专利名称：：肉桂提取物用于治疗淀粉样蛋白相关疾病的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肉桂提取物用于治疗淀粉样蛋白相关疾病，特别是阿耳茨海默氏(Alzheimer，s)病的应用。
背景技术：
：淀粉样蛋白是共享特定结构特征的不可溶性纤维蛋白聚集体。作为淀粉样蛋白原纤维的可溶性蛋白的异常组织沉积可能会导致淀粉样变性，而且还在各种其他神经退行性疾病中起作用。大量的证据表明β-淀粉样蛋白(Αβ)衍生的肽(AiBh4c^nAeH2)的积聚可能在阿耳茨海默氏病、帕金森病、痴呆、朊病毒病、II型糖尿病和各种淀粉样变性病的成因和/或发展中起着突出的作用[1-4]。尽管在各种形成蛋白的淀粉样蛋白之间没有明确的序列同一性，但如电子显微镜和X射线衍射所测定的，所有的淀粉样蛋白结构均享有类似的超微结构性质。淀粉样蛋白疾病的特征在于较大蛋白质沉积物的形成可以是全身性的或是局限于特定器官中。此外，许多淀粉样蛋白疾病的特征是在大脑中形成了原纤维。还表明的是，淀粉样蛋白原纤维具有细胞毒性[5，6]。因此，防止淀粉样蛋白原纤维的形成可获得对淀粉样蛋白相关疾病的创新性治疗。一些学术和工业团体已经参与开发了试图防止淀粉样蛋白沉积物的形成或诱导其消除的技术。这些技术包括使用特定的抗体、小肽和其他影响会导致形成有序淀粉样蛋白原纤维的自组装过程的材料。据报道一些天然提取物会对与淀粉样蛋白有关的破坏性路径提供防护。例如，银杏叶(Gincobiloba)提取物表现出能够保护海马神经元以防止因β-淀粉样蛋白诱发的细胞死亡。IOOyg的该提取物能够保护海马细胞免于与淀粉样蛋白的预先接触(长达8小时)。肉桂作为香料和药品已有悠久的历史。据认为肉桂独特的治疗能力来源于在其树皮中所发现的多种成分。已经表明肉桂具有与血糖控制、抗凝血作用、抗氧化活性和抗微生物活性有关的某些独特的治疗能力。Kim等[7]报道，使用有机溶剂由包括中国肉桂的选定草药中提取的级分保护PC12大鼠嗜铬细胞瘤和原发性神经细胞免受淀粉样蛋白损伤。另据报道，普通肉桂的提取物抑制τ蛋白的聚集并分解已经形成的纤维。本发明的发明人最近证明了肉桂水性提取物对人流感Hmi和其他病毒的抗病毒活性[8-10]。本发明的发明人的另一国际申请第WO05/060352号[11]公开了由肉桂((cinnamonbark，樟属中的种(Cinnamonsp.))获得的天然水性提取物，其具有对包括A型流感、副流感病毒(仙台Gendai)，新城疫(NewCastleDisease))、HIV_1和HSV-1病毒等包膜病毒的抗病毒活性和抑制A型病毒和副流感病毒的体内活性。参考文献[1]Harper,J.D.禾口Lansbury，P.Τ.JrAnnu.Rev.Biochem.，(1997)66:385_407。[2]Prussiner,S.B.,Scott,M.R.,DeArmond,S.J.和Cohen，F.Ε·(1998)Cell,93337-348。[3]Dobson,CM.(1999)TrendsBiochem.Sci.24:329_332。[4]Sipe,J.D.和Cohen，A.S.Q000)J.Mruc.Biol.130:88_98。[5]Lorenzo,A.Razzabonni,B.Weir,G.C.禾口YanknerB.A.Nature(1994)368756-760。[6]Volles,M.J.Lee,S.J.Rochet,J.C.Shtilerman,M.D.Ding,T.T.Kessler,J.C.和Lansbury,P.Τ.JrBichemistry(2001)40:7812_7819。[7]Kim，DS.等，JAlternComplement.2007，13(3):333_40。[8]Barak,I.禾口Ovadia,Μ·NaturalinhibitorofinfluenzaA—PR8extractedfromcinnamon.AntiviralResearch(2005)65:A65。[9]Gueta,K.禾口Ovadia，I·InhibitionofSendaivirusbyanaturalcinnamonextract.AntiviralResearch(2005)65:A124。[10]Gueta等.AnnualMeetingofIsraelAssociationforVeterinaryMicrobiology,December2007,Bet-Dagan。[11]W005/060352。[12]Mosmann,Τ.,RapidColorimetricAssayforCellularGrowthandSurvival!ApplicationtoProliferationandCytotoxicityAssays.J.Immunol.Methods.1983，65，55-63。[13]OakleyH,等.Intraneuronalbeta-amy1οidaggregates,neuro—degeneration,andneuronlossintransgenicmicewithfivefamilialAlzheimer'sdiseasemutations:potentialfactorsinamyloidplaqueformation.J.Neurosci.2006；26:10129_10140。[14]BevinsRA,BesheerJ.Objectrecognitioninratsandmice-.aone-trialnon-matching-to-samplelearningtasktostudy'recognitionmemory'.NatProtoc.2006；1:1306_1311。
