专利名称：黄芩苷在抗细菌感染和预防细菌感染中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，尤其涉及黄芩苷在抗细菌感染及预防细菌感染中的应用。
背景技术：
细菌抗药性的产生限制了人们治疗细菌感染性疾病的能力，对人类健康造成了严 重的威胁。随着多种耐药菌株的不断出现，使传统抗生素对细菌感染性疾病的治疗面临了 很大的挑战。导致多重耐药性病原菌大量涌现的原因一方面由于近些年来人们对抗生素的 盲目滥用，另一方面由于传统抗生素本身的作用机制。由于传统抗生素是以抑制细菌的生 长或生存为作用靶点的，这给细菌本身生存带来了很大的压力，从而导致细菌耐药性的产 生。例如青霉素，氯霉素等。病原菌抗药性的不断蔓延使很多传统抗生素在临床疾病的治 疗上失去了作用，人们对新型抗生素的需求非常迫切。因此寻找新型抗生素是当今生物及 医学界非常紧要的课题之一。细菌的致病力是其感染宿主并导致疾病的能力，而细菌的致病力取决于细菌所产 生的毒性因子及其损伤宿主的作用机制，病原菌通过释放毒素类蛋白破坏宿主细胞的正常 生理功能，甚至导致宿主细胞的死亡。将细菌的致病力作为靶点来开发新型抗生素，通过此 途径可以抑制细菌致病性但对细菌的生长并不产生影响，因此可以较少的引起细菌耐药性 的产生。另外，近年来发现多种细菌都存在群体感应系统，群体感应系统(quorum sensing, QS)是以扩散性小分子为信号物质，依据菌群密度来调控个体基因表达以及群体行为的一 种重要而全面的调控机制。QS系统存在于很多细菌当中，调控范围涵盖了细菌致病因子、细 胞毒素、生物被膜形成等等一系列细菌特征性的表型。所以细菌的群体感应系统相关基因 以及受其调控的下游毒性因子的表达对细菌的致病过程起着关键性作用，与细菌致病力有 着非常重要的关系。因此抑制细菌QS系统及其相关毒性因子的表达，可以在不损害人体自 身正常菌群情况下扩大药物治疗细菌性感染疾病的作用靶点，具有较大的开发潜力。铜绿假单胞菌(PAO)是一种非常重要的机会致病菌，被认为是医院感染性疾病三 大致死菌之一。在人体免疫力低下的情况例如患有慢性疾病的人群，器官移植的病人或大 面积烧伤的病人等等，它能引起各种不同的急性或是慢性感染甚至导致死亡。铜绿假单胞 菌本身存在很高的内在耐药性，而且长期的抗生素治疗环境下使PAO对许多抗生素产生了 严重的耐药性，这使铜绿假单胞菌不仅成为难以治疗的病原菌也使其成为众多研究细菌致 病性和抗药性的对象。中药在我国具有数千年的用药历史，其防治疾病的能力被人们所熟知，中药药材 种类丰富，但其中含有多种未被探究的中药成分和治病机理。现代中药学研究发现多种中 药的化学成分可作为天然抗菌药物来达到抗菌治病的效果，包括多种中药所含有的黄酮类 物质，但其作用机制不为人知。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了黄芩苷不会给细菌本身带来生存压力、产生抗药性的几率小的黄芩苷在抗细菌感染及预防细菌感染中的应用。本发明的技术解决方案是黄芩苷在抗细菌感染及预防细菌感染中的应用。黄芩苷和其衍生物及其作为先导化合物合成出来的修饰物在抗细菌感染及预防 细菌感染中的应用。黄芩苷在抗细菌感染药物及预防细菌感染药物中的应用。黄芩苷在与提高免疫力药物联合用药的预防细菌感染疾病药物中的应用。黄芩苷在预防获得性细菌感染疾病药物中的应用。
