专利名称：知母皂苷biii的医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物提取物的用途，具体涉及一种从中药知母中提取分离的有效成分 知母皂苷BIII在制备治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术：
糖尿病是由于人体内胰岛素绝对或相对缺乏而引起的一种临床常见病，血中葡萄 糖浓度升高，进而糖大量从尿中排出，并出现多饮、多尿、多食、消瘦、头晕、乏力等症状。进 一步发展则引起全身各种严重的急、慢性并发症，威胁身体健康。其中I型糖尿病患者完全 失去产生胰岛素的功能，依赖胰岛素治疗切需终身使用；II型糖尿病患者体内胰岛素处于 相对缺乏状态，不必完全依赖胰岛素而可以用其它药物治疗。在糖尿病患者中，II型糖尿 病占了大多数。糖尿病是现代社会中的常见病、高发病，严重威胁人类的健康和生命。目前，西医治疗糖尿病的主要方法为胰岛素治疗和口服磺脲类、双胍类等降血糖 药物，但胰岛素治疗价格昂贵，而其它类型药物或疗效有限，或毒副作用明显。近年来，大量 研究表明，中药在II型糖尿病的临床治疗中显示出很大优势，但现有中成药大多有效成分 不清，作用机理不明，剂型落后，急待开发出有效成分和作用机理清楚、质量稳定可控、剂型 先进、服用携带方便的中药制剂。α -葡萄糖苷酶又叫α -D-葡萄糖苷水解酶，它是小肠内麦芽糖、蔗糖的水解酶。 饮食中的碳水化合物在α-葡萄糖苷酶的作用下，释放葡萄糖并经小肠吸收进入血液，是 餐后血糖升高的主要原因，而餐后高血糖可引起胰岛素敏感性降低从而加重病情并导致一 系列并发症，因此找到合适的酶抑制剂，对防治糖尿病及其并发症将有重要的意义。抑制 α -葡萄糖苷酶活性，可减缓葡萄糖的生成和吸收，降低血糖水平。中药知母清热泻火，生津润燥，主要具有抗菌、抗病毒、解热、降血糖等作用。到 目前为止，已有了知母总苷、知母皂苷AIII和芒果苷抗糖尿病方面的活性，对知母皂苷 BIII 的活性报道较少，Hiroyuki Kodama 在其文章Effect of six steroidal saponins isolated from anemarrhenae rhizoma on platelet aggregation and hemolysis in human blood, Clinica Chimica Acta, 1999(289) :79_88中报道了它对人体血小板聚合 以及溶血方面的影响。但还未见知母皂苷BIII [(3 β，5 β，25S)-26-0-β-D-吡喃葡萄糖 基-呋留-20 (22)-烯-3，26-二醇-3-0-β-D-吡喃葡萄糖基(1 — 2)-0-β-D-吡喃半乳 糖苷]治疗糖尿病方面的报道。对于知母皂苷BIII的提取分离方法已有如下报道马百平报道了知母皂苷B的提取工艺知母中呋甾皂苷的研究，药学学报，1996， 31 (4) :271-277，该方法先以溶剂提取，再以硅胶柱层析，所得的混合物需要用制备型 HPLC反复分离、纯化，得知母皂苷B (该化合物即知母皂苷Bill)。
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Hiroyuki Kodama 也报道了 该化合物的分离方法Effect of six steroidal saponins isolated from anemarrhenae rhizoma on platelet aggregation and hemolysis in human blood, Clinica Chimica Acta，1999，289 :79_88，该方法也是先以溶 剂提取，再分别用大孔树脂柱、硅胶柱层析，所得产品再用HPLC分离，即得知母皂苷Bill。以上两种方法均采用了溶剂提取、柱层析分离以及HPLC分离制备的方法。但HPLC 分离方法只适用于实验室，不能满足于工业上的应用。本发明制备方法相对简单，用结晶等 工艺操作代替了 HPLC制备，向工业化生产更迈进了一步。
发明内容
