专利名称：：穿龙薯蓣提取物及其在制备抗自由基、降血脂药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药提取物及其应用领域，尤其涉及穿龙薯蓣提取物及其在制备抗自由基、降血脂药物中的应用。
背景技术：
：传统中医药是祖国灿烂文化宝库中的瑰宝之一，为中华民族的繁荣昌盛做出了巨大贡献。中药是在中医理论指导下用以防病治病的天然物质，中医药学历经数千年的发展，经过历代医药学家的不断补充、完善，在长期的实践中形成了独特的理论体系。随着国内外对中药研究的不断深入，它以其确切的疗效和较低的毒性愈来愈受到人们的重视。随着中国加入WTO，中药发展面临着前所未有的机遇。为使中药在国际医药市场竞争中得到较大的发展，建立和完善中药系列标准规范，为中药现代化提供保障刻不容缓。随着社会的发展，人类疾病谱已悄然发生变化，医疗模式已由单纯的疾病治疗转变为预防、保健、治疗、康复相结合，各种替代医学和传统医学正发挥着越来越大的作用。心脑血管疾病被称为人类健康的"第一杀手"，据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年均有1500万人死于心脑血管疾病，近年的统计数据表明，我国人群心脑血管病逐年上升，总人数已大大高于美、加、法、日、瑞士等国。15岁以上人群高血压患病率约为14%，比30年前增加了一倍。全国每年因心脑血管病死亡的人数约260万，平均每小时死亡300人。常用的治疗冠心病、心绞痛的西药是硝酸酯类药物、P阻滞剂、钙拮抗剂及抗血小板聚集药物。以硝酸甘油为代表的硝酸酯类药物能直接扩张血管平滑肌，扩张周围血管，减少静脉回流到心脏的血流量，从而减轻心脏负担；同时也能扩张冠状动脉，直接改善缺血区心肌供血，致使心绞痛得以缓解。但是上述药物同时也有许多不良反应，例如头痛、面红、耳鸣、眩晕、血压下降、心跳过速等，长期使用会产生耐药性。中医药在治疗血栓性疾病方面具有独特优势，这一点已经被多年的临床试验和实验研究所证实。穿龙薯蓣(DioscoreanipponicaMak.)为薯蓣科薯蓣属植物，多年生缠绕草本。根茎横走，圆柱形，黄褐色。茎左旋，长达5米，近乎无毛。叶具长柄，互生，卵形或宽卵形，长512cm，通常57裂，基部心形。顶端裂片有长尖，叶脉9条，基出，支脉网状。花黄绿色，单性，雌雄异株；花序腋生，下垂；雄花序复穗状，雌花序穗状；雄花小，钟形，花被片6，雄蕊6，着生于花被筒上；雌花被6，矩圆形，柱头3裂，裂片再2裂。蒴果倒卵状椭圆形，具3翅。种子具长方形翅。花期68月，果期810月。药材为穿龙薯蓣的干燥根茎，又称穿山龙、串地龙、穿地龙、穿龙骨、地龙骨、野山药、狗山药、鸡骨头、山常山、常山、穿山骨、火藤根、粉萆蘚、黄姜、土山薯、竹根薯、铁根薯、雄姜、黄鞭、山花啦、金刚骨等。呈长圆柱形，长1020cm，直径约1.5cm，具多数不规则的分枝，表面土黄色，有多数细纵纹及突起的须根残基，全形略似鹿角。质坚硬，断面淡黄色，粉性，可见多数带细孔的维管束散在。气微，味苦。以根茎粗长，土黄色，质坚硬者为好。穿龙薯蓣常生于山野林下，喜生于山坡灌丛及疏林下或土层较厚的沟边石缝中，其分布范围广，适应性强，栽培繁殖较易，但目前仍处于野生状态，人工栽培还处在探索阶段。主要分布在内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、河北、河南、陕西、山西、甘肃、四川、贵州、湖北、湖南、山东、安徽、江苏、浙江和江西等地。穿龙薯蓣具有消炎、祛痰、平喘、增加冠脉流量、降低血脂、改善心血管功能及抗菌和抗病毒等药理活性，还可减慢心率，增强心肌收縮力，增加每日尿量，改善冠脉循环，降低动脉血压，尤其适用于轻度动脉硬化。
发明内容本发明一方面提供了一种穿龙薯蓣提取物，该提取物是将穿龙薯蓣药材经醇溶液提取后，用氯仿和正丁醇萃取得到的提取物，其中包括甾体化合物、植物甾醇及苯甲酸。醇溶液优选6070%乙醇溶液，更优选65%乙醇溶液。该提取物可进一步采用硅胶柱色谱、0DS中低压柱层析及半制备高效液相色谱分离纯化。提取物中的甾体化合物包括薯蓣皂苷元、薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷和延龄草苷。提取物中的植物甾醇为e_谷甾醇。本发明另一方面提供了穿龙薯蓣提取物在制备抗自由基、降血脂药物中的应用。