黄芩苷在抗革兰氏阴性细菌感染及预防革兰氏阴性细菌感染药物中的应用。黄芩苷在抗具有QS系统的革兰氏阴性细菌感染的药物及预防具有QS系统的革兰 氏阴性细菌感染的药物中的应用。黄芩苷在抗铜绿假单胞菌感染药物及预防铜绿假单胞菌感染药物中的应用。黄芩苷在治疗慢性肺部感染性疾病的药物中的应用。黄芩苷在消除生物被膜的药物的应用。黄芩苷在与抗生素的联合用药的抗细菌感染药物的应用。本发明的优点是本发明从细菌抗致病性物质筛选系统出发，寻找新型抗生素及其作用于细菌的靶 位点。用构建的群体感应抑制物筛体系将中药作为筛选对象发现了黄酮类成分黄芩苷可以 有效地抑制细菌的致病力，黄酮类物质黄芩苷为唇形科植物黄芩的主要化学成分之一。并 且本发明最终发现了天然抗菌药黄酮的分子作用机理，即黄酮类成分黄芩苷通过对细菌群 体感应系统以及其层级调控的毒性因子表达的抑制来削弱细菌的致病性，其在不杀死细菌 本身的前提下可以抑制病原菌的致病力，不会给细菌本身带来生存压力，所以产生抗药性 的几率较小，可以作为新型抗细菌类药物。
图1为黄芩苷的化学分子式；图2为黄芩苷对铜绿假单胞菌群体感应系统7个主要基因及其他毒性基因的抑制 作固体检测结果示意图；图3为黄芩苷对铜绿假单胞菌群体感应系统7个主要基因及其他毒性基因的抑制 作用酶标仪检测结果示意图；图4为黄芩苷对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响示意图；图5为黄芩苷对铜绿假单胞菌绿脓菌素的影响示意图；图6为黄芩苷对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的影响示意图；图7为黄芩苷对铜绿假单胞菌运动能力丛动(a)和涌动(b)的影响示意图；图8为黄芩苷影响细胞毒性示意图；图9为黄芩苷抑制铜绿假单胞菌杀细胞能力示意图。
具体实施例方式本发明提供了黄芩苷在抗细菌感染及预防细菌感染中的应用，尤其是黄芩苷和其 衍生物及作为先导化合物合成出来的修饰物在抗细菌感染及预防细菌感染中的应用，黄芩苷在抗细菌感染药物及预防细菌感染药物中的应用，黄芩苷在与提高免疫力药物联合用药 的预防细菌感染疾病药物中的应用，黄芩苷在预防获得性细菌感染疾病药物中的应用，黄 芩苷在抗革兰氏阴性细菌感染及预防革兰氏阴性细菌感染药物中的应用，黄芩苷在抗具有 QS系统的革兰氏阴性细菌感染的药物及预防具有QS系统的革兰氏阴性细菌感染的药物中 的应用，黄芩苷在抗铜绿假单胞菌感染药物及预防铜绿假单胞菌感染药物中的应用，黄芩 苷在治疗慢性肺部感染性疾病的药物中的应用，黄芩苷在消除生物被膜的药物的应用，黄 芩苷在与抗生素的联合用药的抗细菌感染药物的应用。本发明利用含有荧光素酶(Luciferase)基因(lux-CDABE)为报道子的铜绿假单 胞菌毒性相关因子启动子库为筛选系统，利用固体双层培养基法以及酶标检测仪对传统上 用于“清热解毒”的常用中药的醇提及水提物进行筛选，检测在中药药品存在的条件下铜绿 假单胞菌毒性相关基因表达的变化；并同时检测了在药物作用下铜绿假单胞菌与致病性相 关表型的变化，如胞外蛋白酶，绿脓菌素以及细菌的丛动和涌动等等。发现中药黄芩在不影 响细菌生长的条件的下对铜绿假单胞菌(PAO)致病性有明显的抑制作用，进而发现黄芩有 效成分黄芩苷在不影响细菌生长的条件的下明显抑制PAO的致病力，而传统研究报道黄芩 苷具有杀菌、抗变态反应、降压和镇静、利胆、保肝和解痉等作用。由于对细菌的生存不产生 选择压力，从而可以较少的或避免引起细菌耐药性的产生，黄芩苷可以作为新型抗菌类药 物应用。本发明所提供的技术方案是通过以下方案得到的
实施方案1 细菌抗致病性物质筛选系统的构建。质粒PMS402是带有缺失启动子的报道基 因 lux-CDABE 的载体。毒性相关基因包括 lasR，rhll, rhlR, lasl, exoT, exsD, exoS, oprH, phzAl, phzA2, pilG, fliC, mig4, xcpR, aprA, rnr。