本发明的目的在于提供一种知母皂苷BIII的制备方法，该方法采用化学途径从 中药知母中分离出有效成分——知母皂苷Bill。本发明的另一目的在于提供上述知母皂苷BIII的医药用途，经体内、外药理试 验，提供该化合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。本发明所涉及的知母皂苷BIII结构如下，该化合物分子式为C45H74O18，分子量为 902，化学名为(3β，5β，25S)-26-0-i3-D-吡喃葡萄糖基-呋甾-20 (22)-烯-3，26-二 醇-3-0-β -D-吡喃葡萄糖基(1 — 2)-0-β-D-吡喃半乳糖苷。 为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案本发明公开的知母皂苷BIII的制备方法，其步骤如下1)取知母药材，用C6 C3tl的脂肪烃溶剂渗漉脱脂，干燥；2)对上述脱脂后产物用C1-C5醇回流提取，过滤，合并滤液，减压蒸馏除去溶剂， 得知母浸膏；3)将步骤2)中所得的浸膏以水混悬，并用水饱和的C4 C8的醇萃取，除去溶剂， 干燥；4)将上述步骤3)中所得的产物用硅胶柱层析，先以氯仿洗脱，然后用氯仿_正丁 醇洗脱，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶剂至干；5)将步骤4)中所得样品又一次通过硅胶层析柱进行分离，以氯仿_甲醇为洗脱剂 洗脱，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶剂，得知母皂苷BIII粉末；6)将上述干燥粉末用C1 C5的醇进行重结晶，得知母皂苷Bill。
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上述制备方法步骤2)中，原料与C1 C5醇的重量比为1 5 20 ；步骤3)中， 原料与水的重量比为1 0.5 3. 5，原料与C4 C8的醇的重量比为1 0.5 3. 5;步 骤4)中，氯仿-正丁醇的体积比为20 1 1 1 ；步骤5)中，氯仿-甲醇的体积比为 10 1 1 1。上述制备方法中，步骤1)中所述的脱脂溶剂优选汽油或石油醚；步骤2)中所述 的提取溶剂优选50 90%乙醇；步骤3)中所述的萃取溶剂优选正丁醇；步骤6)中所述的 C1 C5的醇优选甲醇或乙醇。本发明采用上述方法提取得到的知母皂苷BIII首先进行常规的体内、体外药效试验。1.体外α-葡萄糖苷酶抑制实验。本实验主要是通过体外观察该化合物对α -葡萄糖苷酶抑制率来得出其抑制效^ ο结果表明，本发明药物在体外抑制α -葡萄糖苷酶的活性与阳性对照药拜糖平相 近，可在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中应用。2.体内葡萄糖耐量试验葡萄糖耐量是衡量糖代谢的主要指标之一，进食后一定时间内血糖可以恢复到基 础值，而患病鼠在相同时间内血糖不能恢复到基础值。本实验以小鼠为模型，通过测定给糖前和给糖后的血糖值来进行测试。以正常的 禁食不禁水的小鼠为空白对照组，以经口给予蒸馏水和蔗糖的小鼠为模型对照组，对模型 对照组的小鼠分别给药，所用药物为知母皂苷ΒΙΙΙ，通过测定几组不同时间小鼠的血糖值 来进行体内实验。结果表明，本发明药物可显著降低ICR小鼠给糖前和给糖后的血糖值，明 显改善其糖负荷，可在制备治疗糖尿病药物中应用。本发明的有益效果该发明中知母皂苷BIII的制备方法相对简单，用一些结晶等工艺操作代替了 HPLC制备，向工业化生产更迈进了一步。同时，糖尿病是影响人类健康的非常严重的疾病， 但目前还没有治疗II型糖尿病的特效药物，该化合物在体内外表现出了很好的抗糖尿病 活性，并且为首次发现，不仅开拓了其应用领域，也有可能成为未来治疗糖尿病的有效药 物。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。实施例1 知母皂苷BIII的提取分离方法。取知母药材5. 0千克，汽油渗漉脱脂，干燥。以25升85%乙醇回流提取三次，每次 回流2小时，过滤，合并滤液。减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得知母浸膏1千克。将浸膏以6升水混悬，用水饱和过的4升正丁醇萃取四次。将正丁醇层回收、干 燥，得浸膏135克。用甲醇拌样进行硅胶柱(2700克，160-200目)层析。先以氯仿洗脱，至 色淡为止；然后用氯仿-正丁醇(1 1)洗脱。