专利名称：一种细菌多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，具体讲，涉及一种采 用轮状病毒蛋白与细菌多糖共价键连接的结合疫苗。
背景技术：
通过接种疫苗来预防疾病是人类在一个多世纪的临床实践中，证明是行之有效的 手段。经过多年的努力，医学界已经开发出各种不同的疫苗用以预防，诸如细菌、病毒和真 菌等，感染造成的各种疾病，极大地提高了人类的健康水平。生物技术的不断发展，促进了 疫苗品种的多样化。今天，用以预防病毒导致的传染病有灭活病毒技术开发出来的疫苗，如 乙脑疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等；用减毒病毒技术开发出来的减毒活疫苗，如轮状 病毒疫苗、口服脊髓灰质炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗和水 痘疫苗等。预防细菌性传染病的有用蛋白和多糖等生物大分子纯化技术开发出来的细菌类 疫苗，如破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素及其亚细胞组分、流行性脑膜炎球菌多 糖和23价肺炎球菌多糖等。用基因重组蛋白技术开发出来的疫苗，如乙肝表面抗原(预防 乙型肝炎)、人类乳头状类病毒颗粒病毒(预防子宫颈癌)等。用半化学结合技术开发出 来的预防脑膜炎和肺炎的细菌疫苗，如流行性嗜血杆菌b型多糖-蛋白结合疫苗、7价或10 价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗以及4价脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗。由此可见，医 学生物技术的发展，是疫苗产品不断发展的原动力，通过对生物技术的不断改进，能够开发 出更多的新型疫苗产品来应付不同的传染病对人类健康的挑战。细菌感染仍然是儿童的主要杀手，尤其是发展中国家，每年有数百万的儿童因患 传染病而死亡，其中最常见的病原体有肺炎球菌、流行性嗜血杆菌b型、奈瑟氏脑膜炎球 菌、沙门氏伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌和引起腹泻的痢疾杆菌、沙门氏菌和霍乱弧菌等。从化学结构上来看，以上每一个病原体都拥有一个细胞表面荚膜多糖(Capsular polysaccharide, CPS)或脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)壳，或者两者兼有，其功能是 帮助病原体感染宿主。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分免于被宿主免疫系统识 别，防止补体系统被细菌表面蛋白激活和免疫细胞吞噬，如果细菌被吞噬，荚膜多糖能够防 止细菌被杀灭。大多数病原菌中，不同的菌株表达不同结构的荚膜多糖和脂多糖，产生多种 不同的血清型菌株。流行性嗜血杆菌绝大多数是由b型一种血清型引起，肺炎球菌所致的 肺炎和脑膜炎是由已知的90种血清型中的很大一部分菌株感染所导致的，脑膜炎球菌造 成的脑膜炎则主要是A、B和C群细菌感染引起，尽管W135和Y型也开始出现。由此可见， 大多数细菌多糖类疫苗必需含有多种不同种类的细菌多糖以提高致病菌株覆盖率，优化和 选择包含何种细菌或者血清型多糖在疫苗中是一个非常复杂的流行病学问题。一旦明确何 种多糖抗体具有保护作用，则可用这种多糖作为免疫原来生产疫苗。临床使用证明，荚膜多 糖制作的疫苗明确有效，并在多个国家广泛使用。但是这类疫苗有几个缺陷，第一，具有重 复结构的多糖是T细胞独立型2类的免疫原，没有T细胞的参与，它们是无法诱导免疫记忆 效应，刺激机体产生的抗体主要是IgM和IgG2，不能够有效地激活补体系统；第二，更重要的是这种疫苗不能够诱导年龄小于2岁的婴幼儿产生免疫应答来预防疾病，而这一人群正 是免疫系统发育不完善，容易患传染病的高危人群。荚膜多糖和脂多糖的0-特异性多糖具有严格的重复性化学结构，这个化学结构 可由一个单糖单位或含有最多达7-8单糖残基形成的寡聚糖组成。这种重复性单位可为线 性或含有非碳水化合物取代基团的分叉结构，这些非碳水化合物取代基团可为0-乙酰基 (0-acetyl)、甘油磷酸(glycerol phosphate)或丙酮酸(pyruvate)。细菌多糖可能含有不 常见的单糖残基，如二氨基(diamino-)，脱氧和分叉链糖等。总的来说，荚膜多糖倾向于带 负电，而0-特异性寡聚糖为中性。