本发明选择高血脂动物模型，以出血时间、凝血时间、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量、血清超氧化物歧化酶(S0D)和脂质过氧化(LP0)的活性为指标，对穿龙薯蓣提取物及其中包括的主要甾体化合物，即薯蓣皂苷元、薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷和延龄草苷的抗自由基、降血脂作用进行了研究。本发明提供的穿龙薯蓣65%乙醇提取物的氯仿和正丁醇萃取部分有较好的降脂、抗凝、抗自由基活性。进一步采用硅胶柱色谱、0DS中低压柱层析以及半制备高效液相色谱等多种分离纯化技术，分离得到的4个甾体化合物，薯蓣皂苷元(diosgenin)、、薯蓣皂苷(dioscin)、原薯蓣皂苷(protodioscin)和延龄草苷(trillin)均具有较好的降脂、抗凝、抗自由基活性，为穿龙薯蓣降血脂作用的有效成分。其中薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷效果较显图1是穿龙薯蓣的提取分离流程图。具体实施例方式下面结合附图及具体实施例详细介绍本发明，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。—、实验用材料1、仪器RE-52A旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂876-1型真空干燥箱上海锦旻科学仪器有限公司4ZF7B三用紫外分析仪Jcl8-1红外灯DILW型电子恒温水浴101-3-BS电热恒温鼓风干燥箱BP210S电子天平BeckmanDU640紫外分光光度计BT-224自动生化分析仪中低压柱层析仪离心机TGL-16C日本Yanaco显微熔点测定仪BrukerTensor37型红夕卜光谱仪BrukerAV-400型核磁共振仪岛津LC-8A型制备液相MicromassQimttro型二级质谱仪2、试剂与试药石油醚(6090。C，分析纯)乙酸乙酯(分析纯)无水乙醇(分析纯)氯仿(分析纯)浓硫酸(分析纯)硅胶(200300目)硅胶GF254(60目)ODS(40目)丙二醛(MDA)试剂盒硫代巴比妥酸(TBA比色)试上海康华生化仪器制造厂上海新华灯具厂北京永光明医疗仪器厂上海跃进医疗器械厂德国Satorius公司日本岛津公司意大利科学仪器公司日本岛津公司上海安亭仪器有限公司日本Yanaco公司瑞士Bruker公司瑞士Bruker公司日本岛津公司美国Waters公司天津市博迪化工有限公司天津大茂化学试剂厂广州化学试剂厂天津市博迪化工有限公司天津大茂化学试剂厂青岛海洋化工厂青岛海洋化工厂德国MERCK公司南京建成生物工程研究所南京建成生物工程研究所剂盒黄嘌呤氧化酶(羟胺法)试剂盒南京建成生物工程研究所丙硫氧嘧啶(批号050401)广州康和药业有限公司胆固醇(批号030814)地奥心血康胶囊(批号0507060)3、动物普通清洁级SD雄性大鼠，体重200士20g，广东省实验动物中心提供,合格证号SCXK(粤)2003-0002粤监证字2005A011北京化学试剂公司成都地奥制药集团有限公司二、提取物的制备如图1所示，为本发明穿龙薯蓣的提取分离流程图。取干燥的穿龙薯蓣药材5kg，经粉碎后过40目筛，加10倍量的65%乙醇，加热回流提取2次，每次2h，滤过，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得乙醇提取浸膏630g。加入2L水将浸膏混悬后，依次用氯仿、正丁醇等体积萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂后，得氯仿层浸膏(60g)，正丁醇层浸膏(160g)。取氯仿层浸膏10g，经硅胶(200-300目)柱(f5cmX38cm)，以石油醚-乙酸乙酯系统梯度(ioo:l;95:5;90:io;80:20;70:30)洗脱进行柱层析，得到20个馏份(Fr.l-Fr.20)。将Fr.5和Fr.8进行反复硅胶柱层析，以石油醚_乙酸乙酯梯度洗脱、分离纯化，分别得到薯蓣皂苷元(化合物1)禾PP_谷甾醇(化合物2)。取正丁醇部分浸膏10g，经硅胶(200-300目)柱(f5cmX38cm)，以氯仿-甲醇-水系统梯度(io:i;8:2:o.2;7:3:o.5;6:4:o.8)洗脱进行柱层析，得到30个馏份(Fr.1Fr.30)，将Fr.15和Fr.20用乙酸乙酯_甲醇(6:4)重结晶，分别得到薯蓣皂苷(化合物3)和苯甲酸(化合物4)，其他馏份经0DS开放柱层析，甲醇-水(6:4，7:3，8:2)梯度洗脱后，馏份经制备液相继续分离纯化，得到原薯蓣皂苷(化合物5)和延龄草苷(化合物6)。