基因的启动子区域经 PCR 扩增， 并通过酶切克隆到报道质粒PMS402荧光素酶基因操纵子前，建成的重组质粒分别命名 为 pKD-lasR, pKD-rhll, pKD-rhlR, pKD-lasI, pKD-exoT, pKD-exsD, pKD-exoS, pKD-oprH, pKD-phzA 1， pKD-phzA2, pKD-pilG, pKD-fliC, pKD-migA， pKD-xcpR, pKD-aprA, pKD_rnr。 将重组质粒用PacI酶切后大片段含有lux报道子基因和毒性相关基因的启动子序列，大 小约为8kb左右，同时用PacI酶切质粒CTX6. 1，该质粒可利用噬菌体结合位点进行位点 专一性重组酶切。将纯化好的带有启动子_报道子融合子lux-CDABE片段克隆到CTX6. 1 载体中，得到大小为14kb左右的重组质粒分别命名为pKD-CTX-lasR，pKD_CTX_rhl I， pKD-CTX-rhlR, pKD-CTX-lasI, pKD-CTX-exoT, pKD-CTX-exsD, pKD-CTX-exoS, pKD-CTX-oprH, pKD-CTX-phzAl，pKD_CTX_phzA2，pKD-CTX-pilG，pKD-CTX-fIiC, pKD-CTX-m igA，pKD-CTX-xcpR, pKD-CTX-aprA，pKD-CTX-rnr。将该重组质粒电转化入10B感受态细胞 中培养，以提取大量高浓度质粒，再转入SMlO中，再将含有重组质粒的SMlO与野生型PAOl 进行双亲株杂交，将启动子-报道子的融合体整合于染色体。报道基因lux-CDABE无自身 启动子，表达受QS相关基因启动子的调控，则待测药品对PAO毒性因子的启动子有抑制作 用时，则Iux基因表达也会减弱，即菌体发光减弱；反之，若待测样品对启动子有激活作用， 则菌体发光增强。通过表观上菌体发光的变化可知待测药品对毒性因子表达的影响情况。实施方案2 固体平板筛选
利用双层培养基点滤纸片法进行固体粗筛发现黄芩苷具有抑制铜绿假单胞菌群 体感应系统及其他多个毒性因子表达的作用，其化学分子式如图1所示。在相同条件下，这 些样品对细菌生长基本没有影响，列举黄芩苷对QS相关基因laSR、rhlI、rhlR、和lasl，三 型分泌系统基因exoT，exoS，吩嗪类合成基因phzAl表达的抑制平板检测图，见图2。实施方案3 酶标检测仪法进行液体复筛分析粗筛结果，利用酶标检测仪在96孔板中对各种 中药成份进行复筛，发现黄芩苷，具有抑制铜绿假单胞菌群体感应系统及其他多个毒性因 子发光的作用。参见图3A (a)，抑制效果在含有黄芩苷的浓度为250 μ g/mL时对群体感应Rhl系统 自诱导物合成酶基因rhll表达的抑制作用达到3倍以上；参见图3B(a)对IasR基因表达 的抑制作用达到2倍；参见图3C(a)以及图3D(a)，对rhlR，IasI基因表达的抑制作用不到 2倍；参见图3E (a) J^phzAl基因表达的抑制作用达到8倍以上；参见图3F(a)，对exoS基 因表达的抑制作用达到5倍以上；参见图3G(a)，对exoT基因表达的抑制作用达到2倍；研 究发现黄芩苷对细菌群体感应系统四个基因及其他毒性基因都有明显的抑制作用，另外在 所有黄芩苷实验孔发光发生变化的同时，与对照相比所有生长曲线图表明，黄芩苷对细菌 的生长没有影响，分别参见图3A (b)、图3B (b)、图3C (b)、图3D (b)、图3E (b)、图3F (b)以及 图 3G(b)。实施方案4 黄芩苷对铜绿假单胞菌致病因子表型影响检测铜绿假单胞菌通过产生大量的毒性因子来感染宿主导致宿主致病，而铜绿假单胞 菌的QS系统几乎调节所有的毒性因子的表达，包括蛋白酶(弹性蛋白酶、碱性蛋白酶)，绿 脓菌素，溶血素，胞外酶S，和细胞外毒素A等等。实验所应用的筛选系统的毒性因子包括phzAl、phzA2、lasl、lasR、rhll、rhlR、 fliC、pilG、oprH、aprA> exoS> exoT、exsD、rnr> xcpR、migA，胃巾 lasR> rhlR ^WMx^-M 菌群体感应系统(QS)的上游调控基因和lasl、rhll为信号分子合成的催化酶基因。