一种新型疫苗佐剂及应用的制作方法

专利名称：一种新型疫苗佐剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗佐剂及其制备方法，特别涉及一种新型的水包油疫苗佐剂及其制备方法，又称一种SPOl佐剂，用于不同类型抗原的疫苗制备，用于不同年龄人群、动物免疫接种所需疫苗佐剂。
背景技术：
随着现代生物技术的迅速发展，裂解疫苗、重组亚单位疫苗、抗独特型抗体疫苗、 核酸疫苗及合成肽疫苗等得到开发。这些疫苗抗原纯度高，相对分子量小，疫苗的不良反应低，然而这些抗原的免疫原性和免疫保护性普遍较弱，为了提高抗原的有效性，必须在抗原中添加佐剂以增强它们诱导免疫反应的能力。佐剂与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型。其功能主要有使用部位招揽免疫细胞和免疫分子，增强免疫应答；增强疫苗抗原传递；增进免疫接触；增强弱抗原的免疫原性和免疫记忆，如高度纯化的抗原或重组抗原；减少抗原接种剂量和接种次数；促进疫苗在免疫应答能力弱的群体中的免疫效果；加快免疫应答的速度和延长持续时间；改变抗原的构型；改变体液抗体的种类、IgG亚类和抗体的亲和性，以及细胞免疫和黏膜免疫效应。理想的佐剂不仅没有免疫原性并能增强机体的免疫应答，更能使机体获得最佳的保护性免疫和免疫记忆。铝佐剂是目前普遍被批准用于人类疫苗的主要佐剂，自1拟6年Glermy首先应用铝盐吸附白喉类毒素至今已广泛应用于疫苗，有磷酸铝和氢氧化铝两种铝盐佐剂。但是铝佐剂以体液免疫应答为主，不能诱导细胞免疫和黏膜免疫应答效应，特别是近几年发现多次使用出现免疫抑制和累积中毒而使用受限，并且对一些疫苗抗原无效，有些出现注射部位偶有严重的局部反应出现红斑皮下结节接触性过敏和肉芽肿性炎症，因此寻找新的疫苗佐剂成为疫苗学的重大现实问题。此后，1997年欧洲国家批准水包油MF59、virosomes佐剂上市，其产生的抗体效价比铝佐剂安全性高、效果好，而且兼顾产生一定细胞免疫效应， 是铝盐被批准使用70年后第一个被允许用于人体的疫苗佐剂。随后2005年在Montanide W/0水包油佐剂中加入维生素E制备的AS03 ；2007年在MPL中加入铝盐制备的AS04佐齐IJ， 均在欧洲上市。这类佐剂通过注射接种增强疫苗抗原的免疫原性，诱导特异的抗体反应，激发Thl型细胞因子(IFN-y、IL-2等)产生较强的CTL反应。除此以外，许多其他新型佐剂也层出不穷，比如MPL、PolyI C、免疫刺激复合物、CPG-OPN疫苗佐剂等，均有各自的优势和不足。因此发展寻求新的安全的佐剂已成为迫求需求。特别是既用于注射又能用于黏膜、 透皮免疫佐剂越来越为人们所重视，至今还没有，并成为今后佐剂发展的重要领域。非注射免疫疫苗在抵御气溶胶感染多种重大传染病病预防方面发挥了重要作用， 具有巨大的发展潜力和应用前景，这已是不争的事实。然而，在发展黏膜、透皮非注射免疫疫苗过程中最大的障碍是寻找安全、高效的疫苗佐剂系统。佐剂是疫苗产品的主要成分，在新型疫苗设计中具有重要作用，它通过与抗原同时或预先应用，能够增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型。佐剂作用的确切机制未明，据报道与下列因素有关，延长抗原滞留时间；减少抗原接种剂量和接种次数；促进疫苗在免疫应答能力弱的群体中的免疫效果；加快免疫应答的速度和延长持续时间；增强免疫细胞激活所需要的协同刺激信号；诱生肉芽肿(富含巨噬细胞)的形成促进T细胞激活；刺激淋巴细胞非日特异性增殖等。因此，针对新发、突发重大传染病黏膜疫苗及疫苗通用技术平台急需开发新型的通用型黏膜免疫佐剂，以增强黏膜疫苗的免疫应答和免疫保护效果，同时减少疫苗的接种剂量和接种次数。