三、穿龙薯蓣提取物中主要化学成分的确认化合物1:薯蓣皂苷元(diosgenin)白色针状结晶(石油醚_乙酸乙酯)，C27H4203，Liebermann-Burchard反应呈阳性，与A试剂(Anisaldehyde，对甲基苯甲醛)反应显黄色，与E试剂(Ehrlish，对二甲基氨基苯甲醛)反应不显色，推测该化合物属于螺甾烷类化合物。IRKBr^cm—1:3452(-0H)、980、919、898、865(919<898cm—、25R螺甾烷的特征吸收);ESI-MSm/z:415[M+H]+，437[M+Na]+;"C-NMR谱图和^-NMR谱图数据与文献所报道的薯蓣皂苷元数据相符合。经与薯蓣皂苷元对照品进行三种溶剂系统共薄层，斑点颜色和Rf值完全一致，故化合物1鉴定为薯蓣皂苷元，结构如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物2:P-谷甾醇(P-sitosterol)白色针晶(氯仿)，C29H5。0，mp.137138°C。IRKBrMXcm-1:3426(OH)，2936、1464、1380(CH3)，1661(C=C);EI-MSm/z:414(M)，396(M_H20)，381(M_H20-CH3)。13C_NMRi普图禾口力-NMR谱图数据与文献所报道的P-谷甾醇数据相一致。经与P-谷甾醇对照品进行三种溶剂系统共薄层，Rf值完全一致，故化合物2鉴定为13-谷甾醇，其结构如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>化合物3:薯蓣皂苷(dioscin)白色针晶(乙酸乙酉旨_甲醇)，C45H72016，mp276278°C，Liebermann-Burchard和Molish反应呈阳性，与A试剂反应显黄色，与E试剂反应不显色，推测该化合物属于螺甾皂苷类化合物。酸水解产物与薯蓣皂苷元对照品进行三种溶剂系统共薄层，斑点颜色和Rf值完全一致，确定苷元为薯蓣皂苷元。Id!!-1:3411(-0H)、980、919、899、865(919<899cm—1，25R螺甾烷的特征吸收)；ESI_MSm/z:869[M+H]+，891[M+Na]+，723[M-Rha]+，与文献报道一致。"C-NMR数据和^-NMR数据与文献所报道的薯蓣皂苷数据相符合。经与薯蓣皂苷对照品进行三种溶剂系统共薄层，Rf值完全一致，故化合物3鉴定为薯蓣皂苷，结构如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>化合物4:苯甲酸(benzoicacid)白色针晶，C7H602，mp122124°C，与氯化铁反应呈阳性。IR^^cm1:3100-2600(OH)，1680(C=0)，1600、1580(C=C)与文献报道一致。ESI-MSm/z:121[M-H]—，77[M-H-C02]—。"C-NMR和^-NMR数据与文献所报道的苯甲酸数据相符合。经与苯甲酸对照品进行三种溶剂系统共薄层，Rf值完全一致，故化合物4鉴定为苯甲酸，其结构如下所示化合物5:原薯蓣皂苷(protodioscin)白色粉末，C51H84022，mp187189°C，Liebermann-Burchard和Molish反应呈阳性，香草醛反应显黄色。ESI-MSm/z:1031[M-H20]+，1071[M+Na]+，1087[M+K]+，869[M_Glc]+。13C-NMR和^-NMR数据与文献所报道的原薯蓣皂苷数据相符合。故化合物5鉴定为原薯蓣皂苷。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>化合物6:延龄草苷(trillin)无色针晶(氯仿_甲醇)，mp239242°C，Lieberma皿-Burchard禾口Molish反应呈阳性，与A试剂反应显黄色，与E试剂反应不显色，推测该化合物属于螺甾皂苷类化合物。IRrarmaxcm—1:3472(-0H)、980、915、899、865(915<899cm—、25R螺甾烷的特征吸收);ESI-MSm/z:577[M+H]+，271[M+H-C8H1502-C6Hu05]+，253[M+H-C8H1502-C6Hn05-H20]+。