发明内容如在国际公开第WO05/060352号[参考文献11]与源于此的所有国家申请中先前公开的，以及现今如本文经修饰和改进所公开的，如今已意外的发现，通过使肉桂皮(Cinnamonsp.)接触水性的、不含有机溶剂的提取条件所获得的肉桂提取物，在治疗淀粉样变性相关疾病或紊乱、抑制原纤维聚集和保护细胞免受由淀粉样蛋白原纤维诱发的破坏活性等方面均是有益的。还重要的是，如今已经认识到水性提取物是用于治疗诸如阿耳茨海默氏病等淀粉样变性相关疾病的独特而富有前景的天然方法。用于分离肉桂提取物(本文中简称为“提取物”)的初步方法之前已披露于国际公开第WO05/060352号中，加以必要修正，通过引用将该公开或其美国同族并入本文中。根据该方法，水性提取物由不含有机溶剂的提取方法获得，该方法包括使研磨的肉桂皮与水或诸如缓冲溶液等水溶液接触，从而由此获得提取物，所述提取物的特征在于以下的一个或多个方面a)在^Onm处的吸光度为10.0.D每mg/ml·cm20.0.D每mg/ml·cm；b)如图1所示的0.D/mg/ml·cm；c)分子量大于或等于IOkDa；d)等电点(IEP)位于pH24；e)水溶解度为5mg/ml20mg/ml，DMSO溶解度为30mg/ml40mg/ml；f)可因诸如KCl、NaCl、MgCl2,SrCl2,CuCl2和ZnCl2等多种氯化物盐中的一种以上而从水中沉淀出；g)在乙醇和丙酮等有机溶剂中稳定；h)在苯酚-硫酸测试中有反应性；i)货架寿命长；和j)抗病毒活性。本发明使用的提取物高度稳定，并且在0.IMNaOH或0.IMHCl或0.IMH2SO4溶液等酸性或碱性溶液中温育后仍然维持其大部分活性，而且可作为稳定粉末或在低于室温的温度或室温的溶液中保存很长的时间(至少2年)；所述提取物还具有热稳定性，因此可通过例如加湿高压灭菌器在高达至少121°C的温度进行灭菌。因此，在一个方面中，本发明提供一种水性肉桂提取物在制备用于治疗至少一种淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的药物组合物中的应用，所述提取物的特征在于以下的一个或多个方面a)在^Onm处的吸光度为100.D每mg/ml·cm200.D每mg/ml·cm；b)分子量大于或等于IOkDa；和/或c)在不存在有机溶剂时通过使肉桂皮与水或水溶液接触能够获得(或由此来获得)。在一些实施方式中，所述分子量为IOkDa50kDa。在一些其他实施方式中，所述分子量为25kDa50kDa。在又一些其他实施方式中，所述分子量为>25kDa。在一些另外的实施方式中，所述提取物在280nm处的吸光度为150.D每mg/ml·cm200.D每mg/ml·cm。可通过浸没、浸渍、与水流或蒸汽接触、通过在任意温度通常于室温(环境温度，22°C27°C)洗涤、在水中离心、搅拌或温育来使肉桂皮与水接触。所述水可以是自来水、脱气水、去离子水、去矿物水、蒸馏水或二次蒸馏水或任何净化度的净化水。作为另一种选择，研磨的肉桂皮可以与包含至少一种盐或水溶性无机化合物形式的可溶性物质的“水性溶液”或缓冲溶液接触。该水性溶液基本不含可溶性有机溶剂，所述可溶性有机溶剂在与肉桂皮接触之前与水预先混合(均质地或异质地)或在之后添加，以促进物质的提取。在某些实施方式中，不含有机溶剂的提取方法包括将肉桂皮研磨成粉末并将其拌入水性缓冲液中，以获得例如通过加入氯化物盐等可溶性盐而使该提取物从其中沉淀出的溶液。水性缓冲液通常是PH为7的缓冲液。可用在所述提取方法中的缓冲液的非限制性实例是磷酸盐缓冲液，其制备过程在本领域中已知。在另外的实施方式中，所述方法还包括例如通过离心、透析或任何其他已知的分离方法来分离包含活性级分的上清液。例如，通过将盐导入该上清液中可由此沉淀出提取物。为进行提纯，所述沉淀物可进而溶解在水中或缓冲液中，并通过例如色谱分离进行提纯。在一些实施方式中，通过将沉淀物溶解在诸如水或缓冲液等水性介质中，然后对溶液进行色谱分离(chromatographing)来进行所述提纯，以获得纯化的提取物。在一些其他实施方式中，提纯过程可包括a)使提取物沉淀物溶解在基本为中性pH的水中或缓冲液中；b)例如通过色谱分离在例如琼脂糖凝胶或kphadex柱上对含有溶解沉淀物的溶液成分进行分离；和c)用水或合适的缓冲液和不同浓度的糖，如半乳糖来洗脱所述溶液，以获得所需的提取物。应当注意，表现出以上特性和治疗淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的能力的肉桂提取物的活性级分是通过与水接触获得的。