括对将受益于该治疗的个体施以有效量的含有重组1型RIP和/或其功能衍生物的组合物。
19.根据权利要求1-18任一项所述的方法制备得到的纯化表达的重组1型RIP或其衍生物。
20.含有权利要求19所述的纯化表达的重组1型RIP和药用载体介质的药物组合物。
21.适合用于治疗癌症、病毒感染或人类和非人类生物中的任何其它疾病的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的天然或重组南瓜蛋白，或其功能衍生物，以及合适的药用载体介质。
22.重组南瓜蛋白衍生物，所述衍生物含有一个或几个与南瓜蛋白结合的配体，截短的南瓜蛋白多肽，或在其多肽序列中含有至少一个突变的南瓜蛋白多肽。
23.诱导癌细胞凋亡的方法，包括用至少部分纯化的重组南瓜蛋白或其功能衍生物的制剂处理癌细胞。
24.制备基本纯化的重组南瓜蛋白的方法，包括 获得至少部分南瓜蛋白的核酸序列；克隆核酸到合适的表达载体； 转化表达载体到合适的蛋白表达系统中； 诱导重组南瓜蛋白的表达；以及基本纯化表达的重组南瓜蛋白。
25.根据权利要求M所述的方法，其中蛋白表达系统包括无细胞表达系统。
26.根据权利要求M或25所述的方法，其中蛋白表达系统包括大肠杆菌、麦胚或兔网织红细胞作为宿主细胞。
27.根据权利要求M46任一项所述的方法，其中蛋白质表达系统包括宿主细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞。
29.根据权利要求24- 任一项所述的方法，其中重组南瓜蛋白包括衍生的南瓜蛋白。
30.根据权利要求M-四任一项所述的方法，其中核酸序列包括在大肠杆菌中表达的优化密码子。
31.根据权利要求M-30任一项所述的方法，其中核酸序列包括kq.ID No. 3所示的序列。
32.根据权利要求M-31任一项所述的方法，其中核酸序列包括kq.ID No. 3所示的带有至少一个突变的序列。
33.根据权利要求M-32任一项所述的方法，其中重组南瓜蛋白包括配体结合域。
34.根据权利要求33所述的方法，其中至少配体结合域的一部分与细胞表面实体结合 ο
35.根据权利要求M-34任一项所述的方法，其中重组南瓜蛋白与配体结合。
36.根据权利要求M-35任一项所述的方法，其中重组南瓜蛋白用于治疗癌症或感染性疾病，包括对将受益于该治疗的个体施以有效量的含有重组南瓜蛋白和/或其功能衍生物的组合物。
37.根据权利要求M-36任一项所述的方法，其中重组南瓜蛋白用于制备治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的重组南瓜蛋白和/或其功能衍生物，以及合适的药用载体介质。
38.具有对应于kq.ID No. 5所示序列的结构的重组1型核糖体失活蛋白和其任意修饰的衍生物。
39.具有对应于kq.ID No. 4所示序列的结构的氨基酸序列和其任意修饰的衍生物。
40.具有对应于kq.ID No. 2所示序列的结构的氨基酸序列和其任意修饰的衍生物。
41.具有对应于kq.ID No. 1所示序列的结构的核酸序列和其任意修饰的衍生物。
42.具有对应于kq.ID No. 3所示序列的结构的核酸序列和其任意修饰的衍生物。
43.制备基本纯化的重组1型RIP的方法，包括获得kq. ID No. 1所示的核酸序列； 克隆核酸到合适的表达载体； 转化表达载体到合适的蛋白质表达系统； 诱导重组1型RIP的表达；以及基本纯化表达的重组1型RIP。
44.纯化标签化的1型RIP的方法，包括 表达1型RIP ；用该标签的特异亲和层析柱纯化标签化的重组1型RIP。
45.根据权利要求44所述的方法，其中重组1型RIP标签被切除后用于药物制备。
46.纯化的标签化的1型RIP用作治疗制剂。
47.纯化的1型RIP用作治疗制剂。
48.I型RIP在用于任意类型的植物、动物或昆虫的癌症治疗、病毒性疾病治疗和细菌性疾病治疗中的应用。
49.用于将RIP转运到细胞的共轭化合物，包括 RIP ；配体，其中所述配体能够结合到细胞表面；以及其中RIP和配体相互共价偶联。
50.用于将RIP转运到细胞的共轭化合物，包括 RIP ；配体，其中所述配体能够结合到细胞表面；以及其中RIP和配体是融合蛋白。
全文摘要
本发明涉及表达和纯化重组1型核糖体失活蛋白的方法。包括使用重组南瓜蛋白作为治疗剂治疗癌症和感染性疾病的方法。
文档编号A61K38/04GK102317313SQ200980114916
公开日2012年1月11日 申请日期2009年2月27日 优先权日2008年2月27日
发明者民刚·陈 申请人:柏尔科学公司