TLC检测，展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水 (4:1: 5)上层。以10%磷钼酸乙醇IlOoC为显色剂，合并含知母皂苷BIII的流分，回 收溶剂至干，得浸膏23克。将该浸膏继续通过硅胶层析柱进行分离，以氯仿-甲醇(5 3)为洗脱剂洗脱，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶剂，得粉末3克。将上述干燥粉末用甲醇溶解、结晶，得白色颗粒状固体。继续用甲醇重结晶，得知 母皂苷Bill。经HPLC面积归一法测定该化合物的纯度为90%。其波谱数据如下 知母皂苷BIII白色无定型粉末。Liebermann-Burchard反应和Molish反应均呈 阳性。HRESIMS (positive mode)m/z 925. 4766 [M+Na]+ (calcd. 925. 4773)； 1HNMR(400MHz,批啶 _d5) δ 5. 37 (1Η, d, J = 7. 8Hz, H_l”)，4· 87 (1H，d, J = 7. 6Hz, H-Γ )，4· 77 (1H, d, J = 7. 6Hz, H_l”，)，1. 62 (3H, s, H—21)，0· 94 (3H, d, J = 6. 8Hz, Η-27)，0·91(3Η，s，H-19)，0· 67 (3H，s，H-18) ； 13C 匪R(100MHz，吡啶 _d5) : δ 152. 2 (C-22)， 106. Ο(Ο-Γ') , 105. 1 (C-l”，)，103. 5 (C-20)，102. 5 (C-Γ )，84. 5(C_16)，81· 7(C_2，)， 78. 4 (C-5 ”)，78. 4 (C-3 ”)，78. 4 (C-5 ”)，77. 9 (C-3 ”)，76. 9 (C-3，)，76. 5 (C-5，)，75. 5 (C-2 ”)， 75. 1 (C-2，” ) , 75. 1 (C-3)，75. 1 (C-26) ,71. 6 (C-4，，),71. 6 (C-4，” ) ,69. 7 (C-4，)， 64. 5 (C-17)，62. 6 (C—6”)，62. 6 (C—6”，) ,62. 1 (C—6，)，54. 6 (C—14)，43. 7 (C—13)，41. 0 (C—9)， 40. 9 (C-12)，36. 8 (C-5)，35. 1 (C-8)，35. 1 (C-10)，34. 3 (C-23)，33. 6 (C-25) ,31. 3 (C-15)， 30. 8 (C-I)，30. 8 (C-4)，26. 7 (C-2)，26. 7 (C-6)，26. 7 (C-7)，23. 9 (C-19)，23. 5 (C-24)， 21. 2 (C-Il)，17. 1 (C-27)，14. 3(C_18)，11. 8(C_21).实施例2 知母皂苷BIII的提取分离方法。取知母药材5. 0千克，石油醚渗漉脱脂，干燥。以40升甲醇回流提取三次，每次回 流2小时，过滤，合并滤液。减压回收溶剂，浓缩至无醇味，得知母浸膏1.2千克。将浸膏以10升水混悬，用水饱和过的10升正戊醇萃取四次。将正戊醇层回收、干 燥，得浸膏150克。用甲醇拌样进行硅胶柱(2700克，160-200目)层析。先以氯仿洗脱，至 色淡为止；然后用氯仿-正丁醇(5 1)洗脱。TLC检测，展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水 (4:1: 5)上层。以10%磷钼酸乙醇为显色剂，合并含知母皂苷BIII的流分，回收溶剂 至干，得浸膏24克。将该浸膏继续通过硅胶层析柱进行分离，以氯仿-甲醇(6 1)为洗 脱剂洗脱，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶剂，得粉末3. 1克将上述干燥粉末用乙醇溶解、结晶，得白色颗粒状固体。继续用甲醇重结晶，得知 母皂苷Bill。经HPLC面积归一法测定该化合物的纯度为87%。实施例3 体外抑制α -葡萄糖苷酶活性试验
a)试剂与仪器α -葡萄糖苷酶(EC 232-604-7)，购于美国Sigma公司，pNPG (4硝基苯-α -D-吡喃葡萄糖苷)(EC 223-189-3)，购于Sigma公司无水碳酸钠、磷酸盐等，均为分析纯。酶标仪BI0-TECKInstruments，美国产。b)试剂配制磷酸缓冲液(67mM，PH6. 8)称量适量的K2HPO4 · 3H20溶液，用磷酸调至pH 6. 8，