出于提纯目的，可能需要对由此获得的级分进行进一步处理，该处理不以任何方式对提取物的生物活性产生不利影响。因此，肉桂粗制提取物(在所讨论的提纯之前)和纯化提取物可同样且等效地应用于本发明的方法中。如各实例将进一步证明的，用于制造在治疗一种或多种淀粉样变性相关疾病或紊乱中应用的提取物的提取方法不含有机溶剂。所述肉桂提取物因而称为水性提取物。换言之，该方法的任何步骤均不涉及使用有机溶剂。这可由以下的非限制性实例加以例证，根据该实例，来自肉桂皮的提取物可如下获得a)将肉桂皮研磨成粉末；b)将所述肉桂皮搅拌入例如浓度为0.OlM或0.02M的pH为7.0的水性磷酸盐缓冲液中；c)例如通过离心分离上清液；d)例如，通过加入KCl或MgCl2等氯化物盐，如浓度为0.15M0.3M的KCl或0.08M0.12M的MgCl2，来从上清液中沉淀出活性成分；e)将所述沉淀物溶解在水或诸如0.OlM的pH为7.0的磷酸盐缓冲液等水性缓冲液中；f)将所述溶液装载到琼脂糖凝胶4B柱中，接着用水性缓冲液如磷酸盐缓冲液和水或多种浓度的半乳糖进行分阶洗脱；和g)例如用0.15M0.3M的半乳糖从柱中洗脱出活性级分。应当理解，通过采用各种其他的试剂浓度和通过采用等效试剂可以改变以上方法，条件是该方法并不背离以上给出的公开内容。另外，应当注意，提纯步骤e)g)是可选的，步骤d)中得到的提取物可用于本发明。在本发明的另一方面中，提供了本文公开的肉桂皮提取物用于治疗至少一种淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的应用。在本发明的又一方面中，提供了一种包含本文公开的提取物从而用于治疗淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的药物组合物。本发明的药物组合物包含所述提取物作为活性成分。所述药物组合物还可包含药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述物质可为液体、固体或半固体状态。尽管所述药物组合物通常有助于活性成分对有机体的施用，但本文所披露的治疗可通过单独施用作为无载体制剂的提取物而进行。无论是通过使用预先制得的制剂还是作为无载体的制剂，活性成分都可以根据本领域已知的多种施用技术中的任何一种进行施用，所述施用技术包括但不限于口服施用、鼻内施用、注射施用、喷雾施用、胃肠外施用和局部施用。载体的选择将通过以下方式确定部分由活性成分的特定形式确定，还由用来施用组合物的特定方法确定。因此，存在多种适用于本发明的药物组合物的制剂。以下制剂仅是示例性的而非限制性的。适合于口服施用的制剂由以下制剂构成(a)液体溶液，例如，溶解在水、盐水或橙汁等稀释剂中的有效量的提取物；(b)胶囊、小袋、片剂、锭剂或糖锭，各制剂均包含预定量的固体或颗粒状的活性成分；(c)粉末；(d)适宜的液体中的悬浮液；和(e)合适的乳剂。液体制剂可包含稀释剂如水和乙醇、苄醇和聚乙烯醇等醇，并可加入或不加入药学可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。胶囊形式可以为常见的包含例如表面活性剂、润滑剂和诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉等惰性填料的硬壳或软壳明胶型。片剂形式可包括乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他的赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂以及药理学相容性载体中的一种或多种。锭剂形式可在不同的香料，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中包含活性成分，以及软锭剂在惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶、乳剂、凝胶等)中包含活性成分，并且所述基质除了所述活性成分之外还包含本领域中已知的那些载体。适于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射液，其可包含能够使得该制剂与预定接收者的血液进行等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。化合物可在药学载体中的生理学可接受的稀释剂中施用，所述载体例如无菌的液体或液体混合物，包括水、盐水、水性葡萄糖和相关的糖溶液，如乙醇、异丙醇或十六烷基醇等醇，如丙二醇或聚乙二醇等二醇，如2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇等甘油缩酮，如聚(乙二醇)400等醚，加入或不加入药学可接受的表面活性剂的油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化的脂肪酸甘油酯(如肥皂或洗涤剂)，悬浮剂例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素或羧基甲基纤维素，或乳化剂和其他药用辅料。