非注射免疫疫苗在抵御气溶胶感染多种重大传染病病预防方面发挥了重要作用。 鼻免疫系统广泛而复杂，它是呼吸道的开始，处于中耳、眼、口腔抵抗抗原物质的枢纽位置， 有保护下呼吸道的作用；它可对远处黏膜如泌尿生殖道、胃肠道免疫反应也能起到免疫应答保护。黏膜免疫系统区别于全身系统免疫的特征是天然防护的形成机制，一定数量独特淋巴细胞集群的存在，起源于黏膜组织的细胞对黏膜和外分泌腺的聚集以及对非危险抗原反应抑制的优先诱导。同样皮肤是疫苗免疫的一个理想部位，表皮中富含郎格罕斯细胞及皮下、肌肉中富含树突状抗原提呈细胞，形成独特强有力的免疫识别、应答和效应网络。 通过皮肤机体能有效接触外来抗原产生系统免疫应答和粘膜免疫应答的双重效应，从而达到全面免疫保护效果，并且抗原与提呈细胞直接接触大大降低抗原用量，以及微针矩阵 (microneedle arrays)、透皮(pacth)贴剂非注射免疫使得抗原大面积散布在黏膜、皮肤免疫组织中有更多机会被抗原细胞利用，诱发产生系统免疫与黏膜免疫及细胞免疫应答，从而提高免疫保护效果的优势，这是有针注射免疫不能并寐的。因此需要提高疫苗的安全性、耐受性、免疫原性和免疫保护性就要在靶向局部和系统同时提高全面免疫应答和效应反应。目前，越来越多的纯化的具有良好特性的疫苗与佐剂结合，并试图提高成人、儿童及老年人特殊人群，以及动物的免疫原性。所以，筛选制备具有体液免疫与细胞免疫、黏膜免疫与系统免疫以及天然免疫与获得性免疫应答的疫苗佐剂是很有必要
发明内容

用。
本发明的目的在于提供一种新型疫苗佐剂，另一个目的在于提供其制备方法及应
本发明目的是通过如下技术方案实现 本发明疫苗佐剂的原料组成为 角鲨烯
聚氧乙烯蓖麻油聚醚缓冲液
本发明疫苗佐剂的原料组成优选为 角鲨烯2. 5%-10%
聚氧乙烯蓖麻油0.1^-5%
聚醚0.1%-5%
缓冲液加至100%
本发明疫苗佐剂的原料组成优选为
2. 0% -12. 5% 0. 05% -10% 0. 05% -10% 加至100%
角鲨烯聚氧乙烯蓖麻油
5. 0%
0. 25% -0. 5% 0. 25% -0. 5% 加至100%聚醚缓冲液其中所述的原料百分比是w/v的关系；其中所述的缓冲液是去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液中的一种。其中所述的角鲨烯(Squalene)属开链三萜，又称鱼肝油萜，其中文的化学名称是角鲨烯或(全E)-2，6，10，15，19，23-六甲基_2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯，其英文名称是 Squalene 或 6,10,14,18, 22-Tetracosahexaene, 2,6,10,15,19, 23-hexamethyl-, (all-Ε)-2 或(e, e, e, e)-squalene 或 14, 18, 22-tetracosahexaene,2,6,10,15,19, 23-hexamethyl-(all-e)-10 或 spinacen。其 CAS :111-02-4,分子式=C30H50,分子质量 410. 72，沸点285°C，熔点-75_286°C，来源于动物、植物提取或化学合成。其中所述的聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylenated castor oil)是非离子型表面活性剂，主要起乳化作用。HLB值13，浊点85°C，商品名称是乳化剂EL。其中所述的聚醚(poly ethylene glycol block-poly propylene glycol block-polyethylene glycol)又称聚乙二醇醚，关于聚醚的配方是以环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷和四氢呋喃等为原料，在催化剂作用下开环均聚或共聚制得的线型聚合物。