专利名称：一种基于迷迭香酸的药物及其在治疗帕金森病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于迷迭香酸的药物及其在治疗帕金森病中的应用，尤其是涉及迷迭香酸-柠檬酸钠药物配方及其在治疗帕金森病中对多巴胺能神经元起神经保护作用的应用。属医药技术领域。
背景技术：
帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种最常见的神经退行性疾病，病理特征为脑内黑质区多巴胺能神经元的选择性死亡。我国PD的发病率在近20年内至少增长了20多倍，不仅会影响病人的生活质量，而且会给家庭和社会造成巨大的精神和经济负担。更为严重的是，至今尚无成熟有效的药物或方法能阻止或逆转PD病情的发展。因此人们一直致力于从分子、细胞和整体水平上，多层次、多角度研究PD的发病机理，以寻求有效的预防和治疗的药物。目前PD的治疗仍以药物治疗为主。左旋多巴，作为治疗PD的经典药物，长期应用后大部分患者会出现多动症、疗效波动和开关现象，不仅严重影响病人的生活，而且难以纠治。无论是从社会学角度还是从市场经济角度，PD已经成为影响世界乃至我国人口健康水平和生活质量、阻碍经济持续发展的重大社会问题。因此开发新型的能够防治PD及具有神经保护作用的药物将具有不可估量的社会和经济效益。
迷迭香酸(Rosmarinic acid)是一种水溶性的含多酚羟基的酸，其化学名称为R(t)2-[[3-(3，4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基]-3，4-二羟基苯丙酸。1958年首次从迷迭香植物(Rosmarinius officinalis)中分离提取而得名。迷迭香酸为天然抗氧化剂，有抗氧化、抗炎、免疫抑制等多种活性。目前已有多项相关专利用于抑制血糖水平升高，预防、控制或治疗糖尿病或肥胖症；制备治疗或预防冠心病、心绞痛、脑损伤；治疗或预防急慢性肾功能衰竭；升高白细胞及血小板等等。
柠檬酸钠(Sodium Citrate)，分子式为C6H5Na3O7，是一种常用的食品添加成分。作为一种重要的食品添加成分，安全无毒，稳定性好，在食品、饮料、医药方面已有着广阔的应用。迷迭香酸和柠檬酸钠的化学结构明确，结构式为
本发明人长期从事迷迭香酸的综合开发利用研究，大量的研究和试验结果表明，迷迭香酸-柠檬酸钠作为结构明确的天然活性水溶性物质，配比使用毒性低，副作用小，足以其作为药物开发的新靶点，其在PD中是否具有防治作用国内外未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，针对传统的抗PD药物普遍存在一些不良反应，严重地限制了其应用和推广等缺点，旨在提供一种基于迷迭香酸的药物及其在治疗帕金森病中的应用。发明人通过长期研究和大量试验发现，迷迭香酸-柠檬酸钠配比使用具有明显的神经保护作用，迷迭香酸在极低浓度(10-13mol/L)时即具有明显的神经保护作用，其发挥作用的浓度无任何毒副作用，故在治疗PD和神经保护方面有良好的应用前景。同时，迷迭香 酸-柠檬酸钠作为结构明确的天然活性水溶性物质，毒性低，具有良好的抗凋亡、抗氧化及神经保护作用，有着巨大的新药开发前景和实际应用价值。
为了实现上述发明目的，本发明的一种基于迷迭香酸的药物的配方是迷迭香酸与柠檬酸钠的摩尔浓度比为1∶104～1∶1011。
本发明的一种基于迷迭香酸的药物在治疗帕金森病中的应用，其特征在于迷迭香酸-柠檬酸钠配制的药物用于神经保护，其机制与抗氧化和抗凋亡有关 1、10-6～10-13mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配制的药物，可以明显减轻神经毒素6-OHDA诱导的MES23.5多巴胺能细胞存活率的下降； 2、10-6～10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配制的药物，可以明显减轻神经毒素MPP+诱导的MES23.5多巴胺能细胞存活率的下降； 3、10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配制的药物，可以明显减轻神经毒素MPP+诱导的细胞线粒体膜电位的下降和活性氧物质的生成，具有抗氧化作用； 4、10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配制的药物，可以明显改善神经毒素MPP+诱导的细胞核形态学的改变，具有抗凋亡作用。