可用于胃肠外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、石油和矿物油。用于胃肠外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。合适的脂肪酸酯的实例是油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。用于胃肠外制剂的适宜的肥皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，适宜的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，如二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶鐺盐，(b)阴离子洗涤剂，如烷基、芳基和烯基的磺酸盐，烷基、烯基、醚和甘油单酯的硫酸盐，以及磺基琥珀酸盐，(c)非离子洗涤剂，如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯-聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)以上物质的混合物。该制剂中可使用适宜的防腐剂和缓冲剂。为减小或消除注射位点处的刺激，此类组合物可包含一种或多种亲水亲油平衡(HLB)为约12约17的非离子表面活性剂。适宜的表面活性剂包括聚乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，例如山梨聚糖单油酸酯和氧化乙烯与疏水基质(通过氧化丙烯与丙二醇的缩合而形成)的大分子量加合物。胃肠外制剂可保存在单剂量或多剂量的如安瓿和小瓶等密封容器中，而且可以存储在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在即将使用前加入无菌的液体载体(如水)即可用于注射。对注射性组合物而言有效的药物载体的要求是本领域的普通技术人员公知的，参JALPharmaceuticsandPharmacyPractice,J.B.LippincottCo.，Philadelphia,Pa.，Banker禾口Chalmers，eds.，第238250页(1982)禾口ASHPHandbookonInjectableDrugs,Toissel，第四版，第622630页(1986)。本发明使用的提取物和包含所述提取物的药物组合物旨在治疗至少一种淀粉样变性相关疾病或紊乱。本文中使用的术语“治疗”是指施用治疗学有效量的提取物或包含该提取物的组合物，其对于下列情况是有效的改善与淀粉样蛋白相关疾病或紊乱有关的有害症状、在症状出现前防止其表现、减缓疾病或紊乱的发展、减缓症状的恶化、增加缓解期的发生、减缓疾病或紊乱的慢性进展阶段中引起的不可逆损伤、延迟所述进展阶段的开始、减轻严重程度或治愈疾病或紊乱、提高生存率或更快速的恢复、或防止疾病或紊乱的发生，或者上述两种以上情况的组合。术语“有效量”或其任何语言变体一般是指单独的或制剂形式的提取物的治疗量或预防量，其在施用给受试对象(人类或非人类)时足以减少、防止、延迟和/或抑制淀粉样变性相关疾病或紊乱的发作或发展或恶化；足以减少、缓解和/或减轻一种或多种与所述疾病或紊乱相关的有害症状或病症的严重性、发作频率、持续时间、敏感性或可能性和/或加快由一种或多种与所述疾病或紊乱相关的症状中的恢复。所述有效量通常由本领域中已知的方法确定。旨在治疗的受试对象可以是人类受试对象或非人类受试对象。有需要的受试对象已经患有淀粉样变性相关疾病或紊乱，因此，提供所述治疗以治愈疾病、改善所述疾病的至少一种相关症状、减少所述疾病的至少一个有害的副作用或缩短疾病的持续时间。所述受试对象还可以是以预防方式进行治疗的个体，从而避免疾病或紊乱的发作。本发明的“淀粉样蛋白相关疾病或病症”是在其病因和/或发展中涉及β-淀粉样蛋白衍生的肽的积聚(特别是在大脑中)的任何疾病。一些非限制性实例包括阿耳茨海默氏病、淀粉样变性、甲状腺髓样癌、酵母朊病毒、散发性包涵体肌炎(S-IBM)、嗜铬细胞瘤、骨髓炎、类风湿性关节炎和肺结核，不包括糖尿病。在一些实施方式中，所述至少一种淀粉样蛋白相关疾病是阿耳茨海默氏病。通常，阿耳茨海默氏病的病程分为四个阶段(痴呆前兆、早期痴呆、中度痴呆和重度痴呆)，在每个阶段表达出不同模式的认知与功能障碍。在最终确诊前该疾病可能已发展多年。在其早期阶段，最常见的症状是记忆缺失，表现为难以记住最近获悉的事情。稍后的症状包括精神错乱、易怒、情绪不稳、语言衰退、长期记忆缺失以及患者随他/她的感知减退的总体退化(generalwithdrawal)0患者逐渐丧失了次要的和主要的身体机能，导致死亡。因此，有需要的受试对象可以是任何年龄并处于如上所述的任何阶段的阿耳茨海默氏病，或者处于仅仅表现出早期疾病症状如难以记住最近获悉的事情、精神错乱和其他症状的早期诊断阶段。因此，在本发明的某些实施方式中，所述提取物或含有该提取物的药物组合物用于预防。本发明也提供了所述提取物或含有所述提取物的药物组合物用于抑制原纤维聚集和/或用于保护细胞(在一些实施方式中是PC12和/或CHO细胞)免受由淀粉样蛋白原纤维诱发的破坏活性的应用。