专利名称：：钩藤生物碱单体及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物碱单体的制备以及用途。
背景技术：
：阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，即老年性痴呆，简称AD)是一种慢性进行性脑变性疾病，临床上以认知功能减退为核心症状。AD的发病率与年龄呈正相关，是老年痴呆的主要类型。近年来，国内外临床研究表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂是治疗AD最有效的药物，另外对青光眼、重症肌无力、肠梗阻等症的治疗也有较好的作用(金有豫.药理学(第五版)，2001；54-55.)。早期神经化学研究表明，AD患者脑部乙酰胆碱明显缺乏，脑组织中胆碱乙酰转移酶活性降低，乙酰胆碱合成减少，造成突触前胆碱能神经元明显退化。乙酰胆碱酯酶抑制剂与乙酰胆碱酯酶结合，使酶失去活性，内源性的乙酰胆碱大量堆积，脑内神经突触间乙酰胆碱的含量增加，从而发挥治疗AD的作用。钩藤(Uncariarhynchophylla(Miq.)Jacks.)为茜草科(Rubiaceae)钩藤属(Uncaria)植物，主要有效成分为生物碱，如钩藤碱(rhynchophyl1ine)、异钩藤碱(isorhynchophylline)等。钩藤为中医常用药，具有清热平肝，息风定惊，降血压之功效(杨成金.云南植物研究，1995，17=209-214.)。但到目前为止，尚未见钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether关于乙酰胆碱酯酶抑制活性的报道。
发明内容本发明的目的是提供钩藤生物碱单体单体及制备方法和用途.本发明是钩藤生物碱单体及制备方法和用途，钩藤生物碱单体的化学结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>钩藤生物碱单体的制备方法，其步骤为将钩藤药材粉碎成粉末状。第一次采用药材质量58倍的比例加入95%醇热回流提取23h；第二次按照药材质量25倍的比例加入95%醇热回流提取12h。两次的提取液合并浓缩至干，加适量水溶解，用4M的浓盐酸调PH值到12，静置1216h后抽滤。滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到911，然后用中极性有机溶剂萃取24次，萃取液合并浓缩至干，得到钩藤总生物碱提取物；钩藤总生物碱通过MCI-gel柱层析甲醇-水梯度洗脱，其梯度分别为50%，60%，70%，80%，90%，100%，收集80%和90%甲醇-水洗脱部分，浓缩至干，加丙酮溶解后，重结晶得到钩藤生物碱单体。钩藤生物碱单体的用途，能够作为强的乙酰胆碱酯酶抑制剂。本发明的钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether的结构鉴定如下无色棱状结晶(丙酮)，mp190-192°C。Dragendorff试剂显橙红色。ESI-MSm/z:367[M+H]+。i-WR(600MHz，CDC13)8ppm55(3H,d,J=7.2Hz,H-18)，1.87(1H,ddd.J=12.0,5.0,2.4Hz,H-14a),2.33(1H,ddd.J=12.0，12.0,2.4Hz,H_14b)，2.64(1H,m,H-5a)，2.72(1H,brd,J=15.0Hz,H_6a)2.97(1H,m,H_6b)，3.06(1H,m,H_5b)，3.15(1H,brd,J=12.0Hz,H_21a)，3.42(1H,d,J=12.0Hz,H_21b)，3.49(1H,Brd,J=12.0Hz,H-3)，3.70(1H,d,J=12.0Hz,H—15)，3.73(3H,s,_C00CH3)，3.80(3H,s_0CH3)，5.42(1H,q,J=7.2Hz,H-19)，7.06(1H,dt,J=7.8，1.2Hz,H_10)，7.10(1H,dt,J=7.8，1.2Hz,H-ll)，7.26(1H,dt,J=7.8，1.2Hz,H-12)，7.35(1H,s,H-17)，7.46(1H,dt,J=7.8，1.2Hz,H-9),7.92(1H,s,_NH)。13C_NMR(125MHz，CDC13)8ppm134.0(C-2),58.7(C3),51.4(C5),21.4(C6)，108.2(C7)，127.3(C8),118.1(C9),119.2(C10)，120.4(Cn),110.7(C12)，136.0(C13),34.2(C14),36.4(C15),112.5(C16)，159.6(C17)，13.0(C18)，121.1(C19)，134.9(C20)，64.5(C21)，168.7(_C00CH3),51.4(C00CH3),61.7(C17_0Me)，以上光谱数据与文献(H.Takayamaetal.TetrahedronLetters,1992,33(45):6831_6834)完全一致。