试验表明，相对少量高亲和力的直接针对多糖主链结构 的抗体在免疫学上最为重要。半化学结合技术(也称结合技术)开发疫苗的方法是从20世纪80年代出现的开 发细菌疫苗的技术。John Robbins通过将流行性嗜血杆菌b型(Haemophilusinfluenzae type b，Hib)荚膜多糖(Polyribosylribitolphosphate，PRP)，用共价键的形式连接到蛋 白载体(破伤风类毒素)合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖PRP-破伤风类毒素结合疫苗 (PRP-TT)，在免疫动物后，能够产生杀菌的保护性抗体[1]，从而开创了新一代细菌疫苗开 发技术。特别有意义的是，对于年龄小于2岁的婴幼儿来说，由于免疫系统发育不完善，多 糖对于婴幼儿是属于一种非T细胞依赖性抗原，不能够刺激机体如成人一样产生长效的针 对于该多糖来源的细菌特异性保护IgG抗体。因此，多糖对于小于2岁的婴幼儿是一种半 抗原，不能够作为疫苗来接种小于2岁的儿童。当将细菌多糖以共价键的形式连接到蛋白 载体，如破伤风类毒素(Tetanus Toxoid, TT)，由于蛋白质是一种T细胞依赖性抗原，能够 将共价键连接的多糖转变成T细胞依赖性抗原，从而刺激机体产生针对于该多糖的特异性 IgG抗体，保护机体不受细菌的感染。流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素(PRP-TT)结合疫苗开发的成功，开创 了一个开发细菌疫苗的技术平台，即将细菌多糖，如荚膜多糖，0-特异性多糖(0-specific polysaccharide)，或寡聚糖(Oligosaccharide)，以共价键连接到蛋白载体上而制成的结 合疫苗。基于这一概念的成功，医学生物研究界通过采用同一种化学合成方法开发出了不 同细菌的结合疫苗；同样也用不同的合成技术开发出同一种细菌的结合疫苗。1980年，John Robbins用溴化氰来随机活化Hib荚膜多糖，然后，将己二酰二胼(Adipic Dihydrazide, ADH)作为连接物(linker)加到活化的多糖上，最后以EDC法[1]将衍化后的多糖共价键 地连接到载体蛋白破伤风类毒素上，合成出了流行性嗜血杆菌b型多糖-破伤风类毒素结 合疫苗(PRP-TT)。由于在每个多糖链上有多个活化点，蛋白载体上同样的有多个连接点， 形成的结合物是一种多糖和蛋白交叉连接的大分子，平均分子量约为5X106Da。1980年， Harold Jennings 在美国专利 4356170 里，陈述了用牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)为载体，将脑膜炎球菌的A，C群多糖通过还原胺法共价键地连接到BSA上，合成出了 流行性脑膜炎多糖-BAS结合疫苗。1987年和1990年，Porter Anderson分别在美国专利 4673574 和 4902506 里，描述了用变异无毒株白喉毒素 197 (Cross reaction material sub 197，CRM197)作为载体蛋白，以还原胺法合成了流行性嗜血杆菌b型寡聚糖-变异无毒株白 喉毒素197 (HbOC-CRM197)结合疫苗。具体的方法是用高碘酸钠氧化Hib荚膜多糖，产生在两 末端为醛基的寡聚糖，通过还原剂氰基硼氢化钠(sodiumcyanoborohydride)，将寡聚糖共 价键连接到蛋白载体上。形成分子量约为90kDa的脂多糖结合物，制成了含有30%的多糖和每一个蛋白上带有6个糖分子的结合疫苗。随后，美国默克(Merck，Sharpe and Dohme) 以巯基化学方法，用纯化的奈瑟氏脑膜炎B群菌株(Neisseria meningitidis groups B)细 菌表面蛋白复合物(outer membrane protein complex，0MP)作为蛋白载体，合成出流行性 嗜血杆菌b型多糖-细菌表面蛋白复合物(PRP-OMP)结合疫苗。运用这些合成技术，先后开 发出了三种现已广泛用于临床接种的流行性嗜血杆菌b型结合疫苗，即PRP-TT、PRP-HbOC 和 PRP-OMP。Hib结合疫苗的成功为开发其它细菌结合疫苗提供了理论和技术基础，随后的开 发进入了技术更为复杂的多价结合疫苗阶段，其原因是某些传染病，如肺炎球菌导致的肺 炎、流行性脑膜炎球菌所致的脑膜炎等，可由多种不同的血清型或菌株感染所致，并且各血 清型或菌株间由于细菌表面多糖的化学结构的不同，其抗体没有交叉免疫反应，因此，接种 单一的血清型或菌株结合疫苗，无法保护被接种人体免于其它血清型或菌株的感染。