铜绿 假单胞菌感染宿主入侵组织所必须的多种胞外毒力因子都是受到群体感应系统信号分子 介导的细胞间信号系统的控制，这些调控系统使得铜绿假单胞菌能够以协调的、细胞密度 依赖的方式产生胞外毒力因子，从而战胜宿主的防御系统。另外包括三型分泌系统(T3SS) 相关基因exoS、exoT, exsD ；与细菌运动性相关的fliC、pilG ；细菌的运动能力与细菌在体 内的致病能力有关，也与生物膜的形成有关；吩嗪合成基因PhzAl、phzA2 ；以及与细胞膜蛋 白oprH，通道蛋白xcpR ；相关酶类糖基转移酶migA、核糖核酸酶rnr、碱性蛋白酶aprA，这 些毒性因子的表达对铜绿假单胞菌致病过程起到非常重要的作用。(1)铜绿假单胞菌在宿主体内大多以生物被膜的形式存在，所谓生物被膜指的是 细菌吸附于物质表面时，由细菌和细菌所分泌的胞外多聚物质组成的呈膜状的多菌集合体 (ommunity)结构，为了在其生长或者在感染宿主细胞的过程中，适应生存环境抵抗外界如 抗生素物质的杀伤。许多研究发现，形成生物被膜形式PA菌体相对于以游离形式存在的菌 体细胞，可以大幅度地提高铜绿假单胞菌的抗药性，可以使菌体抵抗外界药物作用以及逃 避宿主机体的免疫系统。具体方案为挑PA单克隆至5mL LB液体培养基，加5μ L稀释的菌 悬液和3 μ L黄芩苷DMSO溶液到DMEM培养基中(96孔板)，最终体积为150 μ L，黄芩苷最终浓度为125 μ g/mL,设置平行实验组(加药)和平行对照组(加DMSO)，37°C、震荡200rpm、 3h，再放置30°C静置培养48h后洗掉孔内液体，然后给每个孔加入150yL 0.5% CV(结晶 紫)溶液，室温下培养5min。洗掉结晶紫后，小心用蒸馏水冲洗掉未结合的结晶紫，在烘箱 中烘干然后向孔中加150 μ L 95%的乙醇溶液，然后在570nm波长处测其吸光值，参见图4， 在药物存在下相比于对照条件下，PA所形成的生物膜量明显减少。(2)绿脓菌素为铜绿假单胞菌分泌的一种重要的破坏细胞、组织的吩嗪类外毒素。 绿脓菌素测定方案挑PA单克隆至5mL LB液体培养基，设置实验组(加药)和对照组(加 DMS0)37°C，震荡200rpm，培养14h。将过夜培养菌液离心，8000rpm离心2分钟，取上清转 入另一离心管中，每5mL上清液中加入3mL氯仿抽提，4500rpm离心8分钟。取下层氯仿层 转入新的离心管中，并加入ImL 0.2N的盐酸混合。充分混勻，离心并收集上层无机相，在 520nm波长处测其吸光值。参见图5，在黄芩苷作用下相比于对照条件下PA所产生的绿脓 菌素量明显减少。(3)铜绿假单胞菌分泌的弹性蛋白酶具有破坏宿主胶原蛋白、弹性蛋白等多种蛋 白质的能力，也是PA导致机体致病的重要因素之一。弹性蛋白酶测定方案挑取PA单克隆 至5mL LB液体培养基中，设置实验组(加药)和对照组(加DMS0)37°C、震荡200rpm、培养 到OD = 2. 0，将培养的菌悬液离心，将上清用0. 2 μ m滤膜过滤，将上清滤液与磷酸缓冲液 2 1 混合(0. IM 6.3PH)加入 2mg /mLelastin Congo red (Sigma)，设置调零组即只有培养 基和刚果红蛋白。混合物37°C，震荡200rpm，培养7d后，离心取上清在495nm下测OD。参 见图6，相比于对照条件在黄芩苷存在下，PA所产生的的弹性蛋白量明显减少。(4)细菌的运动性与细菌的鞭毛密切相关，在细菌致病过程中具有重要的病理学 意义，另外细菌的运动性也与生物膜的形成有关。细菌丛动和涌动能力的测定方案挑取 PA单克隆至5mL LB液体培养基，37°C，震荡200rpm，培养过夜。