专利名称：一种仿生原位再生修复纳米补片、制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种带阴离子基团材料、功能因子和/或 功能多肽、带阳离子基团材料复合物组成的纳米补片。并提供该纳米补片的制备方法以及 在外科手术中缺损组织的黏贴、封闭、堵漏、止血、隔离、修复、防止粘连、抗感染及人工脑膜 方面的用途，也可作为药物的缓释载体及纳米级组织工程支架材料。
背景技术：
在外科手术中经常需要对缺损及损伤组织的封闭、修复及防止粘连，现有的产品 有羧甲基纤维素、壳聚糖、聚乳酸、胶原及纤维蛋白胶的膜及凝胶产品，这些产品在一定程 度上对损伤组织的封闭、修复及防止粘连起到了积极的作用。但由于其产品存在诸多缺陷 影响了功能的发挥，如胶原蛋白海绵或膜产品厚度从0. 5mm至5mm，导致产品不柔软，与组 织贴附性能差，产品遇组织液容易形成粘糊状，产品失去拉伸强度，使得临床外科医生操作 不便，为获得一定的力学性能，得添加交联剂如戊二醛等，交联剂除有一定的组织毒性外， 还容易导致钙化形成；动物源性蛋白类产品存在较大安全风险(如病毒、病原微生物等)以 及蛋白大分子造成的人体过敏等不良反应；羧甲基纤维素、壳聚糖类产品力学强度不够，体 内降解时间或太短或太长；而聚乳酸产品降解产生酸性产物等等；因此，研制一种克服现 有膜产品缺陷的创新产品具有非常重大的临床应用价值。在本发明中巧妙地把生物材料的仿生、促进组织修复功能与生物材料的纳米复合 制备技术结合起来，使产品的理化性能得到了改善，柔软，组织黏附性好，适应脏器表面的 凹凸，抗拉伸及抗气压性能强，可作为缺损组织的黏贴、封闭、堵漏、止血、隔离、修复、防止 粘连、抗感染及人工脑膜方面的用途。也可作为药物的缓释载体及纳米级组织工程支架材 料。
发明内容
本发明的目的是根据上述现有产品的不足之处，提供一种仿生原位再生修复纳米 补片、制备方法及用途，本发明首先是提供一种对组织缺损具有原位再生修复效果的仿生 复合纳米补片；其次提供了一种该仿生复合纳米补片的制备方法；再者提供了该仿生复合 纳米补片作为缺损组织的黏贴、封闭、堵漏、止血、隔离、修复、防止粘连及人工脑膜方面的 用途。也可作为药物的缓释载体及纳米级组织工程支架材料。本发明目的实现由以下技术方案完成
一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述补片的构成方式是由带阳离子基 团材料的A层及带阴离子基团材料的B层依次叠加形成，其中所述的依次叠加指的是，由 [(A+B)n+A]或[(B+A)n+B]的构成方式，其中叠加次数n可为正整数。所述A层或B层的厚度为纳米级。所述的带阳离子基团材料的A层占所述补片的质量百分比为20%_80%，其余为带 阴离子基团材料的B层。
所述B层为带阴离子基团材料，该基团材料为可体内降解的具有生物相容性材 料，所述的带阴离子基团材料包括带阴离子基团多糖、带阴离子基团蛋白或带阴离子基团 多肽(聚肽)中的至少一种。所述的带阴离子基团多糖包括但不仅限于羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、透明质 酸、海藻酸、硫酸软骨素及肝素多糖及其衍生物中的一种或一种以上，以及聚乳酸、聚羟基 乙酸等一些高分子材料及衍生物。所述A层为带阳离子基团材料，该基团材料为可体内降解的具有生物相容性材 料，所述的带阳离子基团材料包括带阳离子基团多糖、带阳离子基团蛋白或带阳离子基团 多肽(聚肽)中的至少一种。所述的带阳离子基团多糖包括但不仅限于壳聚糖及其衍生物。所述的带阳离子基团多肽(聚肽)包括但不仅限于聚赖氨酸及其衍生物。所述的基团蛋白及多肽(聚肽)包括但不仅限于两性聚电解质胶原、弹性蛋白及其 水解产物。所述补片中含有不超过10%质量百分比的功能因子和/或功能多肽。所述功能多肽包括但不仅限于含_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_的多肽、含_缬 氨酸_甘氨酸_缬氨酸_丙氨酸_脯氨酸_甘氨酸_的多肽或含_异亮氨酸_赖氨酸_缬 氨酸_丙氨酸_缬氨酸_的多肽中的一种或一种以上的混合物。所述功能因子包括但不仅限于纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、血管内皮生长 因子(VEGF)、纤维蛋白原(fg)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生 长因子(TGFs)、骨形态发生蛋白(BMPs)、类胰岛素生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子 (PDGF)、凝血酶及分子量小于10000的壳寡糖中的一种或一种以上的混合物。一种仿生原位再生修复纳米补片的制备方法，其特征在于所述方法采用如下步 骤