本发明在体外实验中证实迷迭香酸-柠檬酸钠配比使用能够保护MES23.5多巴胺能细胞免受神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)和1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)的损伤，其保护作用与抗氧化及抗凋亡有关。迷迭香酸-柠檬酸钠在体外的细胞毒性实验，证实其发挥保护作用的浓度不具毒性。本发明对于开发成为一种新型的国家I类抗PD天然新药具有重要的应用前景和实际价值。
具体实施例方式 下面通过具体实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1本发明的迷迭香酸-柠檬酸钠药物在MES23.5多巴胺能细胞上发挥神经保护作用实验 一、实验材料 (一)细胞 MES23.5多巴胺能细胞由美国休斯敦贝勒医学院乐卫东教授惠赠。将其置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(二)药品及试剂 迷迭香酸由青岛大学医学院生物学教研室李荣贵教授提供，将其以培养液溶解后以10-3mol/L储存。实验时用培养液稀释为所需浓度10-6～10-13mol/L。柠檬酸钠为国药集团化学试剂有限公司产品，实验时以培养液稀释为所需浓度10-2mol/L。二甲亚砜(DMSO)，2，7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(H2DCF-DA)，6-OHDA，MPP+，罗丹明123，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)为Sigma公司产品。多聚甲醛为国药集团化学试剂有限公司产品。
(三)仪器 酶标仪R-T-2100C，深圳雷杜公司；超净工作台苏州净化设备工程有限公司；CO2培养箱美国热电公司；倒置生物光学显微镜重庆奥特光学仪器有限公司；流式细胞仪美国BD Biosciences公司。
二、实验方法 1、MTT测定细胞存活率取对数生长期的MES23.5多巴胺能细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×105个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。贴壁后加入不同浓度的迷迭香酸(0，10-13，10-12，10-11，10-10，10-9，10-8，10-7和10-6mol/L)和柠檬酸钠(10-2mol/L)预孵育12h后，分别与6-OHDA(100μmol/L)或MPP+(200μmol/L)培养24h。然后每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃培养箱中培养4h。弃上清后每孔加入DMSO 200μl，自动酶标读数仪比色(主波长573nm，次波长630nm)，测定其吸光度值，并计算各组MES23.5多巴胺能细胞的存活率。细胞存活率＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
2、细胞线粒体跨膜电位的检测细胞按上述处理后加入荧光染料罗丹明123(终浓度为5μmol/L)37℃避光负载30min；用N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液(20mmol/L HEPES，150mmol/L NaCl，pH＝7.4)洗3次后再用1ml重悬。以激发波长488nm，发射波长523nm测定，CELLQuest Pro分析系统分析每组细胞罗丹明123的荧光强度。
3、细胞内活性氧物质(ROS)检测细胞按上述处理后加入荧光染料H2DCF-DA(终浓度为5μmol/L)，37℃避光负载30min；用HEPES缓冲液洗3次后再用1ml重悬。以激发波长488nm，发射波长523nm测定，CELLQuest Pro分析系统分析每组细胞H2DCF-DA的荧光强度。
4、细胞核形态改变的检测细胞按上述处理后用4％的多聚甲醛固定细胞10min，磷酸盐缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 1.76mmol/L，pH＝7.4)洗3次，Hoechst染色液室温孵育30min后再用磷酸盐缓冲液洗3次，晾干，70％甘油封片，荧光显微镜照相，计数，每组细胞随机取10个视野，计数浓染和发生固缩细胞核，除以总的细胞核数，得到发生凋亡的细胞比率。
5、统计学处理实验结果采用SPSS软件进行处理，两组以上均数的比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行比较，继以Student-Newman-Keuls进行两两均数间的比较。
