专利名称：白细胞介素2在制备抗对虾白斑综合症的制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及白细胞介素2(InterleUkin-2)在制备抗对虾白斑综合症的制剂中的应用。
背景技术：
对虾是热带亚热带浅海最占优势的甲壳动物。由于其种类多，种群数量大，繁殖力 强，生长迅速，肉味鲜美，具有很高的经济价值。由于环境污染、养殖技术、疾病控制等方面 的原因，对虾，特别是斑节对虾(Penaeus monodon)、南美白对虾(Penaeus vannamei)、中国 )(寸虫下(Penaeuschinensis)禾口 日*)(寸虫下(Marsupenaeus japonicus)等，t及易；S至[|病_侵害， 并造成大量损失。对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus，WSSV)，是对虾养殖 中为害最烈的最主要病原。充分利用对虾的先天性免疫系统和免疫机制，通过有针对性地 刺激对虾的抗病机制来抵抗病毒，对于对虾病害的预防、治疗，提高对虾养殖的经济效益具 有重要的意义。对虾是最重要的海水养殖产品之一，但是自从1990年代以来，一直受到病害的严 重威胁，尤其是对虾白斑综合症病毒(white spot syndromevirus, WSSV)是危害养殖对虾 的最主要病原，其致病能力强，传播范围广，给世界对虾养殖业造成了巨大的损失，然而至 今仍无有效的防治方法。许多针对对虾病害的研究由于其仅仅停留在应用层面，并没有对所得到药物的抗 病机制进行更加深入的探讨，因此其药物的应用受到了一定的限制。同时由于无法针对其 作用机理进行分析，这些药物使用过程中产生的问题也得不到解答，进而无法有效解决。因 此，研究已知药理的抗病药物十分必要。对虾作为无脊椎动物的一员，主要通过其物理屏障、应激反应、先天性体液免疫、 细胞生理调节等过程抵御病害。细胞凋亡作为清除衰老和异常细胞的主要机制，在对虾染 病细胞的清除及防止病毒扩散中具有重要作用，是对虾抗病害的重要手段。并且是能够抵 御病毒性侵害的重要武器。Caspase蛋白家族中的两个亚家族分别在细胞凋亡中担任起始和效应蛋白，是细 胞凋亡的关键蛋白。担任起始作用的CaSpaSe-8、9等，收到凋亡信号后，能通过自剪接而激 活，然后引起caspase级联反应；担任效应作用的caspaseU、7等可直接降解胞内的结构 蛋白和功能蛋白，引起凋亡。
发明内容
本发明目的是提供白细胞介素2(InterleUkin-2，IL-2)在制备抗对虾白斑综合 症的制剂中的应用。本发明采用的技术方案是白细胞介素2(Interleukin-2，IL-2)在制备抗对虾白斑综合症的制剂中的应用。所述白细胞介素2可用于制备诱导PjCaspase蛋白活化的制剂。
优选的，所述制剂为肌肉注射剂，其中Interleukin-2的注射剂量为5 lOng/g 虾(优选7ng/g虾左右)。本发明所述Interleukin-2即作用于对虾凋亡途径关键蛋白PjCaspase的对 虾抗白斑综合症相关小分子。通过直接注射Interleukin-2或进行喂食可以通过激 活PjCaspase蛋白的活性，加强对虾对病毒的抵抗，极大地增强对虾对对虾白斑综合症 (WSSV)的抵抗力，降低致死率。本发明的有益效果主要体现在本发明所述Interleukin-2可以有效诱导 PjCaspase蛋白的活化，极大地增强对虾对对虾白斑综合症(WSSV)的抵抗力，降低致死 率；由于Interleukin-2是在人体中广泛使用的提高免疫力的药物，对人 体没有毒性，使用 Interleukin-2的对虾，无论其是否将药物代谢完全都可以放心食用。