1)分别配制带阳离子基团材料的A溶液和带阴离子基团材料的B溶液；
2)在一平板(平板材料须无毒，不溶于水或酸、碱性溶液，经除菌除热源处理)上喷涂A 或B溶液，干燥成膜；再在其上喷涂或浸泡B或A溶液，用注射用水洗涤，如此分别交替喷涂 或浸泡A液或B液，用注射用水洗涤，重复操作n-1次，最后再在其上喷涂或浸泡A或B溶 液，用注射用水洗涤，干燥成膜；控制每层A或B的膜厚为纳米级，制得如权利要求1-2所述 的纳米补片；
3)功能因子及多肽的添加可添加在1)所述的A或B溶液中，质量比浓度为09^10%；也 可单独配制质量比浓度为09^10%的溶液C喷涂或浸泡在2)制得的纳米补片表面；
4)作为显色剂，在1)配制的A和/或B溶液中可加入适量的核黄素；
所述的纳米补片用于缺损组织的黏贴、封闭、堵漏、止血、隔离、修复、防止粘连及人工 脑膜方面的用途，也可用于作为药物的缓释载体。本发明的优点是，本发明通过生物高分子材料的复合，模拟细胞外基质，为细胞的 停泊、生长、繁殖提供生存空间及获取营养、进行新陈代谢，且通过材料的优化组合调控材 料的体内降解速率；功能因子及功能结构多肽的添加有助于细胞的黏附、伸展，可调控细 胞_基质之间和细胞_细胞间的相互作用，从而实现材料在损伤组织的修复、再生等方面的 多功能用途；通过材料交替叠加聚电解质的制备方法所得纳米级材料使产品的理化性质利于细胞的粘附与基因表达，特别是强化了材料的力学性能，避免了交联剂的毒副作用。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业 技术人员的理解
实施例1.准备一 12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤、灭 菌及除热原处理)，干燥；分别配制带阳离子基团材料的A溶液(lmg/ml壳聚糖，0. lmol/L 乙酸，0. 2mol/LNaCl, pH=4)和带阴离子基团材料的B液(lmg/ml羧甲基壳聚糖，0. 15mol/ LNaCl, pH=6)；取部分B液加入功能多肽(1 X 10_4mg/ml)配制成C液，功能多肽氨基酸顺序 为赖氨酸_赖氨酸_半胱氨酸_丝氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_丝氨酸_半胱氨 酸-赖氨酸-赖氨酸；把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬 时喷涂C液，干燥成膜；接着高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗；接着高压瞬时喷涂B液， 用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作800次；接着再高压瞬时喷涂A 液，用注射用水冲洗；最后高压瞬时喷涂C液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用 水冲洗，干燥处理得成品。实施例2.准备一 12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤、 灭菌及除热原处理)，干燥；分别配制带阳离子基团材料的A溶液(2mg/ml壳聚糖，0. lmol/ L乙酸，0. 2mol/LNaCl, pH=4)和带阴离子基团材料的B液(2mg/ml的海藻酸，0. 15mol/ LNaCl, pH=6)简称B液；取部分B液加入表皮生长因子(EGF) (0. 01mg/ml)配制成C液；把 上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂C液，干燥成膜； 接着高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗；接着高压瞬时喷涂B液，用注射用水冲洗，如此交 替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作200次；接着再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗；最后 高压瞬时喷涂C液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得成品。实施例3.