专利名称：组织工程用脐带去细胞Wharton胶支架及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学组织工程技术领域，涉及组织工程用细胞外基质(ECM)的提取和支架的制备方法。
背景技术：
软骨组织自身修复能力非常有限，组织工程技术为修复软骨缺损提供了一种具有良好应用前景的方法。主要内容包括种子细胞、支架材料、细胞因子以及培养环境，其中用好的方法和技术，构建理想的组织工程支架是成功修复关节软骨缺损的关键。目前用于软骨组织工程的支架材料包括天然和人工合成两种。人工合成支架材料主要为有机合成材料，以聚乳酸(PLA)、聚羟乙酸(PGA)、聚羟乙酸-乳酸(PLGA)、聚环氧乙烯(PluronicF-127)等高分子聚合物为主。人工合成材料的缺点是疏水性，不利于细胞的粘附，降解时产物呈酸性，在体内容易引起炎症反应。天然支架材料主要有胶原、脱钙骨基质、硫酸软骨素、透明质酸、藻酸钙、壳聚糖等。但上述材料在生物学特性(如结构、成分和生物力学)上与宿主的软骨组织相比还有很大差距。脐带包括脐带外膜、脐动脉、脐静脉以及Wharton胶。人脐带Wharton胶富含胶原、 透明质酸、硫酸软骨素，胶原占干重50%以上，其中以I、II、III型胶原为主，还有V型等胶原，占总胶原的95%以上，透明质酸、硫酸软骨素等GAG占脐带Wharton胶的近50%。软骨组织也富含胶原和透明质酸、硫酸软骨素等，故人脐带Wharton胶具有与软骨极为相似的细胞外基质成分，是制备软骨组织工程用支架的理想材料。
发明内容
发明目的是提供应用脐带Wharton胶为材料制备多种新型的组织工程用的多孔海绵支架的方法，所制备支架复合细胞后用以修复软骨、骨、皮肤、神经等组织的缺损。其发明内容包括(一)脐带去细胞Wharton胶三维多孔海绵支架的制备方法；
(二)应用所制备的支架复合细胞后植入体内修复软骨、皮肤、神经等组织的方法研究；
(三)用去细胞Wharton胶制备成水凝胶，采用微创注射法填充小型缺损。以下对本发明进行详细描述本发明的脐带去细胞Wharton胶三维多孔海绵支架通过下述方法制备得到以脐带为原料，先剥离脐带外膜及血管组织，余下组织清洗后低渗冻融，然后通过机械粉碎、差速离心和酶消化法去除细胞，收集脐带去细胞Wharton胶，将其注入模具，冷冻干燥，交联， 得到三维多孔海绵支架。具体而言，上述制备方法可包括如下步骤1)无菌条件下剥离脐带外膜及血管组织(两根动脉，一根静脉)，余下的组织用蒸馏水冲洗后低渗冻融，然后用双氧水作用，再用蒸馏水漂洗；2)经步骤1)处理后的组织通过机械粉碎制成勻浆；3)通过差速离心，结合显微镜观察，收集无细胞的纳米级胶原和GAG (复合型粘多糖)等成分，即脐带Wharton胶细胞外基质备用；4)经步骤幻处理后的沉淀部分用酶消化液处理去除细胞，然后通过差速离心收集去细胞Wharton胶；5)将步骤幻和4)收集的产物配成一定浓度的浆料注入模具，应用冷冻干燥技术获得冻干支架，再采用紫外线和碳化二亚胺或京尼平的方法进行交联得到三维多孔海绵支
^K O优选的上述步骤1)剥离脐带外膜和血管组织后的Wharton胶组织部分用蒸馏水清洗后置于三蒸水中，-10°C低渗冻融对-4他1·，然后用双氧水(体积百分浓度)作用，其中双氧水与所作用组织的体积比优选为2 1，作用的时间一般为5-10分钟，至组织变白，蒸馏水冲洗3-5次。上述步骤幻将组织放入粉碎机中粉碎5-10分钟制成勻浆。为防止粉碎机温度过高破坏脐带组织中的蛋白，每次粉碎的时间勿超过1分钟，粉碎5-10次。上述步骤3)将步骤2)制成的勻浆先1500rpm、4°C离心3_5分钟，收集上层勻浆 3000rpm、4°C离心10-15分钟，再收集上层勻浆6000rpm、4°C离心15-20分钟，此时的上层勻浆显微镜下观察为纳米级微丝，无细胞，收集该上层勻浆9500rpm、4°C离心30-40分钟，弃上清，收集沉淀。上述步骤4)将步骤3)中1500rpm、3000rpm和6000rpm离心后的下层勻浆合并， 加入0. 25%胰蛋白酶(0. 25%即0. 0025g/mL，指IOOmL溶液中含有0. 25g胰蛋白酶，这是生化领域中将固体配制成溶液试剂的通用浓度表示方法，下同)、0. 5-1% EDTA、0. 迭氮钠和0. 