图1为Interleukin-2在细胞内与Caspase蛋白结合能力的验证；图2为Interleukin-2对凋亡活性的影响；a为凋亡指标效应酶Caspasd的活性 检测；b为凋亡指标TUNEL活性；图3为Interleukin-2对病毒复制的影响；图4为Interleukin-2对感染WSSV对虾的死亡率的影响；横坐标表示天数，纵坐 标表示死亡率。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 1、IL-2与PjCaspase的结合能力的验证1. 1 扩增 PjCaspase 基因。1.1.1对虾组织cDNA合成1. 1. 1. 1对虾组织总RNA的提取1)取对虾鲜活组织200mg(日本对虾，购自浙江省杭州市某菜市场)，在800 y L Trizol(BBI公司)中迅速研碎。2)冰上放 5min。3)加入200 ii L酚/氯仿溶液(酚和氯仿等体积混合后用0. lmol/LTris. HC1 (pH7. 6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0. 01mol/l Tris. HC1 (pH7. 6)液层，保存于4°C ；使用时以吸管吸取下层溶液)，振荡混勻后12，OOOrpm 离心lOmin。4)移取上清至等量异丙醇。5)振荡混勻后 12，OOOrpm 离心 lOmin。6)沉淀用 50 ii L 无 RNA 酶双蒸水溶解后加入 1 P LDNase I (RNaseFree) (TaKaRa)， 消化1小时。7)重复步骤3) 5)。
8)沉淀用300iiL80% (v/v)乙醇洗两遍。9) 12000rpm, 2min甩干酒精后，50 y L无RNA酶双蒸水溶解。1. 1. 1. 2总RNA的逆转录得到cDNA 将下述成分放入一 RNase-free的Eppendolf管中总 RNA4gOligo (dT) (500 u g/mL)1 u L75°C变性5min，立即冰浴，随后加入5 X逆转录酶缓冲液4iiL各10mmol/L 的 4 种 dNTPs 混合液2 ii LM-MLV RT (RNase H_)(200U/u L)(TaKaRa) 1u L水补足至20iiL25°C反应 10min，42°C反应 30min 后，70°C加热 15min 终止反应。1. 1.2PCR 扩增:根据已经确定的基因阅读框序列合成下列引物(括号内所示为引入的划线部分 的酶切位点)5， -ATCCCGGGATGGACGAGGTAATCCAG-3’ (Smal)5， -TTCTCGAGTCACTGTGGGGCGGAG-3’ (Xhol)以对虾cDNA为模板，PCR扩增特异的基因片段。在0. 5mL的Eppendorf管中加入10XPCR 反应液5 ii LdNTP(2. 5mmol/L each)4 u L模板(约1 P g/ P L)2u L20mol/L基因特异性引物各1 y LTaq 酶(TaKaRa)1U加吐0至总体积50iiL按以下方法进行PCR 扩增95°C 5min ；94°C 30s，58°C 30s，72°C1. 5min, 35 个循环；72°C延伸 lOmin。1.1. 3片段回收:按常规方法从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，以omega生产的胶回收试剂盒为例1)割下含DNA的琼脂糖块，使它尽可能小，放入1. 5mL离心管中。如果琼脂糖重量 小于100mg，用双蒸水补至100mg，以确保体系总体积不至太小；2)按每100mg琼脂糖加入300 u L S1液的比例加S1液(试剂盒自带)，置50°C水 浴lOmin，使琼脂糖块完全溶化，每2min颠倒混勻一次；3)将溶化后的琼脂糖溶液移入吸附柱，7000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体， 再将吸附柱放入同一个收集管中；4)在吸附柱中加入500 iiL W1液(试剂盒自带)，7000rpm离心15s，倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放入同一个收集管；5)在吸附柱中加入500 uL ffl液，静置lmin，7000rpm离心15s，倒掉收集管中的 液体，将吸附柱放入同一个收集管中；7) 7000rpm 离心 lmin ；
5