准备一 12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤及 灭菌除热原处理)，注射用水冲洗干燥；分别配制带阳离子基团材料(lmg/ml胶原，0. lmol/ L乙酸，0. 2mol/LNaCl, pH=3. 5)和带阴离子基团材料的B液(lmg/ml透明质酸，0. 15mol/ LNaCl, pH=6)；把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂 A液，干燥，接着高压瞬时喷涂B液，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操 作500次；最后再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干 燥处理得成品。实施例4.准备一 12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤、 灭菌及除热原处理)，干燥；分别配制带阳离子基团材料的A溶液(5mg/ml壳聚糖，0. lmol/ L乙酸，0. 2mol/LNaCl, pH=4)和带阴离子基团材料的B液(lmg/ml透明质酸，0. 15mol/ LNaCl, pH=6);取部分B液加入凝血酶(浓度2000IU/ml)配制成C液；把上述溶液分别灌装 到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂C液，干燥成膜；接着高压瞬时喷 涂A液，用注射用水冲洗；接着高压瞬时喷涂B液，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B 液、冲洗，重复操作300次；接着再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗；最后高压瞬时喷涂 C液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得成品。实施例5.准备一 12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥；分别配制带阳离子基团材料的A溶液(lmg/ml聚赖氨酸， 0. lmol/L乙酸，0. 2mol/LNaCl，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(lmg/ml的胶原，10ug/ml 的血管内皮生长因子，0. 15mol/LNaCl, pH=8)简称B液；首先往培养皿内浸涂B液，干燥成 膜，接着浸涂A液，用注射用水冲洗，如此交替浸涂B液、A液、冲洗，重复操作100次，最后 再浸涂B液，冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得成品。按实施例所制备样品(以下称供试品)，对其安全性及有效性进行了生物学及 力学性能评价试验
1.细胞毒性试验
参照/技术标准GB/T16886. 5-2003 细胞株L-929细胞(小鼠成纤维细胞) 培养液含10% (V/V)小牛血清的MEM 空白对照同批细胞培养液 阴性对照高密度聚乙烯 阳性对照5g/L苯酚溶液 浸提介质同批不含小牛血清的MEM 浸提时间24小时 供试品浸提比例lg/5ml 试验方法浸提液试验(MTT法)
在27°C、5%C02的空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品浸提液接触贴壁生长的细胞， 培养72h后，加入MTT液，孵育4h。吸除后，加入DMS0，通过分光光度计在波长630nm下对 各组进行吸光度测定，并计算细胞的相对增殖率。结 果供试品的细胞毒性0级
结 论参照GB/T16886. 5-2003，该供试品无细胞毒性。
2.皮内刺激试验
参照 / 技术标准:GB/T16886. 10-2005
试验动物健康新西兰兔 浸提介质0. 9%氯化钠注射液 供试品材料浸提液 阴性对照同批浸提介质 接触途径皮内注射
评判指标观察24h、48h、72h红斑、水肿反应程度
结 果注射后24h、48h、72h注射局部及周围皮肤组织均无红斑、水肿反应，试验侧 皮肤反应不大于对照侧皮肤反应。结 论参照GB/T16886. 10-2005，该供试品无皮内刺激反应。
3.急性全身毒性试验
参照 / 技术标准GB/T16886. 11-1997/ASTMF750 试验动物健康小白鼠 浸提介质0. 9%氯化钠注射液 供试品材料浸提液阴性对照同批浸提介质 接触途径尾静脉注射