由于 这个原因，合成和配制多价结合疫苗来扩大疫苗的保护覆盖率成为开发的主要目标。通 过多年的努力，用结合技术开发出了多种覆盖率广的多价结合疫苗。2000年，美国惠氏 (Wyeth)公司成功开发并上市了 7价肺炎球菌多糖-CRM197结合疫苗，是由7个不同的肺炎 球菌血清型多糖分别共价键连接到CRM197蛋白载体上，混合配制而成的一种多价疫苗，用 以预防小儿肺炎，该7个血清型肺炎球菌涵盖了北美和欧洲90%以上流行的肺炎球菌不 同血清型菌株。2006年，Sanofi Pasteur开发出了 4价脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素 结合疫苗，用于预防4种流行性脑膜炎球菌群，即A，C，Y，W135，所致的脑膜炎。2009年， GlaxoSmithKline(GSK)也开发出了一种10价肺炎球菌多糖-蛋白质结合疫苗，用以预防 10种肺炎球菌血清型所导致的肺炎。该疫苗运用了三种蛋白质作为蛋白载体，其中最主要 的载体是蛋白-D(Protein D，PD)，有8个血清型多糖是用这个蛋白作为载体。蛋白-D是 用非可分型的流行性嗜血杆菌的基因重组方法表达出来的无酯化表面蛋白，能够刺激机体 产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型的流行性嗜血杆菌感染所致的急性中耳炎，其他 还有破伤风类毒素和白喉内毒素作为作为载体，被分别用作血清型18C和19F的结合疫苗 的蛋白载体。从以上结合疫苗产品的设计，可以看出，结合疫苗的开发从单价疫苗过渡到技术 上更为复杂的多价疫苗，提高了细菌疫苗的覆盖率。但是，这些结合疫苗有一个共同点缺 点，就是蛋白载体没有赋予免疫原性的保护功能，也就是说，尽管结合疫苗载体能够刺激机 体产生抗体，但是，疫苗的设计者并没有利用其抗体具有的保护性来预防传染病，同时，也 没有确定其产生的抗体是否达到保护性滴度水平。破伤风类毒素、白喉类毒素和白喉无毒 变异株毒素等传统蛋白被选择作为载体的主要原因，并不是因为它们的产生的抗体具有保 护性，而是从其安全性和能够增强结合物中多糖的免疫原性来考虑。显而易见，破伤风类 毒素和白喉类毒素已经是百白破三联疫苗的二个组分，被常规接种；所以，结合疫苗中的破 伤风类毒素和白喉类毒素载体是否能够刺激机体产生达到保护性抗体滴度并不重要，相反 的，结合疫苗中的多糖部分的抗体滴度才是疫苗设计者需要关注的主要问题。另外，一些正 在开发中的结合疫苗产品所用的载体，如E. coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组铜绿 假单胞菌外毒素A(rEPA)，E. coli所表达的基因缺失突变脱毒的重组霍乱毒素等也都是基 于相同的考量。GlaxoSmithKline在开发10价肺炎球菌多糖结合疫苗的设计中，选择了蛋白-D为载体，其原因是基于二个方面的考虑。其一，是为了避免重复使用已经作为百白破疫苗组分 的破伤风类毒素和白喉类毒素作为载体。临床试验表明，当多价肺炎结合疫苗与其他含有 与蛋白载体相同组分的单价疫苗或多联疫苗同时接种时，比如Hib-TT、百白破-Hib多糖结 合疫苗-IPV (灭活脊髓灰质炎疫苗)-乙肝疫苗(简称6联疫苗)，多价肺炎球菌结合疫苗 中的大部分血清型多糖的免疫原性会受到抑制，特别是对用破伤风类毒素作为载体的血清 型多糖免疫原性影响尤其明显。原因是多价肺炎球菌结合疫苗中作为载体的破伤风类毒素 和白喉类毒素总浓度过高，在同时接种含有百白破组分的联合疫苗时，如6联疫苗，会造成 所谓载体受体竞争性抑制效应，降低了结合疫苗多糖部分的免疫原性。SanofiPasteur的 11价肺炎球菌多糖-TT和DT混合载体蛋白结合疫苗和Merck的7价肺炎球菌多糖-OMP 结合疫苗(PCV-OMP)，都是临床试验结果不佳而导致产品开发失败的例子，原因就在与 此。其二，是赋予蛋白载体以真正的保护性免疫原性功能。临床试验证明蛋白-D能够刺 激机体产生保护性抗体，有潜在的预防非可分型流行性嗜血杆菌感染造成的急性中耳炎。 GlaxoSmithKline的10价肺炎球菌多糖结合疫苗选择蛋白-D作为载体，使得蛋白载体产生 的抗体具有临床意义的保护作用，是结合疫苗技术开发过程上的一大进步。不过，非可分型 的流行性嗜血杆菌实际临床意义受到该类细菌感染率低下的限制，其感染导致的急性中耳 炎发病率较低。在世界范围内，轮状病毒(Rotavirus)是导致儿童严重性腹泻的主要病原体，在 发达国家，因急性腹泻住院的儿童中，轮状病毒的检出率占35 52%。