专利名称：去甲斑蝥素衍生物及其活性测试方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于斑蝥素衍生物领域，更具体是涉及一种去甲斑蝥素二聚体衍生物和一 种杂环取代去甲斑蝥素衍生物及其合成方法与应用。
背景技术：
斑蝥素(cantharidin)是我国民间中药，是治疗恶性肿瘤药物的有效成份。现代 研究证明，其对原发性肝癌有一定疗效，而且有升高白细胞，不抑制免疫系统等优点，因此， 具有很高的药用研究价值，引起人们的广泛关注。但斑蝥素的毒性较大，合成很复杂，近来 研究表明，去甲斑蝥素(norcantharidin)中少了 2，3位的两个甲基，去甲斑蝥素不仅保持 了较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用，而且毒性大大降低，基本上消除了斑蝥素 对泌尿系统毒刺激副作用。因此，与斑蝥素骨架修饰有关的一项具有重大意义的合成工作是去掉2，3位甲基 取代。这一结构改变不会影响抗癌活性而毒性有所降低，并且，使得合成步骤简化。另一 方面，斑蝥素衍生物的活性研究进展情况表明，斑蝥素的构效关系如下1)双环[2. 2. 1]庚 烷是斑蝥素的基本骨架环，除去2-C或3-C上的甲基不会影响其活性；1-C或4-C上引入取 代基会使其活性降低，在1-C位具有绝对立体构型的斑蝥素衍生物对PP2B具有良好的抑制 选择性；5-C或6-C上可以引入取代基，在5-C或6-C上引入取代基会相反地影响对PP1和 PP2A的相互作用，同时加强对PP2B的抑制。5-C和6-C之间也可以是双键；7-氧桥键是必 不可缺的，可能是氧原子能和PP1和PP2A形成氢键的缘故；2)酸酐环上酸酐部分还原则会 失去对PP1和PP2A的抑制作用。对斑蝥素结构5-C或6-C的改造工作一般都只是引入取代基，但药理测试结果不 够理想。研究发现，吡唑类杂环衍生物也具有强烈的生理和药理活性，如抗菌，抗痉挛消炎 调节植物生长和抗血小板凝聚等作用，在医药和农药的生产中有重要用途。正是在这启示之下，鉴于不同活性杂环在同一分子中聚集能明显改善或增强化合 物的生物活性这一特征，以及生物电子等排原理，我们设计合成在去甲斑蝥素取代芳胺结 构中5-C和6-C双键上进行1，3[3+2]偶极环加成引入五元杂环吡唑环和吡唑环，得到一系 列去甲斑蝥素衍生物。
发明内容
本发明的目的在于公开一种去甲斑蝥素衍生物，具体是指去甲斑蝥素二聚体衍生 物和一种杂环取代去甲斑蝥素衍生物及其中间体。本发明的另一目的在于提供这两种去甲斑蝥素衍生物的活性测试方法和结果。本发明采用的技术方案如下一种去甲斑蝥素二聚体衍生物其中一类为含异噁唑环的去甲斑蝥素二聚体衍生 物。其结构通式如式1所示。
式1式1 中R,为对氟取代苯基、对氯取代苯基、对甲磺酰基取代苯基、1-羟基-2-甲氧基取代 苯基或苯并[1，3] 二氧杂环戊烯基。一种去甲斑蝥素二聚体衍生物的另一类为含吡唑环的去甲斑蝥素二聚体衍生物。 其结构通式如式2所示。 式2式2 中R2为苯基、邻氯取代苯基、2，3- 二氯取代苯基、2-苯基-2H-1，2，3_三唑_4_取代 基或喹喔啉-2-取代基。一种杂环取代去甲斑蝥素衍生物其中一类为含异噁唑环的杂环取代去甲斑蝥素 衍生物。其结构通式如式3所示。 式3 式3 中队为11或甲基；&为对氟取代苯基、对氯取代苯基、对甲磺酰基取代苯基、1-羟基-2-甲氧基取代 苯基或苯并[1，3] 二氧杂环戊烯基。一种杂环取代去甲斑蝥素衍生物的另一类含吡唑环的杂环取代去甲斑蝥素衍生 物。其结构通式如式4所示。 式4式4 中队为11或甲基；R3为苯基、邻氯取代苯基、2，3- 二氯取代苯基、2-苯基-2H-1，2，3_三唑_4_取代 基或喹喔啉-2-取代基。本发明还提供上述两种去甲斑蝥素衍生物的活性测试方法，包括以下步骤(1)、将所培养的A549细胞用胰酶消化后离心，用新培养基悬浮重新后用液体分 装仪mutidrop在384孔板的各孔中以50ul体积种植300个A549细胞；(2)、在37°C、5% C02条件下培养24h后，用自动化液体处理系统Bravo分装药物 进行刺激，各种化合物的处理浓度有16uM 8uM4uM 2uM luM 0. 5uM 0. 25uM 0. 125uM，每种 处理有四个重复；(3)、经步骤2处理48h后，用CCK-8试剂盒对细胞的活性进行检测每孔加入 5ul CCK-8溶液，用酶标仪读取各孔波长在450nm处的吸收值；在细胞培养箱内继续孵育 lOOmin,用酶标仪再次读取波长在450nm处的吸收值。取两次吸收值的变化值除以未加化 合物处理孔的吸收值变化，取每组四个重复的平均值即为孔内细胞活性。化合物对细胞的 抑制效率=1"孔内细胞活性，将根据化合物浓度与细胞活性的梯度输入至http://bsmdb. tmd. ac. jp :3000/cbdb/ic50，计算最终得到 IC50。本发明还提供上述两种去甲基斑蝥素衍生物在合成抗肿瘤药物上的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果这是一种新型的N-取代去甲去氢斑蝥素酰亚胺衍生物，它将五元杂环异噁唑环 和吡唑环引入去甲基斑蝥素衍生物结构中，并且具有良好的抗肿瘤活性。以下结合具体实施方式