13C_NMR和'H—NMR数据与文献所报道的延龄草苷数据相符合。经与延龄草苷对照品进行三种溶剂系统共薄层，斑点颜色和Rf值完全一致，故化合物6鉴定为延龄草苷。四、穿龙薯蓣提取物的抗自由基、降血脂活性1、样品溶液的制备本发明对提取溶剂进行了系统考察。采用水、不同浓度的乙醇和水煎后不同浓度乙醇沉淀等方法制备穿龙薯蓣提取物，观察不同提取方法所制备的提取物对高脂大鼠血脂水平、血液粘滞度和机体自由基的影响，从而确定最佳提取溶剂。按表1依次制备下列各药液穿龙薯蓣水煎液取穿龙薯蓣药材粉末适量，加10倍水，煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，浓縮至1.5gmL—、备用。穿龙薯蓣醇提取液取穿龙薯蓣药材粉末适量，加10倍量的95%，65%，45%和15%乙醇液煎煮2次，每次2h，合并2次乙醇液，减压蒸去乙醇，残渣加适量水溶解，浓度同上，备用。穿龙薯蓣水煎醇沉液取穿龙薯蓣药材粉末适量，加10倍量水，煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，再加适量无水乙醇，使其含醇量达到95%，65%，45%和15%，冰箱静置18h取出，抽滤，取续滤液于旋转蒸发仪上蒸去乙醇，残渣加适量水溶解，浓度同上，备用。表1、穿龙薯蓣的提取方法<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、高血脂动物模型的建立(1)药理指标的选择选择以高脂饲料(含猪油、胆固醇3%、猪胆盐0.5%和甲基硫氧嘧啶0.2%)喂食动物造成大鼠高血脂模型，以出血时间、凝血时间、血脂水平和抗自由基活性为药理指标。(2)模型的建立方法在室温27t:，湿度60%的条件下，将动物饲养一周后，随机分为空白对照组、高血脂模型组、溶媒对照组(匿S0水溶液)、地奥心血康组(0.5mg甾体总皂苷/kg)、穿龙薯蓣不同溶剂提取物组19号药组(水煎液，95%、65%、45%、15%醇提液，95%、65%、45%、15%醇沉液)。除溶媒对照组8之外，其余各组每组10只动物。除空白对照组喂普通饲料外，其余各组均给予高脂饲料，连续饲养14天后，检查前一天禁食不禁饮8小时以上，每只动物均经眼球采血检测血脂，确认造模成功(给药前血脂水平，经过检验剔除血脂不升高的大鼠若干只)。随后继续给予高脂饮食。(3)给药方法及剂量高脂饲料饲养约第15天开始给药，实验19号药组分别经灌胃口服给药，灌胃量为相当于生药3g*kg—、每天一次，连续给药共四周28天，(末次给药后，禁食不禁饮8h)测大鼠出血时间、凝血时间。全部动物经眼眶采血，取血清，检测血脂(给药后血脂)和脂质过氧化物酶水平。[OO"](4)检测指标a、出血、凝血时间出血时间、凝血时间可检测血液的流动性及凝固性，测定方法出血时间用断尾法，凝血时间用毛细玻管法和玻片法，控制室温在27t:，湿度于60%左右。b、血脂抽血检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。c、抗自由基活性取空腹上肢静脉血，离心取血清，低温保存，检测血清S0D活性及LP0含量。S0D活性采用黄嘌呤氧化酶(羟胺法)法，LPO(丙二醛MDA)检测采用硫代巴比妥酸(TBA比色)法，利用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。[owe](5)结果判断采用计算机统计软件SPSSversion10.0进行方差分析F，q及t检验，P<0.05判为具有显著性差异。3、实验方法在室温27t:，湿度60X的条件下，SD大鼠连续给予高脂饲料饮食14天后，随机抽取每组30%的动物眼球后血管丛取血，检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)等血脂水平。结果，与空白对照组比较，高血脂模型成功率达到99%，证明造模型是成功的，剔除个别血脂水平偏低的动物后，进行降脂药物实验。(1)对大鼠出血时间、凝血时间的影响综合三种检验方法指标结果，并与高脂模型组和溶媒对照组比较，各受试药均可降低血液粘滞度，使出血时间延长(P<0.05)，但与阳性药地奥心血康组比较，各试验组并无显著差异(P>0.05)。除95%醇提物、95%醇沉物、15%醇沉物外，其余给药组效果均较好。