在美国，估计每年 有3百万儿童患轮状病毒腹泻，致使82000人住院治疗，150人死亡。在发展中国家，轮状 病毒也是导致2岁以下婴幼儿严重胃肠炎最常见的病原体，估计每年有超过1. 25亿5岁以 下的儿童患轮状病毒性腹泻，其中一千八百万儿童患中度腹泻，87万死亡。在中国，儿童出 生率约一千七百万，估计每年大约有35万儿童由于患轮状病毒腹泻导致死亡，排世界第二 位。由于该病毒的感染对2岁以下婴幼儿腹泻的发病率和致死率的增加有显著作用，开发 预防轮状病毒感染，有效且安全的疫苗是当务之急。轮状病毒属呼肠孤病毒科(Reoviridae genus)，是导致人类和众多动物腹泻的病 原体。全病毒直径70nm，具有特殊的三壳结构，最里层的核壳结构为核壳蛋白，包裹有病毒 基因。病毒的基因由双股RNA的11个分段式片段组成，为6个结构蛋白和5个非结构蛋白 编码。核壳蛋白是由VP1，VP2和VP3三个病毒蛋白构成；中间壳蛋白为VP6，外壳蛋白是由 VP4和VP7组成。由于轮状病毒的基因是双股的RNA，多片段结构，这种结构的基因可以进 行基因间的某种程度的重新组合，即轮状病毒基因的重配(reassortment)。当二个或者多 个病毒同时感染一个宿主细胞后，在新病毒颗粒的包装阶段，各个病毒的基因片段将在细 胞内重新组合，造成重配基因发生。轮状病毒这种重配基因的能力导致了人体对其免疫反 应的多样性，也增加了制作特异性轮状病毒疫苗的难度。轮状病毒根据病毒抗原性的不同可分成不同的型，亚型和血清型。现已发现有7 个血清型(A型 G型)，大多数人类病原体属于A、B和C型。流行病学调查发现致使人类 和动物患病的轮状病毒中以A型最常见，是疫苗开发的主要目标。A型轮状病毒根据其VP6 抗原特性的不同，进一步分类为亚型，绝大部分病毒株属于亚型I或II中的一种。不同的 轮状病毒表面壳蛋白VP7和VP4的中和抗原簇有所不同，能够独立地诱导各自的中和性抗 体，病毒的血清型可由VP4和VP7抗原的特异性决定。A型轮状病毒根据VP7和VP4的不同可进一步分类成G血清型和P血清型。由于轮状病毒基因是由11个片段组成，VP7和VP4 的编码基因能够独立分离组合，产生了 一种二进制方式进行的基因重配。VP7是一种糖蛋白 (glycoprotein)，因其抗原特性分为15种不同的G血清型，与其特异性的核酸序列，即基因 型(genotype)相对应；也就是说，每一 G血清型都有其特异的基因型，因此，通常G血清型 和G基因型可通用。全球鉴定出的人类致病轮状病毒株中，超过90%的是Gl，G2，G3，G4， 和G9株，共有10个血清型从人体上分离出来(见表1)。VP4是一种能够被胰蛋白酶切断 成两个不同的病毒蛋白，即VP8和VP5病毒蛋白，由其的抗原性的不同而决定的血清型为P 血清型，有些P血清型可进一步分为2个亚血清型。由于缺乏区别不同VP4血清型分型的 血清或单克隆抗体，阻碍了 VP4的血清型分型。RT-PCR的应用才使得VP4的基因型分型成 为可能，并运用于样品的流行病学调查。因此，VP4基本上是根据基因序列来进行分类，目前 共发现14个P血清型和至少26个P基因型(标于括号中)。P血清型和P基因型可能不 对应，需要同时标出，例如，轮状病毒Wa毒株被标示为PlA [8] Gl病毒。人类致病的毒株中， G1，G3，G4和G9的P和G血清型组合通常是P1A[8]，而G2通常是PlB [4]。由此可见，在世 界范围内流行的轮状病毒享有相同的交叉中和的抗原簇(印itopeS)Pl血清型，至少有7个 VP4血清型在人类轮状病毒中被发现。在流行病学上有意义的人类毒株的G血清型1，3，和 4是属于P血清型的IA亚血清型，和G血清型2是P血清型的IB亚血清型。
表1 感染人类的A型轮状病毒VP4的主要血清型和基因型分类
权利要求
一种具有免疫原性的细菌多糖 蛋白结合疫苗，其特征在于，所述的细菌多糖 蛋白结合疫苗中的蛋白为具有免疫原性的重组轮状病毒蛋白。
2.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述 的细菌多糖以共价键与重组轮状病毒蛋白相连接。
3.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述 的重组轮状病毒蛋白选自P基因型轮状病毒毒株的病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。