3%亚硫酸钠，粉碎后室温下消化M小时，然后按步骤幻中差速离心法收集沉淀。上述步骤幻将步骤幻和4)收集的产物用三蒸水清洗后配成一定浓度的浆料(优选3-6%的重量百分比浓度)，充分搅拌均勻后离心去气泡，然后将去除气泡的浆料注入模具中，-40°C预冻2-4小时；预冻支架从模具中取出，迅速转移到冷冻干燥机中升华干燥；将冻干支架置波长254nm紫外线下交联4 Shr ；再在碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的95%乙醇溶液中(浓度为EDC 20 50mM ;NHS 20mM) 4°C下交联Mh，或1 %京尼平4°C下交联M小时；然后用三蒸水漂洗，再次冷冻干燥，最后CcT辐照消毒后密封，于 4°C下保存。本发明中制备脐带去细胞Wharton胶三维多孔海绵支架用的脐带来源可以是人或其它哺乳动物。本发明制备的脐带去细胞Wharton胶的成分主要是纳米级微絲胶原，以及透明质酸、硫酸软骨素等GAG成分。本发明以脐带为原料，通过差速离心、酶消化法去细胞处理进而得到彻底脱细胞的三维多孔海绵支架，所制备的脐带去细胞Wharton胶三维多孔海绵支架具有可控的微细结构、适宜的降解速率和良好的生物相容性以及一定的生物力学强度，有利于细胞粘附和种子细胞均勻分布于支架内部，并增殖迁移生长，植入体内无免疫排斥反应，可广泛地应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。本发明支架可用于引导组织再生，修复受伤后的关节、气管等透明软骨组织及半月板、骺板、椎间盘等纤维软骨组织或耳、鼻、喉等弹性软骨组织；也可制备成复合支架，修复软骨、骨、皮肤、神经等组织；还可用脐带去细胞Wharton胶制备成水凝胶，采用微创注射法用于软骨、骨及其他组织缺损的修复。具体而言，本发明制备的脐带去细胞Wharton胶三维多孔海绵支架具备以下优点。(1)人或动物的脐带组织为废弃物，材料来源广泛，无伦理学限制，成本低；(2)脐带Wharton胶的组织结构和生化成分与软骨细胞外基质极为相似，经脱细胞处理后仍然保留原组织成分，富含胶原和透明质酸，其中胶原占干重50%以上，透明质酸、硫酸软骨素等GAG成分占近50%，类似于天然关节软骨的组成成分，为软骨细胞生长提供最接近天然的细胞外微环境；(3)具有良好的生物相容性；(4)制备流程简单易行，可重复性好，经物理、化学交联后，制备出的支架产品具有一定的生物力学强度；(5)支架可根据需要设计制备成所需的孔隙率和特定大小的孔径(如200-300微米)，孔相互连通，有利于种子细胞进入支架内部并分布均勻，利于种子细胞粘附、增殖、迁移及代谢。
图Ia是实施例步骤3b人脐带Wharton胶粉碎后3000rpm、4°C离心10分钟，取上清涂片、奥辛兰染色后放大100倍的光学显微镜下观察到的图像。图Ib是实施例步骤3c 6000rpm、4°C离心15-20分钟后取上清涂片，在光学显微镜下观察到的图像。图2a是实施例步骤3d 9500rpm、4°C离心30分钟后取下层做冰冻切片奥辛兰染色，在放大100倍的光学显微镜下观察到的图像；图2b是实施例步骤3d 9500rpm、4°C离心30分钟后取下层涂片，在扫描电子显微镜下观察到的图像。图3a是实施例制备的人脐带去细胞Wharton胶支架的大体观；图3b是实施例制备的人脐带去细胞Wharton胶支架用扫描电子显微镜观察到结构图像。图4a是实施例制备的人脐带去细胞Wharton支架I型胶原免疫组织化学染色后在放大100倍的光学显微镜下观察到的图像；图4b是实施例制备的人脐带去细胞Wharton支架II型胶原免疫组织化学染色后在放大100倍的光学显微镜下观察到的图像。图5是将骨髓间质干细胞接种于实施例制备的人脐带去细胞Wharton支架，培养 48小时，经奥辛兰染色后在放大100倍的光学显微镜下观察到的图像。图6a和6b是将骨髓间质干细胞接种于实施例制备的人脐带去细胞Wharton支架，培养48小时后扫描电子显微镜观察到的图像，其中图6b的放大倍数高于图6a。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证目的，绝不限制本发明的范围。