所以该钩藤生物碱单体成分鉴定为geissoschizinemethylether。本发明采用改良的Ellman方法(EllmanG.L..BiochemicalPharmacology,1961；7:88-95)，研究了钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether的抗乙酰胆碱酯酶活性，并且研究了对东莨菪碱诱导的痴呆小鼠的学习记忆能力的影响(姜红柳.中国药理学通报，2008；24(10)=1399-1400)ο结果显示，钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether是良好的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂；能明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力。与药学上可以接受的载体或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型和非口服给药的注射剂或其它剂型，可以在临床上用于开发抗乙酰胆碱酯酶活性药物与治疗神经退行性疾病(阿尔茨海默病等)。具体实施例方式本发明是钩藤生物碱单体及制备方法和用途，钩藤生物碱单体的化学结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>geissoschizinemethylether钩藤生物碱单体的制备方法，其步骤为将钩藤药材粉碎成粉末状。第一次采用药材质量58倍的比例加入95%醇热回流提取23h；第二次按照药材质量25倍的比例加入95%醇热回流提取12h。两次的提取液合并浓缩至干，加适量水溶解，用4M的浓盐酸调PH值到12，静置1216h后抽滤。滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到911，然后用中极性有机溶剂萃取24次，萃取液合并浓缩至干，得到钩藤总生物碱提取物；钩藤总生物碱通过MCI-gel柱层析甲醇-水梯度洗脱，其梯度分别为50%，60%，70%，80%，90%，100%，收集80%和90%甲醇-水洗脱部分，浓缩至干，加丙酮溶解后，重结晶得到钩藤生物碱单体。以上所述的钩藤生物碱单体的制备方法，所用的醇是甲醇，或乙醇。中极性有机溶剂是指氯仿，或者二氯甲烷，或者乙醚，或者乙酸乙酯。钩藤生物碱单体的用途，其医药用途为乙酰胆碱酯酶抑制剂。乙酰胆碱酯酶抑制剂是指用于老年痴呆症，或者肠梗阻，或者重症肌无力，或者青光眼的药物。钩藤生物碱单体的用途，与药学上能够接受的载体，或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂，或其它剂型。下面结合具体实例进一步对本发明进行描述，但不限制本发明。实施例1钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether的制备称取钩藤粉末10kg，加入95%乙醇60L热回流提取2h，抽滤干；再加入95%乙醇40L热回流提取2h，再抽滤。两次的提取液合并浓缩至干，加7L蒸馏水溶解，用4M的浓盐酸调PH值到2，静置15h后抽滤。滤液用2M氢氧化钠水溶液调pH值到10。每次加入7L氯仿萃取，共萃取3次，萃取液合并浓缩至干，得到钩藤总生物碱14.Sg。然后将制得的钩藤总生物碱通过MCI-gel柱层析甲醇-水梯度洗脱(50%，60%，70%，80%，90%，100%)，收集80%和90%甲醇-水洗脱部分，浓缩至干，加丙酮溶解后，重结晶得到钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether1.5g。实施例2改良的Ellman法测定钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether的抗乙酰胆碱酯酶活性利用改良的Ellman方法测定生物碱geissoschizinemethylether对乙酰胆碱酯酶的抑制率，毒扁豆碱作为阳性对照药。具体实验过程如下运用96孔酶标板来测定样品对酶的抑制活性，样品组中每孔加入140μL0.IM的磷酸缓冲液(PH=8.0)，然后加入20μL的样品，空白孔中加入160μL磷酸缓冲液不加任何样品，阳性对照控制组中加入20μL0.lmg/mL的毒扁豆碱和140μL的磷酸缓冲液，样品本底孔中20μL的样品和155μL的磷酸缓冲液，除了样品本底以外的其它孔中均加15μL的乙酰胆碱酯酶，混勻在4°C下培养2min，然后每孔加10μL0.OlmM的DTNB(5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸))和10μL0.075mM的ATCI(碘化硫代乙酰胆碱)，混勻在37°C下培养20min，立即在405nm下测定各孔OD值。