结果见表2表2、对大鼠出血时间、凝血时间的影响(；士5Z)，S)^Cuttingtail(s)Capillary(s)Plate(s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P〈0.05，#与阳性对照组比较P<0.05(2)对大鼠血脂水平的影响SD大鼠连续给予高脂饲料饮食后，未经治疗的高脂模型组血脂水平显著升高，表现在血液的出血时间较空白对照组明显縮短；与此同时，经过一个疗程的治疗后，受试药各组均在不同程度降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平。低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)含量及HDL-C/LDL-C比值，溶媒对照组与模型组无明显差别；与高脂模型组和溶媒对照组比较，除95%醇沉物、65%醇沉物外，各受试药均可降低总胆固醇(TC)水平(P<0.05)，但对甘油三酯(TG)水平影响不大。对脂蛋白尤其是HDL/LDL比值的影响，从本实验结果来看，地奥心血康组对提升HDL水平，改善HDL/LDL比值效果一般，但是受试药中95%醇提物、65%醇提物、15%醇提物、15%醇沉物对于升高HDL水平效果较好，可以明显提高HDL/LDL比值，其中65%醇提物和15%醇提物效果好于地奥心血康组(P<0.05)，而HDL的水平升高对于降低总胆固醇作用极大，是该四组实验中总胆固醇降低的原因之一。结果见表3、表4。表3、对大鼠总胆固醇、甘油三酯水平的影响(^士5Z))<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>承与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P〈0.05，表4、对大鼠高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平的影响(^士<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P<0.05，#与阳性对照组比较P<0.05(3)对大鼠自由基水平的影响SOD水平具有抗自由基生成的作用，对于维持机体内环境稳定，抗动脉硬化、抗细胞凋亡具有重要作用，LPO是自由基生成的主要指标之一。受试药在发挥降低血脂的同时，对血清超氧化物歧化酶(SOD)及脂质过氧化(LPO)也有不同程度的影响，其中水煎液、95%醇提物、65%醇提物、15%醇提物、15%醇沉物受试药对提高血清超氧化物歧化酶(SOD)水平(P<0.05)，同时降低脂质过氧化(LPO)水平(P<0.05)效果较为显著，见表5。表5、对大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化(LPO)水平的影响纟^±lE^jwSOD(u.mL1)LPO(nmoL.L")<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>410269.1±36.8*25.37±3.85*10333.2±31.8*A22.16±3.70"610265.7±37.7*26.58±4.45*710265.3±37.5*25.84±4.94*810287.0±26.7*25.18±4.06*910298.0±30.3、19.00±2.62A氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P<0.05，综合比较各给药组对高血脂大鼠出血时间、凝血时间，血脂水平，抗自由基活性的影响后可得出65%乙醇提取物对检测的各项指标影响都较为显著，故本发明确定65%的乙醇为最佳提取溶剂。4、有效部位的活性测定样品溶液的制备称取所需穿龙薯蓣药材，粉碎过40目筛，用65%乙醇(IO倍量)回流提取2次，每次2h，滤过，滤液合并，旋转蒸发挥去乙醇，过滤得浓縮的水溶液。用氯仿萃取3次，每次按氯仿水=1:l萃取，合并萃取液，挥干，加水溶解、稀释得适当浓度的水溶液(A药组)。将水层用正丁醇萃取3次，每次按正丁醇水=i:i萃取，合并萃取液，挥干，加水溶解、稀释得适当浓度的水溶液(B药组)。将最后所得的水层减压浓縮至适当浓度(c药组)。抗自由基、降血脂药效学实验实验材料、高血脂动物模型的制备、检测指标以及实验方法均同前述。随机将大鼠分为空白对照组、高脂模型组、溶媒对照组、地奥心血康组、A药组、B药组和C药组。