8)将吸附柱放入一个干净的1. 5mL的离心管中，在吸附膜中央加入10 y L无菌水， 静置 lmin，lOOOOrpm 离心 lmin，将 EP 管C存于 _20°C。1. 2克隆到PIZ改造载体1. 2. 1酶切反应在0. 5mL Eppendorf管中依次加入内切酶缓冲液(10X)(TaKaRa) 2u LDNA约 0. 5 u g内切酶(TaKaRa)0. 5 u L加水至总体积20iiL37°C水浴 2 3h。70°C 15min 失活。按常规方法回收1. 2. 2连接转化到大肠杆菌感受态细胞1) 6 ii L目的片段+1. 5 ii L同酶双酶切的改造pIZ/V5_His载体(原始pIZ/ V5-His载体购自Invitrogen，预连入EGFP蛋白加以改造。EGFP片段可以通过购 买 pEGFP(BD Biosciences Clontech)获得)+lyL T4buf f er (TaKaRa) +0. 25 u L T4Ligase (TaKaRa) +1. 5 u LH20 16°C连接过夜。2)取_70°C保存的DH5a感受态细胞，用手搓使其融化后用手指轻弹，混勻菌体， 加入适量质粒或连接产物，冰上放置30min。3) 42°C水浴热击90s，迅速冰浴1 2min。4)加入400 uL LB液体培养基，于37°C摇床上低速(lOOrprn)摇动45min。5)吸取菌液100 200 u L，均勻涂布于LB (含100 y g/mL Amp)平板上，平板室温 静置20 30min，待菌液浸入培养基后，倒置于37°C培养过夜。(6)菌落PCR初筛重组子，酶切鉴定后测序。1.3 转染进 High Five 细胞测序验证插入片段的序列正确(其序列如SEQ ID N0 :1所示)后a)混合含有 1 P g 克隆的 100 ii L ExpressFiveSFM 培养基(Invitrogen)和含有 1 y g cellinfectin (Invitrgen)白勺 100 y L ExpressFiveSFMi音养基(Invitrogen) i音养基。b)静置 45min。c)加入 800 u L ExpressFiveSFM 培养基(Invitrogen)，混勻。d)加入到脱血清的HighFive细胞(Invitrogen)中，室温静置4h。e) ^^F^f ExpressFiveSFM(Invitrogen) .#31*。1. 4 在 ExpressFiveSFM 培养基(Invitrogen)中加入 IL-2 —起培养 48h 后，以单 独表达EGFP蛋白的细胞作为对照，表达PjCaspase与EGFP融合蛋白的细胞作为实验组， 用 Flex Station II microplatereader (Molecular Devices, USA)检测荧光强度，结果见 图1，横坐标表示IL-2的用量，纵轴表示细胞的荧光强度(即IL-2与PjCaspase的结合能 力)，由图可知IL_2能在细胞内与Caspase蛋白有效地结合。2、IL-2对凋亡活性的影响2. 1样本处理取大小勻称对虾20只一组，分别注射生理盐水(100 u L)、WSSV病毒(104拷贝)、WSSV病毒(104拷贝)+IL-2 (剂量为7ng/g体重虾每次，以等量生理盐水溶解)、IL-2 (剂量 为7ng/g体重虾每次，以等量生理盐水溶解)。其中小分子IL-2在WSSV注射前12小时、注 射后0、12、24小时注射，其他组同时补注射同等生理盐水作为对照处理。处理后的对虾在 24、36、48小时取血样。2. 2Caspase 活性检测(1)用500U肝素钠1 1抽取对虾血液。(2)将 caspaseV7 反应底物粉末与反应 Buffer ( Caspase-Glo 3/7assay kit, Promega)混合。(3)将 lOOul 虾血与 lOOul 反应混合液混勻(Caspase-Glo 3/7 assaykit, Promega)。(4) 25 °C下避光温育3小时。(5)用化学发光酶标仪检测化学发光2. 3Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling(TUNEL) 法检测凋亡活性(1)在载玻片上均勻涂布虾血细胞。