每组实验重复三次。并以下面公式计算样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率。(OD空白-OD阳性控制)一(OD样品一OD样品本底)抑制率=-；--X100%(OD空白一OD阳性控制)根据量效关系和直线回归法可以计算出样品对乙酰胆碱酯酶的半数抑制浓度值(IC5tl)。结果表明钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether对乙酰胆碱酯酶具有明显的抑制活性。其半数抑制浓度值(IC5tl)为ΙΟμΜ，实验数据见表1。表1改良的Ellman法测试结果样<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3=Morris水迷宫实验健康昆明种雄性小鼠50只，随机分成5组正常对照组、模型对照组、钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether高剂量组(lmg/kg)、钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether低剂量组(0.5mg/kg)和多奈哌齐对照组(0.lmg/kg)。除正常对照组和模型对照组腹腔注射等量的生理盐水外，各组小鼠每天固定时段腹腔注射给药1次，连续5d。给药2d后进行水迷宫的定位航行训练。除正常对照组腹腔注射等量的生理盐水外，其余各组小鼠均在训练前90min腹腔注射东莨菪碱2mg/kg。末次给药后24h进行空间探索试验，测试2min内在平台象限游泳的时间。结果表明，钩藤生物碱单体成分geissoschizinemethylether能明显改善痴呆小鼠的学习记忆能力，实验数据见表2。表2Morris水迷宫实验测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*与两对照组比较P<0.0权利要求钩藤生物碱单体，其化学结构为FSA00000037611100011.tif2.钩藤生物碱单体的制备方法，其步骤为将钩藤药材粉碎成粉末状。第一次采用药材质量58倍的比例加入95%醇热回流提取23h；第二次按照药材质量25倍的比例加入95%醇热回流提取12h。两次的提取液合并浓缩至干，加适量水溶解，用4M的浓盐酸调PH值到12，静置1216h后抽滤。滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到911，然后用中极性有机溶剂萃取24次，萃取液合并浓缩至干，得到钩藤总生物碱提取物；钩藤总生物碱通过MCl-gel柱层析甲醇-水梯度洗脱，其梯度分别为50%，60%，70%，80%，90%，100%，收集80%和90%甲醇-水洗脱部分，浓缩至干，加丙酮溶解后，重结晶得到钩藤生物碱单体。3.根据权利要求2所述的钩藤生物碱单体的制备方法，其特征在于醇是甲醇，或乙4.根据权利要求2所述的钩藤生物碱单体的制备方法，其特征在于中极性有机溶剂是指氯仿，或者二氯甲烷，或者乙醚，或者乙酸乙酯。5.钩藤生物碱单体的用途，能够作为强的乙酰胆碱酯酶抑制剂。6.根据权利要求5所述的钩藤生物碱单体的用途，其医药用途为乙酰胆碱酯酶抑制剂。7.根据权利要求5所述的钩藤生物碱单体的用途，其特征在于乙酰胆碱酯酶抑制剂是指用于老年痴呆症，或者肠梗阻，或者重症肌无力，或者青光眼的药物。8.根据权利要求5所述的钩藤生物碱单体的用途，其特征在于与药学上能够接受的载体，或其它赋型剂相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂，或其它剂型。全文摘要钩藤生物碱单体及制备方法和用途，其制备方法的步骤为将钩藤药材粉碎成粉末状。第一次采用药材质量5～8倍的比例加入95％醇热回流提取2～3h；第二次按照药材质量2～5倍的比例加入95％醇热回流提取1～2h。两次的提取液合并浓缩至干，加适量水溶解，用4M的浓盐酸调pH值到1～2，静置12～16h后抽滤。滤液用浓氨水或氢氧化钠水溶液调pH值到9～11，然后用中极性有机溶剂萃取2～4次，萃取液合并浓缩至干，得到钩藤总生物碱提取物；钩藤总生物碱通过MCI-gel柱层析甲醇-水梯度洗脱，其梯度分别为50％，60％，70％，80％，90％，100％，收集80％和90％甲醇-水洗脱部分，浓缩至干，加丙酮溶解后，重结晶得到钩藤生物碱单体；其用途能够作为强的乙酰胆碱酯酶抑制剂。文档编号A61P25/28GK101798306SQ20101012838公开日2010年8月11日申请日期2010年3月16日优先权日2010年3月16日发明者任晋,张东博,杨中铎,杨明俊,段东柱申请人:兰州理工大学