本发明进而还涉及用于治疗有需要的受试对象的至少一种淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的方法，所述方法包括对所述受试对象施用所述提取物或含有所述提取物的组合物。在一些实施方式中，所述至少一种淀粉样变性相关疾病或紊乱是阿耳茨海默氏病。所述治疗可以单独采用本发明的组合物，或者与任何类型的现有疗法一起作为组合疗法。现有疗法可用于控制与所述疾病有关的神经性紊乱或行为症状等。组合疗法可同时施用或在疾病的不同阶段施用，这取决于受试对象的病症以及开业医师所要考虑的其他参数。本发明也提供一种用于抑制原纤维聚集(组装)和/或用于诱发解聚(分解)的方法，所述方法包括对有需要的受试对象施用所述提取物或含有所述提取物的组合物。还提供一种在体内或体外保护细胞免受由淀粉样蛋白原纤维诱发的破坏活性的方法，所述方法包括使所述细胞在体内或体外接触有效量的所述提取物或含有所述提取物的组合物。本发明还提供一种用于抑制原纤维形成的方法，所述方法包括对有需要的受试对象施用所述提取物或含有所述提取物的组合物。本发明在其另一方面中还提供一种包含本发明的提取物和使用说明书的试剂盒或商业包装体。所述试剂盒或商业包装体还可以包括其他的要素和/或部件(例如，小瓶、递送单元等)。应当理解，为了清楚起见，在分开的实施方式中描述的本发明的某些特征也可以组合在单一的实施方式中提供。相反，为简洁起见，在单一的实施方式中描述的本发明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供或适当地提供在本发明的任何其他描述的实施方式中。在各种实施方式中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必要特征，除非没有那些要素该实施方式不能操作。如以上所描述的并如以下的权利要求部分所要求保护的本发明的多个实施方式和方面将在下列实施例中得到实验支持。为了理解本发明，并揭示本发明实际上是如何得以实施，现在通过参照附图并仅以非限定性实施例的方式对一些优选实施方式进行描述。附图中，本文中所描述的并根据本发明应用的提取物称为“CEppt”。图中图1示出了肉桂提取物的光学密度曲线。图2A2F图示了多种量的提取物对原纤维聚集的抑制(EM观测)。图2A只有β-淀粉样蛋白；图2Ββ-淀粉样蛋白和1μg提取物；图2Cβ-淀粉样蛋白和10μg提取物；图2Dβ-淀粉样蛋白和100μg提取物；图2Eβ-淀粉样蛋白和Img提取物；图2F只有Img提取物。图3Α;3Β以不同的表示方法示出了多种量的提取物对原纤维聚集的抑制(ThT荧光)。图4A4C显示了保护PC12(图4A)和CHO(图4B)细胞以免受淀粉样蛋白原纤维的影响。图4C显示了肉桂提取物对PC12细胞没有毒性。图5显示了肉桂提取物对形成淀粉样蛋白的有毒物种的抑制能力。图6Α6Ε显示了肉桂提取物对聚集后的原纤维的分解。图6Α是ThT检测结果的图示；图6Β6Ε显示了在用提取物处理后时间等于0小时、24小时和72小时的原纤维聚集。图7Α7Β显示了蝇分析。图7Α运动行为攀爬，和图7Β寿命。图8显示了肉桂提取物对小鼠中的阿耳茨海默氏病模型的作用。图9Α9C显示了小鼠大脑分析。图9Α示出了有毒的寡聚物56*(56KD)和5IKD带的蛋白质印迹的相对强度；图9B9C图示了脑勻浆的凝胶电泳(SDSpage凝胶)分析结果。图IOAIOH显示了多种量的肉桂提取物对α-syn原纤维聚集的抑制；图IOA呈现了ThT检测的结果；图IOB呈现了波长为405nm时浊度检测的结果；图IOCIOH是在多种提取物比例下的α-syn原纤维聚集的透射电子显微镜图像。具体实施例方式下面提供非限制性的公开内容，其例举了用于由肉桂皮制造活性级分的某些技术并给出了结果，该结果显示了所述活性级分用于治疗和预防一种或多种如以上所公开的疾病和紊乱的应用。正如本文中使用的，所述活性级分在本文中称为提取物。一般方法A.提取物的制备采用以下三个步骤分离所述提取物a)在市场上购买肉桂皮，并将其研磨成粉末，然后使其在0.OlM0.02M的水性磷酸盐缓冲液(PH7.0)中搅拌过夜。通过离心分离出上清液，并将该上清液用作粗制中和提取物；b)采用0.15M0.3MKCl或0.08M0.12MMgCl2来使所述粗制提取物中的活性物质沉淀，并将该沉淀物溶解于水或0.OlM0.02M的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中；c)将提取物沉淀的溶液可选地装入琼脂糖凝胶4B柱中，并如下详述进行洗脱。B.活性级分的洗脱用0.08M0.12MMgCl2或0.15M0.3MKCl来使60ml的粗制提取物沉淀。将沉淀溶解在水或0.OlM0.02M的磷酸盐缓冲液中，然后装入到预先用0.OlM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗过的琼脂糖凝胶4B的IOml柱上。装入后，将该柱先后用缓冲液和水洗涤，或者用0.15M、0.3M的半乳糖和多种浓度的乙腈进行分阶洗脱。