一、制备方法根据下述步骤制备脐带去细胞Wharton胶三维多孔海绵支架1、取人的脐带，无菌条件下，剥离脐带外膜及血管组织(两根动脉，一根静脉)，余下组织剪碎(l-2cm)，蒸馏水冲洗3次，然后浸泡在三蒸水中置-10°C，低渗冻融24小时，再用双氧水浸泡搅动5-10分钟，随后蒸馏水冲洗3-5次，其中双氧水与组织的体积比为 2 1，目的是使组织膨松，有利于组织中细胞破碎脱出。2、加三蒸水于组织中(所加三蒸水与组织的体积比约1 1)，倒入粉碎机中，低温层析柜中粉碎5-10次，每次1分钟，制成勻浆，其中每次粉碎的时间勿超过1分钟，防止粉碎机温度过高破坏脐带组织中的蛋白。3、顺序进行下述步骤a d的差速离心a.将步骤2制成的勻浆放入50ml离心管中，1500rpm、4°C离心5分钟，取上层勻浆涂片、甲苯胺兰染色，显微镜下观察为毫米、微米级毛球、细胞、纳米微絲等混悬勻浆；b.收集步骤a后的上层勻浆3000rpm、4°C离心10分钟，取上层勻浆涂片、奥辛兰染色，显微镜下观察见微米级颗粒、纳米级微丝，有一定量的细胞，如图Ia所示，在细胞周围包绕奥辛兰阳性物_酸性粘多糖(透明质酸、硫酸软骨素等)及微丝；c.收集步骤b后的上层勻浆6000rpm、4°C离心15-20分钟，取上层勻浆涂片，光学显微镜下观察已无细胞，如图Ib所示，只看到纳米微丝，无细胞；d.收集步骤c后的上层勻浆9500rpm、4°C离心30分钟，弃上清，收集沉淀，冰冻切片进行奥辛兰染色镜下观察，呈兰绿色、无细胞(图2a)，涂片扫描电镜显示均为纳米级微丝(图2b)，用三蒸水混勻洗三次(pH7)后的沉淀置4°C保存备用。4、在上述步骤a、b和c离心后的下层沉淀(毫米、微米级微球及单细胞)中加酶消化液(各成分的终浓度为0. 25%胰蛋白酶、0. 5-l%EDTA,0. 迭氮钠、0. 3%亚硫酸钠)， 入粉碎机中粉碎搅拌，然后室温中酶解消化24小时；然后4°C下进行差速离心1500rpm离心5分钟，收集上层勻浆3000rpm离心10分钟，再收集上层勻浆6000rpm离心15-20分钟， 再次收集上层勻浆9500rpm离心30分钟，弃上清，收集沉淀，用三蒸水混勻洗三次(pH7) 后，沉淀物置4°C备用。5、将步骤3和4收集的沉淀物配成3-6%浓度(重量百分比浓度)的浆料，充分搅拌均勻，离心去气泡，然后将离心后的浆料注入模具中，-40°C预冻4小时，预冻支架从模具中取出，迅速转移到冷冻干燥机中升华干燥，在真空(< IOOmTorr)下升华24_48h。将冻干后支架置于波长254nm紫外线下交联4 8h，再在碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)的95%乙醇溶液中(浓度为EDC 20_50mM和NHS 20mM) 4°C下交联24h，或采用1 % 的京尼平交联24h，三蒸水漂洗6次(pH7)，冷冻干燥，密封、Co6tl消毒后，4°C下保存。其中， EDC、NHS用95%乙醇配成交联溶液，利于支架增加强度，减小降解速度过快的不足，京尼平交联毒性低，交联后均用三蒸水漂洗6次以去除支架中残留的交联液。二、性能检测(一 )理化性能检测本发明制备的人脐带去细胞Wharton胶支架外观如图3a所示，用扫描电镜观察， 可见所制备的支架孔径大小分布较均勻，并且孔隙相互贯通，孔径多为200-300微米，支架孔隙率为90-96% (见图3b)。
( 二)组织化学染色观察所制备的支架I、II型胶原免疫组织化学染色呈阳性，支架网状结构呈棕黄色(见图 ^，4b)。(三)支架的生物相容性通过倒置显微镜观察看到，软骨方向诱导后的骨髓间质干细胞接种于支架，培养3 小时后细胞大部分黏附于多孔支架空隙中，24小时后可见支架孔隙被细胞填满。培养4 后细胞在支架孔隙中分布均勻，奥辛兰染色呈阳性(图5)，表明其含透明质酸、硫酸软骨素等酸性粘多糖；经扫描电镜观察，呈多边形类软骨样细胞，生长良好，并可见基质分泌(图 6a 禾口 6b)。
权利要求