4.根据权利要求3所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述 的P基因型轮状病毒毒株选自P[8]、P[4]、P[6]或P[ll]基因型中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述 的 P 基因型轮状病毒毒株选自 P [8]Gl, P [4]G2, P [8]G3, P [8]G4, P [8]G9, P [8]G5 或 P[6]G8 中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述 重组轮状病毒蛋白选自VP8，VP4，VP8多肽链片段，核VP8，VP4多肽链片段，VP8特异性抗原 簇肽链，VP4特异性抗原簇肽链中的至少一种，其中优选VP8、核VP8。
7.根据权利要求4所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述 的 P 基因型 P [8]的轮状病毒毒株选自 Wa，Ku, P, Y0, MO, VA70, D, AU32, CH-32，CH-55，CHW2, CH927A, W161, F45, Ai-75, Hochi，Hosokawa, BR1054, WT78 或 W179 毒株中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所述 的 P 基因型 P [4]的轮状病毒毒株选自 DS-1，RV-5，S2，L26，KUN，E210，CHW17，AU64，107E18, MW333或TB-Chen毒株中的至少一种。
9.根据权利要求4所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述的 P 基因型 P [6]的轮状病毒毒株选自 M37，1076，RV-3, ST3, SC2, BrB, McN13, US1205, MW023, US585，或AU19毒株中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖_蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述的重组轮状病毒蛋白选自G血清型轮状病毒的VP7蛋白的部分氨基酸序列或全序列。
11.根据权利要求10所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述的G血清型轮状病毒毒株选自Gl，G2，G3，G4，G9，G5，G8，GlO或Gll血清型中的至少一 种。
12.根据权利要求10所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述 G 血清型轮状病毒的毒株选自 P [8] Gl, P [4] G2, P [8] G3, P [8] G4, P [8] G9, P [8] G5 或 P [6] G8中的至少一种。
13.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖_蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述的细菌多糖选自革兰氏阳性菌荚膜多糖，革兰氏阴性菌0-特异性多糖，革兰氏阳性菌荚 膜多糖片段，革兰氏阳性菌荚膜寡聚糖中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于， 所述的革兰氏阳性菌荚膜多糖选自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、 19A、19F、23F，流行性嗜血杆菌b型，脑膜炎球菌A、C、Y或W135群细菌中的至少一种。
15.根据权利要求13所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述的革兰氏阴性菌选自大肠杆菌0-157、伤寒杆菌、副伤寒杆菌或霍乱弧菌细菌中的至少一种。
16.一种编码权利要求3或10所述的重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列。
17.—种重组蛋白表达系统，其特征在于，所述的重组蛋白表达系统含有权利要求16 所述的核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的重组蛋白表达系统，其特征在于，所述的重组蛋白表达系 统选大肠杆菌表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、CHO细胞表达系统或酵母表达系统。