(1)对大鼠出血时间、凝血时间的影响综合三种检验方法指标结果来看，与高脂模型组和溶媒对照组比较，各受试药均可延长出血时间、降低血液粘滞度(P<0.05);但与阳性药地奥心血康组比较，各试验组并无显著差异(P>0.05)。其中氯仿层和正丁醇层效果较显著，三种检测方法所得结果均好于地奥心血康组。结果见表6。表6、对大鼠出血时间、凝血时间的影响(；士5D,s)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P<0.05，#与阳性对照组比较P<0.05(2)对大鼠血脂水平的影响经过一个疗程的治疗后，受试药各组均在不同水平降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平。与高脂模型组和溶媒对照组比较，各受试药组均可降低总胆固醇(TC)水平和甘油三酯(TG)水平(P<0.05)。对脂蛋白尤其是HDL/LDL比值的影B向，以氯仿层和正丁醇层效果较好。结果见表7、表8。表7、对大鼠总胆固醇(TC)水平和甘油三酯(TG)水平的影响(；士5Z))<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P<0.05，表8、对大鼠高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平的影响(^士SZ))组别HDL(mmoL)LDL(mmoL)HDL/LDL空白^f照红L101.81±0.190.47±0.124.03±0.90高脂模型组103.56±0.55*2.48±0.95*2.30±1.63*溶々某对照组83.95±0.58*1.32±0.79A3.90±1.90A阳性对照组102.81±0.27人*1.64±0.28"1.75±0.30*人A102.21±0.14*0.37±0.07A5.97±1.25*x#B102.06士0.19'.0.52±0.17A3.96±0.86*xC102.36±0.23*0.72士0.16*3.28±0.58*人氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P<0.05，#与阳性对照组比较P<0.05(3)对大鼠自由基水平的影响从实验结果可知氯仿层和正丁醇层对提高血清超氧化物歧化酶(SOD)水平(P<0.05)，同时降低脂质过氧化(LPO)水平(P<0.05)效果较为显著。见表9。表9、对大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化(LPO)水平的影响(x±5Z))组别SOD(u■mL")LPO(nmoL.L")空白对照组10393.5±35.319.67±3.25高脂才莫型組10261.9±53.4*30.04±6.46*溶媒对照组8246.4±43.9*24,38±3.00*阳性对照组10340.1±32.5*A18.80±3.21*A10324.6±35.4*人22.88±4.33*AB10330.8士64.1"21.05±4.07*AC10265.8±37.7*26.90±4.75*氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P<0.05，上述实验结果表明，对高脂饲料(含猪油、胆固醇3%、猪胆盐0.5%和甲基硫氧嘧啶0.2%)喂食动物而造成的大鼠高血脂模型，穿龙薯蓣65%乙醇提取液的氯仿层和正丁醇层对高血脂大鼠的出凝血时间、血脂水平以及自由基水平均有显著影响，说明在穿龙薯蓣提取液的氯仿层和正丁醇层中含有的降脂、抗凝、抗自由基的活性成分较多。五、穿龙薯蓣提取物中主要甾体化合物的抗自由基、降血脂活性1、样品溶液的制备将上述分离得到的4个甾体化合物薯蓣皂苷(dioscin)、原薯蓣皂苷(protodioscin)、延龄草苷(trillin)和薯蓣皂苷元(diogenin)分别用二甲基亚砜(DMS0)溶解，加蒸馏水稀释至1.0mgmL—、置于4t:冰箱保存。2、实验方法在室温27°C，湿度60%的条件下，将大鼠饲养一周后，随机分为空白对照组、高血脂模型组、溶媒对照组(二甲基亚砜溶液)、地奥心血康组(0.5mg甾体总皂苷/kg)、实验1号药组(薯蓣皂苷溶液)、2号药组(原薯蓣皂苷溶液)、3号药组(延龄草苷溶液)和4号药组(薯蓣皂苷元溶液)，除溶媒对照组8只，其余各组每组10只动物，其后的实验方法同前所述。