发现提取物位于用水或0.15M的半乳糖从柱中洗脱出的级分b中。图1中显示了活性提取物的光学密度。所述活性提取物在280nm处的吸光度为100.D每mg/ml·cm200.D每mg/ml·cm。C.β-淀粉样蛋白的制备将合成的冻干β-淀粉样蛋白(1-40)(Bachem，Bubendorf，Switzerland)溶解在二甲基亚砜(DMSO)中至浓度为ΙΟΟμΜ，并进行1分钟的超声处理以避免预聚集。通过用IOmM的磷酸盐缓冲盐水(IOOmMNaCl,0.5mMEDTA，pH7.4)立即稀释至最终浓度10μM(包含10%的DMS0)而制备β-淀粉样蛋白溶液，并纳入多种浓度(1μg/mllmg/ml)的肉桂级分提取物。将肉桂溶解在DMSO中至浓度为10mg/ml，然后用IOmMPBS缓冲液(IOOmMNaCl,0.5mMEDTA,pH7.4)稀释至lmg/ml、100μg/ml、10μg/ml禾Π1μg/ml的最终溶液。β-淀粉样蛋白的最终浓度为5μΜ。在随后的9天内通过如下文所述的硫代黄素T(ThT)结合荧光和TEM(透射电子显微镜)来测定聚集。为了分解原纤维，将淀粉样蛋白如上所述的溶解并稀释，然后在几个小瓶中单独老化。在不同时间点O小时、24小时和72小时将最终浓度为ΙΟΟμg/ml的提取物添加至样品中。D.α-突触核蛋白的制备α-syn的表达和提纯所述蛋白在Pt7_7BL21细菌中表达，并使用如Voiles和Lansbury(Relationshipsbetweenthesequenceofalpha-synucleinanditsmembraneaffinity,fibrillizationpropensity,andyeasttoxicity,J.Mol.Biol.2007,366(5)1510-22)所描述的非色谱法进行提纯。在37°C以850rpm震动时对100μM的α-syn进行温育若干天，以使在存在提取物或不存在提取物时能够生成淀粉样蛋白原纤维。E.硫代黄素T结合荧光在25°C对如上制备的β-淀粉样蛋白进行温育，在37°C以850rpm震动时对如上制备的α-syn样品进行温育。采用ThT荧光检测(于450nm激发，狭缝为2.5nm,于480nm发射，狭缝为5nm)追踪原纤维形成速率。将ThT加入到10倍稀释的样品中，并使用JobinYvonHoribaFluoromax3荧光计进行测定。F.透射电子显微镜法将来自不同ThT荧光检测的样品(10μ1)放在被覆有碳稳定的孚尔瓦(Formvar)膜(SPISupplies,WestChester,PA)的400目的铜载网上。1.5分钟后，除去过量的流体，用10μ12%乙酸铀酰溶液对所述铜载网负染1.5分钟。最后，除去过量流体，并在SOkV时运行的JEOL1200ΕΧ电子显微镜下观察样品。G.细胞的细胞毒性检测PC12嗜铬细胞瘤的细胞系常规生长在添加有8%胎牛血清、8%马血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺的达氏修正依氏培养基(DMEM)中。CHO细胞系常规生长在添加有10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和2mML_谷氨酰胺的DMEM中。细胞保持在37°C下包含5%CO2的湿润环境中。通过胰蛋白酶消化来获得亚融合细胞，对其进行计数并在细胞培养基中稀释至20XIO4细胞/ml30XIO4细胞/ml，然后在96孔板(100μ1/孔)中培养并在37°C温育过夜。为了排除血清的影响，这些孔先用无血清的DMEM洗涤一次，然后再加入100μ1的DMEM(添加有100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺)和20μ1的用或不用抑制剂(如上所述)预先温育的5μMβ-淀粉样蛋白(1-40)。各处理重复四次。在37°C温育M小时后，使用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)检测根据参考文献[12]来评估细胞存活率(cellviability)。简而言之，在各孔中加入25μ1的溶解有5mg/mlMTT的PBS。在37°C温育4小时后，将100ml的提取缓冲液(20%SDS溶解在50%二甲基甲酰胺和50%DDW溶液，pH4.7)添加至各孔中，并使板在37°C再次温育整夜。最后，使用ELISAReader在570nm测定颜色强度。将细胞存活率(％)计算为[存在β-淀粉样蛋白(1-40)和抑制剂下的O.D.(570nm)*100]/[仅加入抑制剂时的0.D.(570nm)]的比例。H.蝇(果蝇)模型蝇维持使果蝇(Drosophilamelanogasterflies)在标准玉米粉糖蜜(corneal-molasses)培养基上生长，并保持在25°C。由于雌性果蝇在其体内存储精子细胞，因而采用在25°C下羽化后不超过8小时或18°C下羽化后不超过18小时收集的处女蝇(virginfemale)进行交配。在25°C开始羽化后的至多9天内收集交配得到的成虫后代(Fl)以避免收集来自下一代(F2)的后代。