本发明疫苗佐剂简称为SPOl佐剂。取上述原料，按照常规工艺制成疫苗佐剂。本发明疫苗佐剂的制备方法为取原料使用勻浆机制备初乳，勻浆条件为转速5000rpm-15000rpm，时间 I-IOmin ；或者使用超声波来制备初乳，超声5-10次，45s/次，初乳的粒径为x1(1 = 1612. 39 士 10nm，x5(l = 1969. 24 士 10nm，x9(l = 2401. 49 士 10nm，SMD = 1946. 88 士 10nm，VMD = 1992. 92士 IOnm(见图1)；均质初乳均质条件为压力5000-8000psi，5_8个循环，测量其粒径为 Xltl = 197. 10 士 10nm，X50 = 240. 37 士 10nm，X90 = 292. 69 士 10nm，SMD = 237. 53 士 IOnm, VMD = 243. 16士 10nm，(见图2)，再次均质，均质条件压力8000_15000psi，5-8个循环， 测量其粒径为 Xltl = 125. 12 士 10nm，X50 = 155. M±10nm，X90 = 193. 14 士 10nm，SMD = 153. 30士 lOnm，VMD = 157. 78士 IOnm(见图3)，制备成乳白色的疫苗佐剂制剂后，缓冲液选择去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液中的一种，采用0. 22μπι滤器过滤除菌，即得。佐剂电镜图片(见图4、图5)。其中所述的勻浆条件优选为转速6000rpm，时间2-5min，或者用超声波来制备初乳时优选超声6-8次。其中制备初乳、均质初乳以及再次均质时粒径的测量方法为常规测量方法。本发明疫苗佐剂可以是溶液所形成胶体或微球，颗粒大小均勻，粒径在 90nm-200nm之间，平均粒径150nm左右；本发明水包油疫苗佐剂，可与各种抗原如灭活全病原体、裂解病原提取组分、细菌囊泡、荚膜多糖或多糖结合蛋白、重组蛋白、重组VLP、DNA或 RNA核酸等混勻，制备不同类型的疫苗，其中所述疫苗按照常规工艺，加入常规辅料，制成药学上可接受的注射剂、微针矩阵剂、喷鼻剂、透皮贴剂等各种剂型，其中所述疫苗适用于不同年龄人群、不同动物的免疫接种。本发明是一种安全有效且稳定的SPOl疫苗佐剂，能够招揽抗原注射部位或黏膜部位免疫细胞和免疫分子聚集，增强特异性细胞免疫和体液免疫应答效应，可调节抗体对抗原的亲和性与专一性；同时可以通过注射或黏膜等途径免疫，且黏膜途径免疫与注射疫苗免疫相比，黏膜接种疫苗具有成本低，给药方便，避免交叉感染，安全性高的特点；本发明的SPOl疫苗佐剂可适用于儿童、老年人、孕妇等特殊群体，以及各种动物的免疫接种；并且没有复杂结构，工艺简单，适宜大批量生产产业化。


图 1 制备初乳的粒径:x10 = 1612. 39nm, X50 = 1969. 24nm, X90 = 2401. 49nm, SMD =1946. 88nm, VMD = 1992. 92nmm ；图 2 均质初乳的粒径:χ10 = 197. IOnm, X50 = 240. 37nm, X90 = 292. 69nm, SMD = 237. 53nm, VMD = 243. 16nm ；图3 :再次均质初乳的粒径:x10 = 125. 12nm,x50 = 155. 54nm，x90 = 193. 14nm, SMD =153. 30nm, VMD = 157. 78nm ；图4、图5:佐剂电镜图片下述实验例和实施例用于进一步证明但不限于本发明。