专利名称：非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了非天然全D-型蛇毒Cathelicidin组成的抗菌肽及其衍生物，本发明还涉及这些肽及其衍生物的制备及其应用，属生物医学领域。
背景技术：
抗菌肽是存在于生物体内能抵抗外界微生物侵害的一类小分子多肽，它是先天免疫系统的重要组成部分。抗菌肽通常由15 45个氨基酸残基组成，大部分带正电荷。抗菌肽广泛地分布在两栖类、昆虫、植物和哺乳动物中。与目前广泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多优点如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物活性；不易产生耐药性；热稳定、水溶性好；对局部感染和全身感染都有效等。由于抗生素耐药性和残留问题的日益突出，抗菌肽作为一种抗生素的替代物备受关注。绝大多数抗菌肽分子含有较多的碱性氨基酸残基，因此又被称为阳离子抗菌肽， 自然界也存在少数含有较多酸性氨基酸残基的阴离子抗菌肽。抗菌肽具有广谱抗微生物活性，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌和被膜病毒都有抑杀作用，特别对一些耐药菌， 如伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌等同样敏感。其作用机制主要是带正电的抗菌肽与带负电的微生物细胞膜发生作用，按作用特点可分为膜结构破坏型和非膜结构破坏型。在当前不少病原菌对原有抗生素逐步产生耐药性的情况下，加强对动物体内自然产生的抗菌肽功能的了解，并在此基础上设计新型的抗菌肽以替代抗生素的研究有着重要的理论和实际意义。蛇毒Cathelicidin是主要在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族，成熟抗菌肽位于前体分子的C-末端，具有很高的变异性。目前发现的天然存在的蛇毒蛇毒 Cathelicidin抗菌肽分子是由L-型氨基酸残基组成的，因分子中含有较多的碱性氨基酸残基而易受到各种蛋白酶的降解，影响了它们的抗菌活性。
发明内容
本发明的目的是提供不易被蛋白酶降解的非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒 Cathelicidin抗菌肽及其衍生物，本发明同时提供非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的制备方法，本发明还提供非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用。非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒 Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。其显著特点在于耐受各种蛋白酶的降解，抗菌活性保留时间长，无药物残留。可以应用于人或动物感染性疾病的预防和治疗、抗肿瘤、临床人工生物材料、食品防腐及果蔬保鲜、饲料添加剂以及日化用品中。为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案
非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽，所述抗菌肽具有以下序列SEQ ID NO 1 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys AsnSer Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val lie Gly Val Ser lie Pro Phe)；本发明的非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的衍生物，所述衍生物是非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的氨基酸残基突变物，所述衍生物均为D-型氨基酸组成并符合以下序列之一SEQ ID NO :2:赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys AsnSer Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val lie Gly Val Thr Phe Pro Phe)； SEQ ID NO :3:赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Lys SerVal Lys Lys Arg Ala Lys Glu Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val lie Gly Val Ser lie Pro Phe)；本发明的非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的衍生物，所述衍生物是来源于非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的片段的变异体，所述衍生物本身全部由D-型氨基酸残基组成并符合以下序列之一SEQ ID NO 4 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Lys Ala Val Lys Lys GlyPhe Lys Lys Phe Ala Lys Val)；SEQ ID NO :5:甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(Gly lie Gly Lys Phe Phe Lys Lys LeuLys Lys Phe Val Lys Lys Gly Phe Lys Lys Phe Ala)；SEQ ID NO 6 苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸(Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe PheLys Lys Phe)；SEQ ID NO :7 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys LysPhe Phe Lys)。非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的制备方法采用全自动多肽合成仪合成全部由D-型氨基酸残基组成的抗菌肽全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法O^astatombombardment mass spectrometry, FAB-MS)。所述抗菌肽及其衍生物可用于制备人或动物抗微生物感染药物。所述抗菌肽及其衍生物用于抗肿瘤药物药物的制备。所述抗菌肽及其衍生物在临床人工生物材料中的应用，所述临床人工生物材料可以是但不局限于医用高分子生物材料、医用金属材料、医用生物复合物、医用生物衍生材料和医用凝胶。所述抗菌肽及其衍生物在食品防腐及果蔬保鲜中的应用。所述抗菌肽及其衍生物在饲料添加剂中的应用。所述抗菌肽及其衍生物在日化用品中的应用，所述日化用品可以是但不局限于 化妆品；洗手液、沐浴露、卫生巾、剃须膏、须后水等卫生用品；漱口水、口腔喷剂、牙膏、含片和口腔糖等口腔保健品。非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物作为制备抗微生物物质的应用。本发明以天然存在的蛇毒Cathelicidin抗菌肽为模板，设计合成了非天然全 D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物，在保留了抗菌活性的同时，不易受到蛋白酶的降解，有效延长了作用时间。本发明的抗菌肽全部为D-型氨基酸残基组成，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶以及弹性蛋白酶的降解，在抗微生物活性方面与天然爬行动物蛇毒Cathelicidin抗菌肽及衍生物存在差异。非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用。与其它来源抗菌多肽相比，该组抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点，尤其是具有抵抗蛋白酶水解作用的显著特点，可更长时间保持抗微生物活性，无药物残留。