蝇交配携带驱动子(driVer)Gal4-elaVC155(在其X染色体上)的雄蝇与携带Aβ^2转基因(位于常染色体上)的雌蝇在UAS启动子下于纯合条件下进行交配(Crowther，D.C.等，IntraneuronalAβ,non-amyloidaggregatesandneurodegenerationinadrosophilamodelofAlzheimer'sdisease，Neuroscience132，123135，2005)。这样得到了在其神经系统中表达々^_42的第一代(Fl)雌性后代，其用作阿耳茨海默氏病的果蝇模型。携带Aβi_42转基因但并不表达该基因(因为它们缺乏驱动子)的雄性Fl后代用作对照。特殊蝇喂养将提取物溶解在水中至浓度为0.75mg/ml，然后在蒸煮约10分钟后添加到标准玉米粉糖蜜培养基中。提取物充分混入培养基中，并等分装入饲养小瓶中。小瓶在使用前一直保持在4°C。在常规果蝇培养基上进行交配或在添加有所述提取物的培养基上进行交配。该蝇从幼虫期开始一直在适宜的培养基上喂养。使用的果蝇种1.y[l]f[l]XXelav-Gal4/Y(由BloomingtonStockcenter获得)。插入片段在X染色体上。2.w；Alz[1-42.UAS]3；β-淀粉样蛋白(1-42)肽的一个拷贝(copy)。携带驱动子elaVC155-Gal4(在其X染色体上)的雄蝇与携带AβH2转基因(位于常染色体上)的雌蝇在UAS启动子下于纯合条件下进行交配。由此得到了在其神经系统中表达Ai^h42W第一代(Fl)雌性后代。它们用作阿耳茨海默氏病的果蝇模型。运动(攀爬)检测使各自包括10只给定类别(以下提及的四种类别)的蝇的新鲜饲养小瓶在桌上轻磕，然后使其静置18秒。随后计算随时间攀爬至测试管顶部的蝇的百分比。寿命检测将在具有和不具有所述提取物的培养基上于^TC饲喂的表达Αβi_42—个拷贝的蝇分成四类1.在常规培养基上表达Αβi_42的雌性。2.在具有所述提取物的培养基上表达Aβi_42的雌性。3.在常规培养基上的雄性对照(缺乏驱动子)。4.在添加有所述提取物的培养基上的雄性对照(缺乏驱动子)。对于每种类别，收集6个各自包括10只蝇的塑料小瓶，并每三天供给一次新鲜食物(无论是否具有所述提取物)。羽化后每天记录具有和不具有所述提取物的存活的转基因和对照蝇的数目。使用SPSS11Kaplan-Meir软件包分析存活率的差异。I.小鼠动物模型使用了最近开发的患有阿耳茨海默氏病(AD)转基因小鼠，其共表达由神经特异性Thyl启动子所驱动的全部五种家族性AD(FAD)变异[13]。与具有较少FAD变异的AD小鼠相比，这些“5XFAD”小鼠在更小的龄期就表现出显著加速的AD症状。对两月龄的5XFAD小鼠供给正常水或包含100μg/ml所述提取物的饮用水。每周交换两次水，以4个月为一个周期。在6月龄时，对hfaD小鼠和未经处理的野生型非转基因同窝对照小鼠进行标准认知测试，也就是物体识别。简言之，将小鼠放在装置中并使其寻找物体。M小时后，使小鼠返回现包括熟悉物体和新物体的装置中。通过与新物体交互所花费的更多时间来区分物体识别[14]。SDS凝胶分析在试验的最后，将动物杀死，并用生理(0.9%)盐水对其进行心脏灌注。每个处理组的动物的一个大脑半球用来评估AβH0和AβH2寡聚物。简言之，使冷冻的半球在包含蛋白酶抑制剂混合物的PBS缓冲液中进行均质化。离心后，将上清液等分并保持在-20°C。使用12%SDSpage凝胶评估勻浆的56Kd和51Kd可溶级分。使用密度测定法对谱带强度进行定量。MM实施例1通过用如本文中公开的所获得的提取物中和禽流感H9N2来测定提取物的分子量在搅拌下使IOg肉桂粉(越南肉桂1696)的样品在200ml的0.02M、pH7的磷酸盐缓冲液(PB)中提取过夜。对浆液进行离心，上清液(各样品中为168ml)在具有IKD50KD的不同截止值(cut-off)的五个不同袋中对水透析4天。将袋外透析出的物质经气流浓缩至袋内样品的原有体积的一半。从各袋内和袋外的流体(袋外的是两倍)获取用于溶血检测的等分样。结果汇总于表1中。表1提取物分子量的测定权利要求1.肉桂皮提取物在制备用于治疗或预防淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的药物组合物中的应用，所述提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。2.如权利要求1所述的应用，其中，所述淀粉样蛋白相关疾病或紊乱选自阿耳茨海默氏病、淀粉样变性、甲状腺髓样癌、酵母朊病毒、散发性包涵体肌炎(S-IBM)、嗜铬细胞瘤、骨髓炎、类风湿性关节炎和肺结核。3.如权利要求2所述的应用，其中，所述至少一种淀粉样蛋白相关疾病或紊乱是阿耳茨海默氏病。4.肉桂皮提取物在制备用于抑制和/或分解淀粉样蛋白原纤维聚集的药物组合物中的应用，所述提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。5.肉桂皮提取物在制备用于保护细胞免受由淀粉样蛋白原纤维诱发的破坏活性的药物组合物中的应用，所述提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。