实验例1 SPOl佐剂的安全性实验1、无菌、支原体试验将实施例1制备的SPOl佐剂接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养14d，并以无菌生理盐水做阴性对照，培养温度为25°C、35°C。结果显示， SPOl疫苗佐剂未见细菌生长。将SPOl佐剂分别用半流体和肉汤培养基，37°C初代培养21 天，次代培养21天，无菌生理盐水做阴性对照，结果显示SPOl佐剂无支原体生长；用DNA染色法将毒种接种Vero细胞后培养3天，传代一次，用二苯甲酰胺荧光染料染色，结果显示疫苗佐剂无支原体生长。2、溶血性试验选取体重为350g左右的豚鼠，采集新鲜豚鼠血1ml，用PBS洗涤3次，再将血细胞体积恢复并稀释10倍。PBS稀释SPOl佐剂(SP01佐剂由实施例1制备)，分别为2倍、4 倍、8倍，将豚鼠血细胞加入到稀释的待检佐剂中，8小时后，评价血球溶解以目测或者上清浓度检测为准，并在570nm处检测吸光度。结果显示，没有发生血球破裂，无溶血现象。说明SPOl佐剂中的成分不能使红细胞裂解。因此，SPOl疫苗佐剂无溶血反应。3、急性毒性试验取实施例1制备的SPOl佐剂0. 5ml腹腔注射体重为12 18g Balb/C小鼠，每组 10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察小鼠的活动状态、体重变化和存活率。结果表明，实验小鼠全部存活，没有出现竖毛、精神萎靡、行动迟缓等不良症状，而体重呈现增加， 由此证明新型佐剂在试验的浓度下对动物是安全的，且14天后处死进行大体解剖检查，未见脏器有病理改变。在体重为8 IOkg的Beagle狗体内的急性毒性结果取实施例1制备的SPOl佐剂肌肉或腹腔注射15ML，每组10只，同时设PBS阴性对照组，连续2周观察行为、体重和存活率变化。结果可见，Beagle狗未见毒性反应，行为正常，没有死亡，与对照组狗比较无差异，各狗体重有所增加，并处死大体解剖未见脏器有明显的病理改变。根据此结果换算成人用剂量，例一个50公斤的成年人，可使用SPOl的最大安全剂量是50ml-100ml。因此，SPOl疫苗佐剂在动物、人体体内无急性毒性反应，使用是安全的。4、最大致死量试验分别取实施例1制备的SPOl佐剂200ul、500ul、1000ul、1500ul腹腔注射体重为12 18g Balb/C小鼠，每剂量组5只，连续2周观察小鼠的死亡情况。由试验可得出 200ul、500ul组小鼠没有出现任何异常状态，饮食睡眠行动均很正常，体重增加；IOOOul组小鼠在注射后两天内体重平均下降l_2g左右，5天后体重开始上升，没有其它异常现象。 取小鼠肺、脾、肾、肝等内脏制备病理切片，发现IOOOuI组小鼠肺部和肝部有散在出血点。 1500ul组小鼠在腹腔注射M小时内陆续死亡。结果1500ul佐剂是小鼠的最大致死剂量。5、过敏试验研究取实施例1制备的SPOl佐剂皮下接种体重为250 350g Hartley豚鼠，每个样品接种豚鼠5只，每只接种0. 5ml，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳静脉给予相同 SPOl佐剂0. 5ml，并用人血白蛋白和生理盐水以同样的方法分别接种3只豚鼠作为阳性、阴性对照。注射后30分钟及3天观察动物，阳性、阴性对照均成立，SPOl佐剂组豚鼠无死亡， 且无鼻痒、喷嚏、烦躁不安、呼吸困难、休克、痉挛等过敏症状。因此，SPOl疫苗佐剂在动物体内无过敏反应。6、兔热源质试验取预检合格的体重为2 3kg家兔3只固定，30分钟后测量体温，共测2次，间隔30分钟，要求2次温差不大于0. 2°C，各家兔2次平均温度在38. 6-39. 5°C。