对确证造模成功后的大鼠，在饲养约第15天后开始给药，腹腔注射给药，每天一次(注射量0.5mL/kg体重)，连续给药28天(末次给药后，禁食不禁饮8h)，测大鼠出血时间、凝血时间。全部动物经眼眶采血，取血清，检测血脂(给药后血脂)及脂质过氧化物酶水平。3、实验结果(1)各单体化合物对大鼠出血时间、凝血时间的影响综合三项检验指标来看，与高脂模型组和溶媒对照组比较，各受试药均可延长出血时间，降低血液粘滞度(P<0.05);与阳性药地奥心血康组比较，各试验组并无显著差异(P>0.05)。以原薯蓣皂苷溶液和薯蓣皂苷溶液效果最显著，出血时间、凝血时间两种检测方法指标均接近或好于地奥心血康组。实验结果均用均值±标准差(x士s")表示，t检验统计处理，结果见表10。表10、单体化合物对大鼠出血时间、凝血时间的影响(^士S2)，s)组别Cuttingtail(s)Capillary(s)Plate(s)空白对照组10198.2±14.2169.6±13.0159.8±6.4高脂模型组1095.9±9.7*#80.9±9.r#82.4±10.1*#溶媒对照组897.3±12.8*#78.3±4.6*#87.0士12.6"阳性药组10166.8±15.3人*148.6士12.9"122.6士13.8"110170.3±25.0A#133.3士10.0"131.3±8.5A*#210180.5±21.9A*#.148.4±30.1"#134.5士14.5人'310143.0±5.9"145.0士14.8"115.8±7.0"410150.4士3.0"145.0±8.0"117.6±9.8"氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P<0.05，#与阳性药组比较p<0.05结果显示，经过一个疗程的治疗后，与高脂模型组比较，各受试药均可延长出血时间、降低血液粘滞度(p<0.05)。与阳性药地奥心血康组比较，薯蓣皂苷溶液和原薯蓣皂苷溶液效果相近或略好于地奥心血康组，出血时间和凝血时间两种检测方法指标均稍高于地奥心血康组。(2)各单体化合物对大鼠血脂水平的影响sd大鼠连续给予高脂饲料饮食后，未经治疗的高脂模型组血脂水平显著升高，表现在血液的出血时间较空白对照组比较明显縮短；与此同时，经过一个疗程的治疗后，受试药各组均在不同水平降低总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)水平。对低密度脂蛋白(ldl-c)、高密度脂蛋白(hdl-c)含量及hdl-c/ldl-c比值，溶媒及空白对照组与模型组无明显差别；与高脂模型组和溶媒对照组比较，各受试药均可降低总胆固醇(tc)水平和甘油三酯(tg)水平(p<0.05)。对脂蛋白尤其是hdl/ldl比值的影b向，以延龄草苷溶液和薯蓣皂苷元溶液较好，效果好于地奥心血康组(p<0.05)。从本实验结果来看，受试药中原薯蓣皂苷溶液和薯蓣皂苷元溶液对于升高hdl水平效果最好，而hdl的水平升高对于降低总胆固醇作用极大，是该四组实验中总胆固醇降低的原因之一。结果见表11、表12。表11、单体化合物对大鼠总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)水平的影响(^i^z))组别wTC(mrnol^)TG(mmolj)空白对照^L102.57±0.261.40±0.24高脂模型组107.23±0.92*2.39±0.54*溶媒对照组85.68±0.88*2.03±0.70a阳性药组105.33±0.39"1.67±0.44a*1。103.50±0.78人1.40±0.55人2103.20±0.28a*1.10±0.46人*3103.66±0.68a*1.86±0.55a4103.86土0.34"1.92±0.44"氺与空白对照组比较p<0.05，人与高脂模型组比较p<0.05，表12、单体化合物对大鼠高密度脂蛋白(hdl)和低密度脂蛋白(ldl)水平的影响(x士幼)18组别HDL(mmoL)LDL(mmoL)HDL/LDL空白3十照纟且101.81±0.190.47±0.124.03±0.90高脂才莫型组103.56±0.35*2.48±0.35*2，0.63*溶媒对照组83.95±0.38*1.32±0.29^3.90±0.90^阳性药组102.81±0.