6.如权利要求15中任一项所述的应用，其中，所述提取物的分子量为IOkDa50kDao7.如权利要求6所述的应用，其中，所述分子量为25kDa50kDa。8.如权利要求17中任一项所述的应用，其中，所述不含有机溶剂的提取方法包括将所述肉桂皮研磨成粉末并将其搅拌入水性缓冲液中以获得溶液，从所述溶液中沉淀出所述提取物。9.如权利要求8所述的应用，其中，通过加入氯化物盐而获得所述沉淀。10.如权利要求9所述的应用，其中，所述氯化物盐选自KCl、NaCl、MgCl2、SrCl2、CuCl2和SiCl2。11.如权利要求10所述的应用，其中，所述氯化物盐是KCl或MgCl2。12.如权利要求111中任一项所述的应用，其中，所述方法还包括从所述溶液中分离出上清液，随后导入盐以获得作为沉淀物的所述提取物。13.如权利要求12所述的应用，其中，将所述沉淀物进一步提纯。14.如权利要求13所述的应用，其中，所述提纯包括将沉淀出的所述提取物溶解在水性介质中并进行色谱分离。15.如权利要求14所述的应用，其中，所述提纯包括a)使得到的沉淀物溶解在基本为中性pH的水中或缓冲液中；b)在琼脂糖凝胶或kphadex柱上对所述水或缓冲溶液进行分离；和c)用水或合适的缓冲液和不同浓度的糖，优选为半乳糖来洗脱所述溶液，以获得所需的提取物。16.一种包含肉桂皮提取物的药物组合物，所述药物组合物用于治疗淀粉样蛋白相关疾病或病症，所述提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水性缓冲液接触以由此获得所述提取物。17.如权利要求16所述的组合物，其中，所述淀粉样蛋白相关疾病或病症选自阿耳茨海默氏病、淀粉样变性、甲状腺髓样癌、酵母朊病毒、散发性包涵体肌炎(S-IBM)、嗜铬细胞瘤、骨髓炎、类风湿性关节炎和肺结核。18.如权利要求17所述的组合物，其中，所述至少一种淀粉样蛋白相关疾病或病症是阿耳茨海默氏病。19.一种包含肉桂皮提取物的药物组合物，所述药物组合物用于抑制和/或分解淀粉样蛋白原纤维聚集，所述提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。20.一种包含肉桂皮提取物的药物组合物，所述药物组合物用于保护细胞免受由淀粉样蛋白原纤维诱发的破坏活性，所述提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。21.如权利要求1620中任一项所述的组合物，其中，所述提取物的分子量为IOkDa50kDa。22.如权利要求21所述的组合物，其中，所述分子量为25kDa50kDa。23.一种用于治疗患者的淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的方法，所述方法包括对所述患者施用有效量的肉桂皮提取物，所述提取物的特征在于以下的一个或多个方面a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。24.如权利要求23所述的方法，其中，所述至少一种淀粉样蛋白相关疾病或紊乱选自阿耳茨海默氏病、淀粉样变性、甲状腺髓样癌、酵母朊病毒、散发性包涵体肌炎(S-IBM)、嗜铬细胞瘤、骨髓炎、类风湿性关节炎和肺结核。25.如权利要求M所述的方法，其中，所述至少一种淀粉样蛋白相关疾病或症状是阿耳茨海默氏病。26.一种用于抑制和/或分解淀粉样蛋白原纤维聚集的方法，所述方法包括对有需要的患者施用肉桂皮提取物，所述肉桂皮提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。27.一种用于保护细胞免受由淀粉样蛋白原纤维诱发的破坏活性的方法，所述方法包括使所述细胞在体内或体外接触有效量的肉桂皮提取物，所述提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。28.如权利要求2327中任一项所述的方法，其中，所述提取物的分子量为IOkDa50kDao29.如权利要求28所述的方法，其中，所述分子量为25kDa50kDa。30.如权利要求23四中任一项所述的方法，其中，所述肉桂提取物与现有疗法同时施用。31.肉桂皮提取物在治疗淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的方法中的应用，所述提取物具有以下的一个或多个特征a)在280nm处的吸光度为100.D/mg·cm200.D/mg·cm,b)分子量大于或等于IOkDaJPc)由不含有机溶剂的提取方法能够获得(或来获得)，所述提取方法包括使研磨的肉桂皮与水或水溶液接触以由此获得所述提取物。全文摘要本申请公开了肉桂提取物在治疗诸如阿耳茨海默氏病等淀粉样蛋白相关疾病和紊乱中的应用。文档编号A61K129/00GK102186489SQ200980139503公开日2011年9月14日申请日期2009年10月11日优先权日2008年10月7日发明者迈克尔·奥瓦迪亚,埃胡德·加兹特,阿纳特·弗雷德曼-马姆申请人:特拉维夫大学拉玛特有限公司