将实施例1 制备的SPOl疫苗佐剂预热至38°C，于第2次测温后15分钟内，自家兔耳边静脉缓缓注入 0.5ml/只。注射后每隔30分钟测量体温1次，连测6次。结果显示SPOl佐剂给予家兔个体升温未超过0. 2°C，3只家兔升温总和未超过0. 4°C，没有引起家兔的发热反应。因此，制备的SPOl佐剂无热源质。7、血管刺激性研究取实施例1制备的SPOl佐剂通过肌肉注射或喷鼻给体重为18g Balb/C小鼠、2 3. 5kg恒河猴、50Kg人体，每次500ul，每日2次，连续5日，结果鼻腔或肌肉注射Balb/C小鼠、恒河猴、人体表现正常，没有不适等反应，与给生理盐水组无明显变化；Balb/C小鼠、恒河猴鼻腔、气管和肺脏，以及注射部位病理切片显微镜检未见有炎性浸润、血管周围组织出血及坏死等刺激现象。因此，制备的SPOl佐剂无明显血管刺激性、黏膜刺激性。8、长期毒性研究分别将低(0. 5ml)、中(Iml)、高(2ml)剂量的SPOl佐剂肌肉注射体重为250 300g的成年大鼠和8 IOkg的Beagle犬，每天注射一次，连续给药1个月，观察其体重和体表变化、精神状态、食欲、睡眠情况及血液中细胞变化情况，连续观察三个月。结果显示是反复给药后高剂量组的大鼠体重在停药给药21天两周内出现下降，精神不振，食欲不佳， 体重下降，并停止注射SPOl佐剂后很快恢复正常；其余低中剂量两组连续注射30天体重没有出现明显的波动，精神状态良好，食欲和睡眠情况没有明显变化。由此，SPOl佐剂中、低
7剂量给与Beagle犬没有长期毒性。9、代谢降解性研究采用放射性131I-标记结合分子排阻高效液相(SHPLC)和TCA酸沉淀放射性测定研究I-标记物在体重为3. 5 5kg猕猴血清中浓度、代谢降解变化及时间过程；及总放射性在尿、粪排泄物中的排泄量和时间过程，研究SPOl佐剂在体外与血浆蛋白结合的情况。其中SPOl佐剂由实施例1方法制备；(1)选取健康猕猴3只，皮下注射125I-SPOl佐剂0. 2ml,收集给药前以及给药后 0. 5、l、2、4、8、12、M、48、72、96、120h静脉血，血清加入等量20% TCA沉淀蛋白，测定总γ 放射性，结果见表1。(2)选取健康猕猴3只，皮下注射125I-SPOl佐剂0. &ι1，喂其标准饲料，自由饮水， 注射后12、48、72、120、168和19 分别收集尿和粪，测定γ放射性，计算排出放射性占注入放射性量的百分数，结果见表2。表1给药后不同时间检测静脉血中总Y放射性
[006权利要求
1.一种新型疫苗佐剂，其特征在于该疫苗佐剂的原料组成为角鲨烯 2%-12. 5% 聚氧乙烯蓖麻油0.05%-10%聚醚 0.05%-10% 缓冲液加至100%。
2.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于该疫苗佐剂的原料组成为角鲨烯 2. 5%-10%聚氧乙烯蓖麻油0.1%-5%聚醚 0.1^-5% 缓冲液加至100%。
3.如权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于该疫苗佐剂的原料组成为角鲨烯5%聚氧乙烯蓖麻油0. 25%-0. 5%聚醚 0.25%-0.5%缓冲液加至100%。
4.如权利要求1-3任一所述的疫苗佐剂，其特征在于其中所述的缓冲液是去离子水、 生理盐水、磷酸盐缓冲液或柠檬酸钠缓冲液中的一种。