之7人*1.64土0.28人*1.75±0.30*^1101.20±0.11*1.60±0.54*人2102.90士0.49人1.34士0.25"2.22士0.43*102.68±0.39人*5息1.09承丄#4103.02±0.24*0息0.11A10.00±1.40*A#氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P〈0.05，#与阳性药组比较P<0.05结果显示，经过一个疗程的治疗后，受试药各组均在不同水平降低总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平。对低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)含量及HDL/LDL比值，溶媒对照组(匿SO及蒸馏水)与模型组无明显差别，与高脂模型组比较，各受试药均可降低总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平(P<0.05)。对高、低密度脂蛋白的影响，尤其是HDL/LDL比值，受试药中延龄草苷溶液和薯蓣皂苷元溶液对于升高HDL水平效果最显著，可以明显提高HDL/LDL比值，效果优于地奥心血康组(P<0.05)。薯蓣皂苷溶液和原薯蓣皂苷溶液虽然也可以提升HDL水平，但是对改善HDL/LDL比值作用不明显。(3)各单体化合物对大鼠自由基水平的影响四组受试药溶液对提高SOD水平(P<0.05)，同时降低LPO水平(P<0.05)均有一定效果，其中薯蓣皂苷溶液、原薯蓣皂苷溶液和延龄草苷溶液较为显著。见表13。表13、单体化合物对大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化(LPO)水平的影响(x士SZ))19<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>氺与空白对照组比较P<0.05，人与高脂模型组比较P<0.05，结果显示，受试药对血清超氧化物歧化酶(SOD)及脂质过氧化(LPO)也有不同程度的影响，其中薯蓣皂苷溶液、原薯蓣皂苷溶液和延龄草苷溶液对提高血清超氧化物歧化酶(SOD)水平(P<0.05)，同时降低脂质过氧化(LPO)水平(P<0.05)效果较为显著，与其降血脂、降低血液粘滞度的作用基本平行。上述实验结果表明，经过腹腔注射的4种甾体化合物对降低高血脂大鼠血脂水平、降低血液粘滞度和清除机体自由基有较显著作用，为穿龙薯蓣降血脂作用的有效成分，其中薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷效果最显著。权利要求一种穿龙薯蓣提取物，其特征在于，所述提取物是将穿龙薯蓣药材经醇溶液提取后，用氯仿和正丁醇萃取得到的混合物，其中包括甾体化合物、植物甾醇及苯甲酸。2.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述醇溶液为60%70%乙醇溶液。3.如权利要求2所述的提取物，其特征在于，所述醇溶液为65%乙醇溶液。4.如权利要求1所述的提取物，其特征在于，该提取物可进一步采用硅胶柱色谱、0DS中低压柱层析及半制备高效液相色谱分离纯化。5.如权利要求l所述的提取物，其特征在于，所述提取物中的甾体化合物包括薯蓣皂苷元、薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷和延龄草苷。6.如权利要求l所述的提取物，其特征在于，所述提取物中的植物甾醇为P-谷甾醇。7.如权利要求1所述的穿龙薯蓣提取物在制备抗自由基、降血脂药物中的应用。全文摘要本发明提供了一种穿龙薯蓣提取物及其在制备抗自由基、降血脂药物中的应用。本发明提供的穿龙薯蓣提取物是将穿龙薯蓣药材经醇溶液提取后，用氯仿和正丁醇萃取得到的提取物，其中包括甾体化合物、植物甾醇及苯甲酸。该提取物具有较好的降脂、抗凝、抗自由基活性。该提取物可进一步采用硅胶柱色谱、ODS中低压柱层析及半制备高效液相色谱分离纯化。其中甾体化合物包括薯蓣皂苷元、薯蓣皂苷、原薯蓣皂苷和延龄草苷，均具有较好的降脂、抗凝、抗自由基活性，为穿龙薯蓣降血脂作用的有效成分。其中薯蓣皂苷和原薯蓣皂苷效果较显著。文档编号A61P39/06GK101791365SQ201010121578公开日2010年8月4日申请日期2010年3月10日优先权日2010年3月10日发明者冉薇,李俊鹏,李军,毕开顺,王珏,王铁杰,钟敏,鲁艺申请人:深圳市药品检验所