对本发明作进一步说明。
具体实施例方式下面实施例进一步说明本发明，且仅用于说明本发明，而不构成对本发明的限制。实验测试对象如表1所示。表1:实验测试对象 实施例1 以cell counting kit_8分析该32种化合物对人肺腺癌细胞A549活 性的影响。(1)将所培养的A549细胞用胰酶消化后离心，用新培养基悬浮重新后用液体分装 仪mutidrop在384孔板的各孔中以50ul体积种植300个A549细胞；(2)在37°C，5 % C02条件下培养24h后，用自动化液体处理系统Bravo分装药物 进行刺激，各种化合物的处理浓度有16uM 8uM4uM 2uM luM 0. 5uM 0. 25uM 0. 125uM,每种 处理有四个重复；
CI
N
h 、 P/N
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N
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PI
32
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(3) 48h后，用CCK-8试剂盒对细胞的活性进行检测每孔加入5ul CCK-8溶液，用 酶标仪读取各孔波长在450nm处的吸收值；在细胞培养箱内继续孵育lOOmin，用酶标仪再 次读取波长在450nm处的吸收值。取两次吸收值的变化值除以未加化合物处理孔的吸收值 变化，取每组四个重复的平均值即为孔内细胞活性。化合物对细胞的抑制效率=1-孔内 细胞活性，将根据化合物浓度与细胞活性的梯度输入至http://bsmdb. tmd. ac. ip =3000/ cbdb/ic50，计算最终得到IC50。检测结果如表2所示化合物31对A549有一定的抑制效果，在16uM、32uM、64uM的 浓度下几乎完全抑制了 A549细胞的生长，IC50的计算结果为4. 037uM。其余化合物对A549 的抑制作用不是非常明显。表2 不同浓度的化合物处理细胞48h后剩余的细胞活力
权利要求
一种去甲斑蝥素衍生物，其特征在于，其结构如式1所示的含异噁唑环的去甲斑蝥素二聚体衍生物式1式1中R1为对氟取代苯基、对氯取代苯基、对甲磺酰基取代苯基、1-羟基-2-甲氧基取代苯基或苯并[1，3]二氧杂环戊烯基。FSA00000157372700011.tif
2.—种去甲斑蝥素衍生物，其特征在于，其结构如式2所示的含吡唑环的去甲斑蝥素 二聚体衍生物 式2中R2为苯基、邻氯取代苯基、2，3- 二氯取代苯基、2-苯基-2H-1，2，3-三唑-4-取代基或 喹喔啉-2-取代基。
3.—种去甲斑蝥素衍生物，其特征在于，其结构如式3所示的含异噁唑环的杂环取代 去甲斑蝥素衍生物 R1SH或甲基;R2为对氟取代苯基、对氯取代苯基、对甲磺酰基取代苯基、1-羟基-2-甲氧基取代苯基 或苯并[1，3] 二氧杂环戊烯基。
4.一种去甲斑蝥素衍生物，其特征在于，其结构如式4所示的含吡唑环的杂环取代去 甲斑蝥素衍生物 R3为苯基、邻氯取代苯基、2，3- 二氯取代苯基、2-苯基-2H-1，2，3-三唑-4-取代基或 喹喔啉-2-取代基。
5.一种权利要求1 4所述去甲斑蝥素衍生物的活性测试方法，包括以下步骤(1)、将所培养的A549细胞用胰酶消化后离心，用新培养基悬浮重新后用液体分装仪 mutidrop在384孔板的各孔中以50ul体积种植300个A549细胞；(2)、在37°C、5%CO2条件下培养24h后，用自动化液体处理系统Bravo分装药物进行 刺激，各种化合物的处理浓度有16uM 8uM4uM 2uM IuM 0. 5uM 0. 25uM 0. 125uM，每种处理 有四个重复；(3)、经步骤2处理48h后，用CCK-8试剂盒对细胞的活性进行检测每孔加入5ul CCK-8溶液，用酶标仪读取各孔波长在450nm处的吸收值；在细胞培养箱内继续孵育 lOOmin，用酶标仪再次读取波长在450nm处的吸收值；取两次吸收值的变化值除以未加化 合物处理孔的吸收值变化，取每组四个重复的平均值即为孔内细胞活性；化合物对细胞的 抑制效率=I"孔内细胞活性，将根据化合物浓度与细胞活性的梯度输入至http://bsmdb. tmd. ac. jp :3000/cbdb/ic50，计算最终得到 IC50。
6.一种权利要求1 4所述去甲基斑蝥素衍生物在合成抗肿瘤药物上的应用。
全文摘要
本发明公开了一种去甲斑蝥素衍生物及其活性测试方法与应用，涉及斑蝥素衍生物领域。本发明的去甲斑蝥素衍生物，其中一种为去甲斑蝥素二聚体衍生物，另一种为杂环取代去甲斑蝥素衍生物。并以cell counting kit-8分析该种化合物对人肺腺癌细胞A549活性的影响。本发明的去甲斑蝥素衍生物具有良好的抗肿瘤活性。
文档编号A61K31/427GK101863909SQ201010197629
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者邓莉平 申请人:绍兴文理学院