5.如权利要求1-3任一所述的疫苗佐剂的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤取原料使用勻浆机制备初乳，勻浆条件为转速5000rpm-15000rpm，时间I-IOmin ；或者使用超声波来制备初乳，超声5-10次，45s/次，初乳的粒径为X10 = 1612. 39士 lOnm，X50 =1969. 24 士 10nm，X90 = 2401. 49 士 10nm，SMD = 1946. 88 士 10nm，VMD = 1992. 92 士 IOnm ； 均质初乳均质条件为压力5000-8000psi，5-8个循环，测量其粒径为x1(1 = 197. 10士 10nm， X50 = 240. 37 士 10nm，X90 = 292. 69 士 10nm，SMD = 237. 53 士 10nm，VMD = 243. 16 士 10nm，再次均质，均质条件压力8000-15000psi，5-8个循环，测量其粒径为x1(1 = 125. 12士 10nm，X50 =155. 54 士 10nm，x9。= 193. 14 士 10nm，SMD = 153. 30 士 10nm，VMD = 157. 78 士 10nm，制备成乳白色的疫苗佐剂制剂后，缓冲液选择去离子水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或柠檬酸钠缓冲液中的一种，采用0. 22 μ m滤器过滤除菌，即得。
6.如权利要求5所述的疫苗佐剂的制备方法，其特征在于其中所述的勻浆条件为转速6000rpm，时间2-5min，或者用超声波来制备初乳时超声6_8次。
7.如权利要求1-3任一所述的疫苗佐剂在制备疫苗中的应用。
8.如权利要求4所述的疫苗佐剂在制备疫苗中的应用。
9.如权利要求1-3任一所述的疫苗佐剂在与各种抗原制备不同类型的疫苗中的应用。
10.如权利要求4所述的疫苗佐剂在与各种抗原制备不同类型疫苗中的应用。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述各种抗原为灭活全病原体、裂解病原提取组分、细菌囊泡、荚膜多糖或多糖结合蛋白、重组蛋白、重组VLP、DNA或RNA核酸。
12.如权利要求10所述的应用，其特征在于所述各种抗原为灭活全病原体、裂解病原提取组分、细菌囊泡、荚膜多糖或多糖结合蛋白、重组蛋白、重组VLP、DNA或RNA核酸。
13.如权利要求9所述的应用，其特征在于其中所述的疫苗，按照常规工艺，加入常规辅料，制成药学上可接受的注射剂、微针矩阵剂、喷鼻剂、透皮贴剂各种剂型。
14.如权利要求10所述的应用，其特征在于其中所述的疫苗，按照常规工艺，加入常规辅料，制成药学上可接受的注射剂、微针矩阵剂、喷鼻剂、透皮贴剂各种剂型。
15.如权利要求9所述的应用，其特征在于其中所述的佐剂疫苗适用于不同年龄人群、 不同动物的免疫接种。
16.如权利要求10所述的应用，其特征在于其中所述的佐剂疫苗适用于不同年龄人群、不同动物的免疫接种。
全文摘要
本发明公开了一种新型疫苗佐剂(又称SPO1疫苗佐剂)及其制备方法，本发明疫苗佐剂主要由角鲨烯、聚氧乙烯蓖麻油和聚醚组成，可以通过注射或喷鼻、透皮非注射等途径免疫，且非注射接种疫苗具有成本低，给药方便，避免交叉感染，安全性高的特点；本发明SPO1疫苗佐剂可与灭活全病原体、裂解病原提取组分、细菌囊泡、荚膜多糖或多糖结合蛋白、重组蛋白、重组VLP、DNA或RNA核酸等不同类型抗原制备疫苗，可适用于不同年龄段人群、不同动物疫苗制备及免疫接种；并且没有复杂结构，工艺简单，便于制备和除菌，成本低，适宜大批量生产产业化。
文档编号A61K9/107GK102370977SQ20101024797
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者刘春环, 刘永祥, 唐冲, 杨鹏辉, 王希良, 王铖, 罗德炎, 赵忠鹏, 邢丽 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所, 赤峰博恩药业有限公司