具体实施例方式实施例1非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的制备1、分别用全自动多肽合成仪利用不同D-型氨基酸残基为原料合成非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。2、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，以甘油间硝基苄醇二甲亚砜(1 1 1, V V V，体积比) 为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1 μ Α,发射电压为25Kv。3、纯化的蛇毒抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法。所合成非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的序列如下所示 0H-CATH30-D(SEQ ID NO 1)赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys LysArg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val lie Gly Val Ser lie Pro Phe) ；NN-CATH30-D(SEQID NO 2) 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Asn Ser Val Lys LysArg Ala Lys Lys Phe Phe Lys Lys Pro Lys Val lie Gly Val Thr Phe Pro Phe) ；BF-CATH30-D(SEQ ID NO 3) 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸((Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Lys Ser Val Lys LysArg Ala Lys Glu Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val lie Gly Val Ser lie Pro Phe)CATH20-D(SEQ ID NO 4)赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Lys Ala Val Lys Lys Gly Phe Lys LysPhe Ala Lys Val)；CATH21-D(SEQ ID NO 5)甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸(Gly lie Gly Lys Phe Phe Lys Lys Leu Lys Lys Phe ValLys Lys Gly Phe Lys Lys Phe Ala)；FK-12-D(SEQ ID NO 6)苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸(Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys LysPhe)；KF-12-D(SEQ ID NO 7)赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys Lys Phe PheLys)。实施例2非天然全D-型蛇毒Cathelicidin抗菌肽或其衍生物的抑制细菌生长的作用抗菌活性检测，按常规倍比稀释法进行。96孔板每空加菌液90μ1，(终浓度 106CFU/ml)，每孔设3个复孔，以pH7. OLB培养基(每升含10克胰蛋白胨，Oxoid公司生产， 5克酵母提取物，Oxoid公司生产和10克氯化钠，国产分析纯试剂)为阴性对照。加入不同浓度的用无菌超纯水配制的抗菌肽 ο μ 1，使终浓度成倍比下降。37°C孵育14-16小时，测定各孔600nm的吸光度，吸光度无变化的最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。此试验重复三次，取平均值，结果如表1。表1，非天然全D-型抗菌肽抑制微生物生长的作用
权利要求
1.一种非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽，其特征在于所述抗菌肽为选自序列表SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列SEQ ID NO 1 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。
2.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的衍生物，其特征在于所述衍生物是权利要求1所述肽的氨基酸残基突变物，所述衍生物本身全部由D-型氨基酸残基组成并符合以下序列之一SEQ ID NO 2 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-天冬酰氨-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸；SEQ ID NO 3 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸；
3.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽的衍生物，其特征在于所述衍生物是来源于权利要求1所述肽的片段的变异体，所述衍生物本身全部由D-型氨基酸残基组成并符合以下序列之一SEQ ID NO 4 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-缬氨酸；SEQ ID NO :5 甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸；SEQ ID NO :6 苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸；SEQ ID NO :7 赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸。
4.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的制备方法，其特征在于采用固相化学法合成。
5.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于所述抗菌肽及其衍生物可用于制备人或动物抗微生物感染药物。
6.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于所述抗菌肽及其衍生物用于抗肿瘤药物药物的制备。
7.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于所述抗菌肽及其衍生物在临床人工生物材料中的应用，所述临床人工生物材料可以是但不局限于医用高分子生物材料、医用金属材料、医用生物复合物、医用生物衍生材料和医用凝胶。
8.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于所述抗菌肽及其衍生物在食品防腐及果蔬保鲜中的应用。
9.非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于所述抗菌肽及其衍生物在饲料添加剂中的应用。
10.权利要求1-2所述非天然全部由D-型氨基酸残基组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用，其特征在于所述抗菌肽及其衍生物在日化用品中的应用，所述日化用品可以是但不局限于化妆品；洗手液、沐浴露、卫生巾、剃须膏、须后水等卫生用品；漱口水、口腔喷剂、牙膏、含片和口腔糖等口腔保健品。
全文摘要
本发明提供不易被蛋白酶降解的非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的序列及制备方法，本发明还提供非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物的应用。非天然全D-型氨基酸组成的蛇毒Cathelicidin抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对临床耐药细菌有很好的抑制作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。其显著特点在于耐受各种蛋白酶的降解，抗菌活性保留时间长，无药物残留。可以应用于人或动物感染性疾病的预防和治疗、临床人工生物材料、食品防腐及果蔬保鲜、饲料添加剂以及日化用品中。
文档编号A61P35/00GK102311492SQ201010222328
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者张云, 李文辉, 李盛安, 赵峰 申请人:中国科学院昆明动物研究所