19.权利要求17所述的重组蛋白表达系统表达的蛋白，其特征在于，所表达的蛋白含 有权利要求3或10所述的氨基酸序列。
20.根据权利要求19所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白为轮状病毒非结构性蛋白 NSP4与权利要求3或10所述的氨基酸序列构成的融合蛋白。
21.权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖_蛋白结合疫苗的制备方法，其特征 在于，所述的细菌多糖和轮状病毒蛋白是在水溶液或有机溶剂通过化学合成反应得到结合 物。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂选自二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
23.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述的化学合成反应选自还原胺 法、己二酰二胼法或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法中的一种。
24.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括细菌多糖 的前处理、重组轮状病毒蛋白的表达和纯化以及结合物的纯化。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述的细菌多糖的前处理包括降 解和活化，所述的降解方法选自酸水解法、碱水解法、超声法、酶消化法或微射流法，优选微 射流法。
26.根据权利要求1所述的具有免疫原性的细菌多糖_蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述的免疫原性结合疫苗为冻干剂或水剂。
27.根据权利要求26所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述的免疫原性结合疫苗中含有佐剂。
28.根据权利要求26所述的具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，其特征在于，所 述的佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、氢氧化铝和磷酸铝混合物中的至少一种。
29.一种具有免疫原性的肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗，其特征在于， 所述的重组轮状病毒蛋白选自权利要求7所述毒株的至少一种、权利要求8所述毒株的至 少一种或权利要求9所述毒株中的至少一种，所述的肺炎球菌多糖选自血清型1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、23F 中的至少一种。
30.根据权利要求29所述的具有免疫原性的肺炎球菌多糖_重组轮状病毒蛋白结合 疫苗，其特征在于，所述的重组轮状病毒蛋白为权利要求7所述毒株的至少一种、权利要求 8所述毒株至少一种和权利要求9所述毒株至少一种所组成的轮状病毒蛋白。
31.根据权利要求30所述的具有免疫原性的肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫 苗，其特征在于，所述的重组轮状病毒蛋白来源于毒株Wa、DS-l和M37。
32.根据权利要求30所述的肺炎球菌多糖_重组轮状病毒蛋白结合疫苗，其特征在于， 所述的重组轮状病毒蛋白来源于毒株Wa和DS-I。
全文摘要
本发明涉及一种具有免疫原性的细菌多糖-蛋白结合疫苗，具体讲，涉及一种采用重组轮状病毒蛋白与细菌多糖以共价键连接的结合疫苗，本发明还涉及一种编码本发明所述重组轮状病毒蛋白的核苷酸序列、重组表达系统、重组表达系统所表达的蛋白，以及这种结合疫苗的制备方法。本发明还涉及一种肺炎球菌多糖-重组轮状病毒蛋白结合疫苗。其中，细菌多糖以共价键与重组轮状病毒表面蛋白相连接，所述的重组轮状病毒蛋白选自P基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列、G基因型轮状病毒蛋白的部分氨基酸序列或全序列。
文档编号A61K39/39GK101972475SQ20101014472
公开日2011年2月16日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者李建平 申请人:李建平