(2)将载玻片浸入4%多聚甲醛(上海生工)溶液中，4°C固定25分钟。(3)室温下用PBS洗三遍，每次5分钟。(4)2% Triton X-100 预渗 5 分钟。(5)PBS 洗两次。(6)用100 ii L平衡缓冲液(TUNEL试剂盒，Promega)平衡。(7)加入50 ii L rTdT (TUNEL试剂盒，Promega)，湿盒(塑料饭盒内铺满沾水纱布 即可，也可采用上海锐聪产品)中37°C避光温育1小时。(8)加入 2XSSC(TUNEL 试剂盒，Promega)终止反应。(9)PBS 洗三次。(10)以1 ii g/ml PI (上海生工)溶液染色15分钟。(ll)PBS 洗三次。(12)荧光显微镜下镜检。图2为采用生理盐水、WSSV病毒(104拷贝)、WSSV病毒(104拷贝)+IL-2(剂量为 7ng/g体重虾每次，以等量生理盐水溶解)、IL-2 (剂量为7ng/g体重虾每次，以等量生理盐 水溶解)处理的对虾在24、36、48小时所检测到的凋亡活性。由图可知，IL-2极大地提高 了凋亡活性。3、IL-2对病毒复制的影响3.1对虾基因组提取以SQ Tissue Kit (Promega)提取按照2. 1方法处理后的对虾总DNA。3. 2Real-time PCR测定病毒拷贝数合成Taqman 探针并以 b-actin 作对照，50 °C 4min, (95 °C 45s, 52 °C 45s, 72°C 45s)*45个循环。标准曲线由已知浓度的WSSV质粒做出。图3为采用WSSV病毒(104拷贝)、WSSV病毒(104拷贝)+IL-2 (7ng/g对虾，以生 理盐水溶解)、WSSV病毒+IL-2 (0. 7ng/g对虾，以生理盐水溶解)、WSSV病毒+IL-2 (70pg/g对虾，以生理盐水溶解)处理的对虾在36、48小时所检测到的WSSV病毒拷贝数变化。由图可知，IL-2有效抑制了 WSSV在对虾体内的复制。3、死亡率测定取大小勻称对虾20只一组，分别注射生理盐水(100 u L)、WSSV病毒(104拷贝)、 WSSV病毒(104拷贝)+IL-2 (剂量为7ng/g体重虾每次，以等量生理盐水溶解)、IL-2 (剂量 为7ng/g体重虾每次，以等量生理盐水溶解)。其中小分子在WSSV注射前12小时、注射后 0、12、24小时注射，其他组同时补注射同等生理盐水作为对照处理。记录死亡率。图4为采用生理盐水、WSSV病毒、IL-2、WSSV病毒+IL-2处理的对虾在六天内的 死亡率变化。由图可知，IL-2有效降低感染WSSV对虾的死亡率并且对对虾没有毒性，可在 对虾养殖中广泛使用。
权利要求
白细胞介素2(Interleukin-2)在制备抗对虾白斑综合症的制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述白细胞介素2用于制备诱导PjCaspase 蛋白活化的制剂。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述制剂为肌肉注射剂，其中白细胞介素 2的注射剂量为5 lOng/g虾。
全文摘要
本发明提供了白细胞介素2(Interleukin-2)在制备抗对虾白斑综合症的制剂中的应用。Interleukin-2可作用于对虾凋亡途径关键蛋白，因此可利用该小分子制备抗对虾白斑综合症的制剂，可极大地增强对虾对对虾白斑综合症(WSSV)的抵抗力，降低致死率。本发明的有益效果主要体现在本发明所述Interleukin-2可以有效诱导PjCaspase蛋白的活化，极大地增强对虾对对虾白斑综合症(WSSV)的抵抗力，降低致死率；由于Interleukin-2是在人体中广泛使用的提高免疫力的药物，对人体没有毒性，使用Interleukin-2的对虾，无论其是否将药物代谢完全都可以放心食用。
文档编号A61K38/20GK101862444SQ20101019800
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者智斌, 章晓波 申请人:浙江大学