1.一种组织工程用脐带去细胞Wharton胶支架的制备方法，是以脐带为原料，先剥离脐带外膜及血管组织，余下组织清洗后低渗冻融，然后通过机械粉碎、差速离心和酶消化法去除细胞，收集脐带去细胞Wharton胶，将其注入模具，冷冻干燥，交联，得到三维多孔海绵支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤1)无菌条件下剥离脐带外膜及血管组织，余下组织用蒸馏水冲洗后冷冻，然后用双氧水作用，再用蒸馏水漂洗；2)经步骤1)处理后的组织通过机械粉碎制成勻浆；3)将步骤幻制得的勻浆经差速离心，结合显微镜观察，收集无细胞的脐带Wharton胶4)经步骤幻处理后的带细胞部分用酶解液处理去细胞，然后通过差速离心收集去细胞 Wharton 胶；5)将步骤幻和4)收集的产物配成一定浓度的浆料注入模具，冷冻干燥获得冻干支架，先进行紫外线交联，然后再采用碳化二亚胺或京尼平方法进行交联得到三维多孔海绵支架。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)剥离脐带外膜和血管组织后的余下组织用蒸馏水清洗后置三蒸水中，-10°C低渗冻融M-48小时。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，低渗冻融后用双氧水作用5-10 分钟至组织变白，再蒸馏水漂洗3-5次，其中双氧水与所作用组织的体积比为2 1。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤幻在组织中加蒸馏水，放入粉碎机中粉碎5-10次制成勻浆，每次粉碎时间不超过1分钟。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)差速离心先1500rpm、 4°C离心3-5分钟，然后收集上层勻浆3000rpm、4°C离心10-15分钟，再收集上层勻浆 6000rpm、4°C离心15-20分钟，此时的上层勻浆显微镜下观察为纳米级微丝，无细胞，收集该上层勻浆9500rpm、4°C离心30-40分钟，弃上清，收集沉淀。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)将步骤3)中1500rpm、 3000rpm和6000rpm离心后的下层勻浆合并，加入0. 25%胰蛋白酶、0. 5-1% EDTA、0. 迭氮钠和0. 3%亚硫酸钠，粉碎后室温下消化M小时，然后1500rpm、4°C离心3_5分钟，收集上层勻浆3000rpm、4°C离心10-15分钟，再收集上层勻浆6000rpm、4°C离心15-20分钟，再次收集上层勻浆9500rpm、4°C离心30-40分钟，弃上清，收集沉淀。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤幻中所述浆料搅拌均勻后离心去气泡，然后将去除气泡的浆料注入模具中，-40°C预冻2-4小时；预冻支架从模具中取出， 迅速转移到冷冻干燥机中升华干燥；将冻干支架置波长254nm紫外线下交联4 他；再在含20-50mM碳化二亚胺与20mM N-羟基琥珀酰亚胺的95%乙醇溶液中4°C下交联Mh，或京尼平4°C下交联M小时；然后用三蒸水漂洗，再次冷冻干燥，最后CcT辐照消毒后密封，于4°C下保存。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤幻中浆料的重量百分比浓度是3 6%。
10.一种组织工程用支架，是根据权利要求1 9所述制备方法制得的脐带去细胞Wharton胶三维多孔海 绵支架。
全文摘要
本发明公开了组织工程用脐带去细胞Wharton胶支架及其制备方法。以脐带为原料，剥离脐带外膜和血管组织后通过低渗冻融，机械粉碎，差速离心，酶解消化去除细胞，收集脐带Wharton胶，将其注入模具，经冷冻干燥，交联得到多种三维多孔海绵支架及复合支架。该方法所用材料来源广泛，成本低，工艺简单，所制备的支架具有可控的微细结构、适宜的降解速率和良好的生物相容性以及一定的生物力学强度，有利于细胞粘附和种子细胞均匀分布进入支架内部，并增殖迁移生长，可广泛地应用于软骨、骨、皮肤及神经等组织工程领域，具有良好的临床应用前景。
文档编号A61L27/36GK102198292SQ20101013499
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者刘舒云, 卢世璧, 张莉, 彭江, 眭翔, 袁玫, 许文静, 赵斌, 郭全义, 黄靖香 申请人:卢世璧