评判指标观察4h、24h、48h、72h动物一般状态、毒性表现和死亡动物数。结果72h观察期内供试品组动物反应不大于阴性对照组动物。结 论参照GB/T16886. 11-1997/ASTMF750，该供试品急性全身毒性试验结果 符合要求。
4.溶血试验
参照 / 技术标准:GB/T16886. 4-2003/GB/T16175-1996 试验动物健康新西兰兔
稀释抗凝兔血制备新鲜抗凝兔血+0. 9%氯化钠注射液 阴性对照0. 9%氯化钠注射液 阳性对照蒸馏水 接触途径尾静脉注射
试验方法将供试品按一定比例浸入0. 9%氯化钠注射液中，37°C水浴保温30min后，加 入0. 2ml稀释新鲜抗凝兔血，37°C水浴保温60min。2500rpm离心5min后取上清液，用紫外 分光光度计在545nm处测定其吸光度，计算溶血率。结 果该供试品的溶血率为0.2%。结 论参照GB/T16886. 4-2003，该供试品的溶血试验结果符合医用材料的要 求。
5.力学性能试验
参照 / 技术标准M. J. Smith, M. J. McClure, S. A. Sell, etal. Suture-reinforcedelect rospunpolydioxanone_ elastinsmall-diametertubesforuseinvasculartissueengineer ing:Afeasibilitystudy. ActaBiomaterialia, 2008, 4(1):58 66
试验方法在M350-20KN万能力学试验机上测定样品的拉伸性能传感器250kgf，拉伸 速度lOmm/min，样品数量为3。结 果该供试品的拉伸强度为589 612KPa，断裂伸长率维持在140-160%范围 内。结论参照文献，该供试品的的力学性能完全满足人体内力学环境的需求。通过以上评价试验及数据说明本发明产品可用于人体组织缺损方面，且安全有 效。以下可通过动物试验可进一步证明本发明的使用效果
新西兰兔30只，体重(2500 士 40)克，雌雄不拘，随机分成两组A组15只(用于解剖 观察伤口血管生成)，B组15只(用于解剖观察伤口修复情况)；准备好规格为1. 5X1. 5厘米 的本发明产品；全部动物采用注射乌拉坦麻醉，麻醉稳妥后仰卧位，固定于手术台上；在每 个新西兰兔肺部的大致相同位置制造直径3毫米的伤口 ；把本发明产品贴到实验新西兰兔 肺部直径3毫米的伤口上，缝合解剖切口，术后分笼饲养，择日解剖观察。试验结果本发明产品的强度可经受住呼吸时的空气压力。平均8天，A组实验新 西兰兔的肺部伤口开始生成血管，B组平均27. 5天后伤口愈合。伤口愈合后，本发明产品 可在体内自然降解。本发明产品能适应脏器表面的凹凸，能贴住伤口，而且不会与其他组织粘连。本发明产品可用于胃、肝脏等柔软且难以缝合的脏器或是易出血的脏器，有助于缩短 外科手术时间，及缩短康复时间。
权利要求
一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述补片的构成方式是由带阳离子基团材料的A层及带阴离子基团材料的B层依次叠加形成，其中所述的依次叠加指的是，由[(A+B)n+A]或[(B+A)n+B] 的构成方式，其中叠加次数n可为正整数。
2.根据权利要求1所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述A层或B 层的厚度为纳米级。
3.根据权利要求1所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述的带阳离 子基团材料的A层占所述补片的质量百分比为20%-80%，其余为带阴离子基团材料的B层。
4.根据权利要求1或2所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述B层 为带阴离子基团材料，该基团材料为可体内降解的具有生物相容性材料，所述的带阴离子 基团材料包括带阴离子基团多糖、带阴离子基团蛋白或带阴离子基团多肽(聚肽)中的至少 一种。
5.根据权利要求4所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述的带阴离 子基团多糖包括但不仅限于羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素 及肝素多糖及其衍生物中的一种或一种以上，以及聚乳酸、聚羟基乙酸等一些高分子材料 及衍生物。