配制细菌涌动平板和丛动 平板(放置过夜后使用)。待平板分为相等的区域，每个区放置一个直径6mm的滤纸片，将 中药药品冷冻干燥粉末溶于水或者甲醇中，中药纯品溶于DMSO中与菌悬液混合，分别点入 5 μ L的1、1/2、1/4，1/8等一系列稀释浓度的样品溶液，以5 μ L ddH20/甲醇/DMSO作为阴 性对照，参见图7，在药物存在下相比于对照条件下，PA的运动能力明显减弱。实施方案6 MTT法检测黄芩苷细胞毒性以及抑制铜绿假单胞菌杀细胞能力。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加196 μ L (黄芩苷细胞毒性检测)或 191 μ L (黄芩苷抑制铜绿假单胞菌杀细胞能力检测)，铺板使待测细胞密度为IO3-IO4/孔； 5% C02，37°C孵育至细胞铺满孔底(96孔板)，24h后加入4μ L梯度浓度药物或对照加入 等量4 μ L DMSO,黄芩苷抑制铜绿假单胞菌杀细胞能力检测外加5 μ L菌悬液或对照加入 5 μ LDMEM培养基；5 % CO2, 37°C培养16_48h，倒置显微镜下观察；每孔加入20 μ LMTT溶液 (5mg/mL,0. 5% MTT)继续培养4h ；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150 μ L DMSO, 低速震荡lOmin，结晶物充分溶解OD = 490nm处测吸光值，参见图8，细胞毒性实验证明黄 芩苷在浓度250 μ g/mL不影响肝细胞的正常生长，无细胞毒性；参见图9，黄芩苷抑制PA杀 细胞能力检测发现，相比于对照条件在黄芩苷存在下PA杀细胞能力明显被抑制。
权利要求
黄芩苷在抗细菌感染及预防细菌感染中的应用。
2.根据权利要求1所述的黄芩苷和其衍生物及作为先导化合物合成出来的修饰物在 抗细菌感染及预防细菌感染中的应用。
3.根据权利要求1所述的黄芩苷在抗细菌感染药物及预防细菌感染药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的黄芩苷在与提高免疫力药物联合用药的预防细菌感染疾病 药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的黄芩苷在预防获得性细菌感染疾病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的黄芩苷在抗革兰氏阴性细菌感染及预防革兰氏阴性细菌感 染药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的黄芩苷在抗具有QS系统的革兰氏阴性细菌感染的药物及预 防具有QS系统的革兰氏阴性细菌感染的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的黄芩苷在抗铜绿假单胞菌感染药物及预防铜绿假单胞菌感 染药物中的应用。
9.根据权利要求3所述的黄芩苷在治疗慢性肺部感染性疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求3所述的黄芩苷在预防生物膜形成和消除生物被膜的药物的应用。
11.根据权利要求3所述的黄芩苷在与抗生素的联合用药的抗细菌感染药物的应用。
全文摘要
本发明涉及黄芩苷在抗细菌感染及预防细菌感染中的应用，本发明提供了黄芩苷不会给细菌本身带来生存压力、产生抗药性的几率小的黄芩苷在抗细菌感染及预防细菌感染中的应用。
文档编号A61P11/00GK101843631SQ20101020202
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者段康民, 迈克·G·撒瑞特, 郭俏, 黄一农 申请人:西北大学