4°C保存待用。酶液称取适量的α -葡萄糖苷酶冻干粉用67mM，PH6. 8磷酸缓冲液稀释，浓度 0. 5mg/ml，0. 5ml 一管分装，_20°C冻存。底物PNPG 用磷酸缓冲液(67mM，PH6. 8)配成29mM α -PNPG,，分装，_20°C保存。反应终止液用蒸馏水配制IM Na2CO3,4°C保存。c)操作步骤中药抑制活性的测定反应系统为67mM磷酸盐缓冲液(PH = 6. 8) 145ul，0. 5mg/ml α -葡萄糖苷 酶5ul，适当浓度的药物稀释液20ul，37°C孵育lOmin，加入0. 029M pNPGlOul，37°C孵育 lOmin，加入IOOul IM Na2CO3,405nm检测在酶的作用下释放出硝基苯酚的量。空白孔缓冲液+酶液+底物+终止液。
空白对照孔缓冲液+终止液。反应孔缓冲液+酶液+药物+底物+终止液。反应对照孔缓冲液+酶液+药物+终止液。读数96孔板用酶标仪测405nm处的OD值。d)数据处理a 空白孔；b 空白对照孔；c 反应孔；d 反应对照孔。抑制率(%) = [l-(c-d)/(a-b)] X100%知母皂苷BIII对α -葡萄糖苷酶的抑制活性如表1所示。表1 知母皂苷BIII对α -葡萄糖苷酶的抑制活件 结果表明知母皂苷BIII在体外α _葡萄糖苷酶的抑制活性与阳性对照药拜糖平 相近。实施例4 体内对正常ICR小鼠糖耐量的影响试验a)实验材料实验动物清洁级ICR小鼠160只，体重23士2g，雄性，由中科院上海实验动物中 心供应，动物质量合格证SCXK (沪)2003-0003号。
强生稳豪型血糖仪，强生稳豪型血糖试纸，LIFESCAN公司生产。蔗糖，分析纯AR，中国医药(集团)上海化学试剂公司生产。b)试验条件SPF级ICR小鼠实验饲养室，温度23 士 1°C，湿度50_70%，噪音··< 50dB，光照 150-200Lx, 12小时明暗交替(早6:00-晚18:00)，自由饮食。c)试验剂量、途径与体积100mg/Kg,灌胃给试剂体积为0. 3ml，蔗糖0. 2ml,阳性药物0. 1ml。d)试验方法正常ICR小鼠禁食不禁水15小时，分成四组。其中一组小鼠禁食不禁水，作为空 白对照组；其余三组小鼠经口给予蒸馏水和蔗糖蔗糖2. 5g/kg，作为模型对照组。对模型对 照组的小鼠分别灌胃给药，一组所用药物为知母皂苷BIII，另外一组所用药物为拜糖平，余 下一组作为对照。分别测定给葡萄糖后0、30、60、120min的血糖值，观察各组给葡萄糖后各 时间点血糖曲线下面积的变化情况。知母皂苷BIII在体内对正常ICR小鼠糖耐量的影响如表2所示。表2 知母皂苷BIII对正常ICR小鼠糖耐量的影响(χ士S) 注与模型对照组比较广P < 0.01血糖曲线下面积=1/4X (Omin血糖值+2X30min血糖值+3X60min血糖值 +120min血糖值)。结果显示知母皂苷BIII可显著降低ICR小鼠给糖前和给糖后的血糖值，明显改 善其糖负荷。见表2。
权利要求
一种具有如下结构的知母皂苷BIII在制备治疗糖尿病药物中的应用FSA00000207636700011.tif
2.权利要求1所述的知母皂苷BIII在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及知母皂苷BIII的医药用途，具体涉及一种从中药知母中提取分离有效成分知母皂苷BIII在制备治疗糖尿病药物中的应用。同时经体内、外药理试验证明，该化合物对α-葡萄糖苷酶具有显著抑制活性，并可有效降低动物血糖，可在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂和治疗糖尿病的药物中应用。本发明的知母皂苷BIII化合物在体内外表现出了很好的抗糖尿病活性，不仅开拓了其应用领域，也有可能成为未来治疗糖尿病的有效药物。
文档编号A61K31/7048GK101879178SQ20101023857
公开日2010年11月10日 申请日期2007年5月16日 优先权日2007年5月16日
发明者唐意红, 孙兆林, 施松, 朱海燕, 李志雄, 范明松, 赵维民, 马春辉, 黄成钢 申请人:中国科学院上海药物研究所