三、实验结果 (一)本发明的迷迭香酸-柠檬酸钠药物配方对神经毒素6-OHDA和MPP+处理的MES23.5多巴胺能细胞具有神经保护作用 MTT法显示当只加入6-OHDA时，细胞的存活率明显下降，而用不同浓度迷迭香酸(10-6-10-13mol/L)和柠檬酸钠(10-2mol/L)预孵育后，细胞的存活率均有上升，与6-OHDA单独作用组相比有统计学意义(表1)。同样地，只加入MPP+时，细胞的存活率明显下降，而用不同浓度(10-6-10-9mol/L)迷迭香酸和柠檬酸钠(10-2mol/L)预孵育后，细胞的存活率均有上升，与MPP+单独作用组相比有统计学意义(表2)。表明迷迭香酸和柠檬酸钠在体外配比使用可以对神经毒素损伤的MES23.5细胞有明显的保护作用。
表1迷迭香酸-柠檬酸钠配比使用减轻神经毒素6-OHDA诱导的细胞存活率的下降 Cell viability Control 1.000±0.000 6-OHDA0.608±0.051* RA(10-6mol/L)+Sodium Citrate+6-OHDA 0.770±0.049*# RA(10-7mol/L)+Sodium Citrate+6-OHDA 0.797±0.048*# RA(10-8mol/L)+Sodium Citrate+6-OHDA 0.799±0.029*# RA(10-9mol/L)+Sodium Citrate+6-OHDA 0.764±0.023*# RA(10-10mol/L)+Sodium Citrate+6-OHDA 0.771±0.029*# RA(10-11mol/L)+Sodium Citrate+6-OHDA 0.860±0.105*# RA(10-12mol/L)+Sodium Citrate+6-OHDA 0.810±0.042*# RA(10-13mol/L)+Sodium Citrate+6-OHDA 0.755±0.004*# *P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with 6-OHDA. 表2迷迭香酸-柠檬酸钠配比使用减轻神经毒素MPP+诱导的细胞存活率的下降 Cell viability Control 1.00±0.00 MPP+0.69±0.03* RA(10-6mol/L)+Sodium Citrate+MPP+0.78±0.06*# RA(10-7mol/L)+Sodium Citrate+MPP+0.81±0.03*# RA(10-8mol/L)+Sodium Citrate+MPP+0.85±0.04*# RA(10-9mol/L)+Sodium Citrate+MPP+0.84±0.02*# *P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with MPP+ (二)迷迭香酸-柠檬酸钠的抗氧化作用 1.细胞线粒体跨膜电位(ΔΨM)的检测 表3显示，MPP+处理细胞后，细胞内线粒体跨膜电位出现明显的下降，10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配比使用可以明显恢复线粒体跨膜电位，与MPP+单独作用组相比有统计学意义。
2.细胞内ROS的检测 表3显示，MPP+会造成细胞内活性氧物质的明显增加，10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配比使用可以明显降低细胞内活性氧物质水平，与MPP+单独作用组相比有统计学意义。
表3 迷迭香酸-柠檬酸钠配比使用对细胞线粒体跨膜电位和ROS的影响
*P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with MPP+ (三)迷迭香酸-柠檬酸钠的抗凋亡作用 正常细胞孵育Hoechst染色液后绝大多数细胞核呈蓝色均染，MPP+处理细胞后大量细胞出现核固缩，核碎裂，而10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配比使用可以明显逆转上述改变，与MPP+单独作用组相比有统计学意义，见表4。
表4 迷迭香酸-柠檬酸钠配比使用对细胞核形态的影响 Condensed nuclei(100％of total) Control 4.631±1.959 MPP+ 25.909±3.042* RA(10-9mol/L)+Sodium Citrate+MPP+ 10.74±2.05*# *P＜0.05，compared with the control；#P＜0.05，compared with MPP+ 实施例2迷迭香酸-柠檬酸钠的体外毒性实验 一、实验材料 (一)药品和试剂 乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。