6.根据权利要求1或2所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述A层 为带阳离子基团材料，该基团材料为可体内降解的具有生物相容性材料，所述的带阳离子 基团材料包括带阳离子基团多糖、带阳离子基团蛋白或带阳离子基团多肽(聚肽)中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述的带阳离 子基团多糖包括但不仅限于壳聚糖及其衍生物。
8.根据权利要求6所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述的带阳离 子基团多肽(聚肽)包括但不仅限于聚赖氨酸及其衍生物。
9.根据权利要求4或6所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述的基 团蛋白及多肽(聚肽)包括但不仅限于两性聚电解质胶原、弹性蛋白及其水解产物。
10.根据权利要求3所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述补片中 含有不超过10%质量百分比的功能因子和/或功能多肽。
11.根据权利要求10所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于，所述功能 多肽为包括但不仅限于含-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-的多肽、含-缬氨酸-甘氨酸-缬 氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-的多肽或含-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬 氨酸-的多肽中的一种或一种以上的混合物。
12.根据权利要求10所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于，所述功能 因子包括但不仅限于纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、纤维蛋白原(fg)、血管内皮生长因 子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGFs)、骨形态 发生蛋白(BMPs)、类胰岛素生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、凝血酶、分子量 小于10000的壳寡糖中的一种或一种以上的混合物。
13.—种仿生原位再生修复纳米补片的制备方法，其特征在于所述方法采用如下步骤(1)分别配制带阳离子基团材料的A溶液和带阴离子基团材料的B溶液；(2)在一平板上喷涂A或B溶液，干燥成膜，其中平板材料须无毒，不溶于水或酸、碱性 溶液，经除菌除热源处理；再在其上喷涂或浸泡B或A溶液，用注射用水洗涤，如此分别交替 喷涂或浸泡A液或B液，用注射用水洗涤，重复操作n-1次，最后再在其上喷涂或浸泡A或 B溶液，用注射用水洗涤，干燥成膜；控制每层A或B的膜厚为纳米级，制得如权利要求1-2 所述的纳米补片；(3)在(1)所述的A或B溶液中可添加功能因子及多肽，质量百分比浓度为0%-10%;也 可单独配制功能因子及多肽质量百分比浓度为0%-10%的溶液C喷涂或浸泡在(2)制得的 纳米补片表面。
14.根据权利要求1-2所述的一种仿生原位再生修复纳米补片，其特征在于所述的纳 米补片用于缺损组织的黏贴、封闭、堵漏、止血、隔离、修复、防止粘连及人工脑膜方面的用 途，也可用于作为药物的缓释载体及纳米级组织工程支架材料。
全文摘要
本发明仿生原位再生修复纳米补片为由带阳离子基团材料的A层及带阴离子基团材料的B层依次叠加形成，其中带阳离子基团材料的A层占补片的质量百分比为20%-80%，其余为带阴离子基团材料的B层。带阳离子基团材料的A包括带阳离子基团多糖、带阳离子基团蛋白或带阳离子基团多肽(聚肽)中的至少一种；带阴离子基团材料的B包括带阴离子基团多糖、带阴离子基团蛋白或带阴离子基团多肽(聚肽)中的至少一种，功能因子和/或功能多肽的添加占补片的质量百分比为不超过10%。本发明所用原料为可体内降解的具有生物相容性材料，补片柔软，组织黏附性好，适应脏器表面的凹凸，抗拉伸及抗气压性能强，适合缺损组织的黏贴、封闭、堵漏、止血、隔离、修复、防止粘连及人工脑膜方面的用途，也可用于作为药物的缓释载体及纳米级组织工程支架材料。
文档编号A61L31/12GK101849850SQ20101014461
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者吴昌琳 申请人:苏州博创同康生物工程有限公司