(二)仪器 酶标仪R-T-2100C，深圳雷杜公司。
二、实验方法 取对数生长期的MES23.5多巴胺能细胞，吹打制成单细胞悬液后离心，用完全培养基稀释成2×105个细胞/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。细胞融合度达到70-80％后换用无血清培养基及药物处理。加入迷迭香酸浓度分别为10-13，10-12，10-11，10-10，10-9mol/L与10-2mol/L柠檬酸钠，孵育MES23.5多巴胺能细胞24h后，阴性对照组只用无血清培养基替换，每个浓度设6个复孔。培养结束后4h，取细胞外液20μl，加入96孔板中，空白孔为20μl HEPES缓冲液；加入基质缓冲液(购自南京建成生物工程研究所)50μl，辅酶I溶液10μl，37℃水浴15min；加入二硝基苯肼溶液50μl，37℃水浴15min；加入4mol/L的NaOH 50μl，混匀后室温静至3min。分光光度计440nm处测吸光度值。LDH的释放量＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
三、实验结果 如表5所示，结果显示迷迭香酸(10-6-10-9mol/L)和柠檬酸钠(10-2mol/L)配比使用处理细胞24h后，细胞存活率与对照组相比没有统计学意义。表明实验所用浓度的迷迭香酸和柠檬酸钠配比使用没有表现出细胞毒性作用。
表5迷迭香酸-柠檬酸钠配比使用对细胞存活率的影响
通过上述实验表明，迷迭香酸-柠檬酸钠配比使用(摩尔浓度配比为1∶104～1∶1011)能对MES23.5多巴胺能细胞发挥神经保护作用。本发明药物可以明显减轻神经毒素6-OHDA或MPP+诱导的MES23.5细胞存活率的下降；明显减轻神经毒素MPP+诱导的细胞线粒体膜电位的下降和活性氧物质的生成，明显改善神经毒素MPP+诱导的细胞核形态学的改变，具有神经保护、抗氧化及抗凋亡的作用。
权利要求
1.一种基于迷迭香酸的药物，其特征在于配方是迷迭香酸与柠檬酸钠的摩尔浓度比为1∶104～1∶1011。
2.一种基于迷迭香酸的药物在治疗帕金森病中的应用，其特征在于迷迭香酸-柠檬酸钠配制的药物用于神经保护，10-6～10-13mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配制的药物，减轻神经毒素6-羟基多巴胺诱导的MES23.5多巴胺能细胞存活率的下降；10-6～10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配制的药物，减轻神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶阳离子诱导的MES23.5多巴胺能细胞存活率的下降；10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配制的药物，减轻神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶阳离子诱导的细胞线粒体膜电位的下降和活性氧物质的生成，具有抗氧化作用；10-9mol/L迷迭香酸与10-2mol/L柠檬酸钠配制的药物，改善神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶阳离子诱导的细胞核形态学的改变，具有抗凋亡作用。
全文摘要
本发明涉及一种基于迷迭香酸的药物及其在治疗帕金森病中的应用。该药物的配方为迷迭香酸与柠檬酸钠的摩尔浓度比为1∶104～1∶1011。该药物能对MES23.5多巴胺能细胞发挥神经保护作用，可以明显减轻神经毒素6-羟基多巴胺或1-甲基-4-苯基吡啶阳离子诱导的MES23.5细胞存活率的下降；明显减轻神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶阳离子诱导的细胞线粒体膜电位的下降和活性氧物质的生成，明显改善神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶阳离子诱导的细胞核形态学的改变，具有神经保护、抗氧化及抗凋亡的作用。本发明药物毒性低，副作用小，对于开发成为一种新型的抗帕金森病天然药物具有重要应用前景和实际价值。
文档编号A61K31/216GK101773488SQ20101011214
公开日2010年7月14日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者谢俊霞, 姜宏, 李荣贵, 宋宁, 杜婷婷 申请人:青岛大学