专利名称：Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物，其制备方法、含它们的药物组合物、其修饰前体及其在治疗II型糖尿病等疾病中的用途。
背景技术：
Exendin-4 是一种从南美产毒蜥(Gila monster ；Heloderma suspectum)的唾液分泌物中分离和鉴定出的天然产物。其序列为Hisl-Gly-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leuio-Ser-Lys-Gln-Met-Glui5-Glu-Glu-Ala-Val-Arg2o-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly3o-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39-NH2 的三十九肽，Exendin-4 是胰高血糖素样肽-Kglucagon-like ρ印tide-1，GLP-1)的类似物。是GLP-1受体激动剂， 能激活GLP-I受体，具有控制甘油酯、促进胰岛素分泌、降低循环胰高血糖素、提高胰β _细胞质量、抑制胃的排空、减少营养的摄入、增加胰岛素敏感性等生物活性。Exendin-4可模拟体内自然分泌的激素，从而帮助人体调节血糖水平，而且在患者不需要的时候，就会停止该作用。Exendin-4的另一特点是可以恢复制造胰岛素的β细胞的第1时相分泌。第1时相分泌指的是由摄取食物而引发的胰岛素分泌，而对于II-型糖尿病患者而言，在患病初期就已经丧失了该反应能力。Exendin-4不但能够降低血糖，而且还能加强正在丧失功能的细胞机能，对II-型糖尿病治疗而言是一项重大进步。Exendin-4于2005年4月获美国FDA批准，用于改善使用二甲双胍和磺酰脲类药物不理想的II型糖尿病患者的血糖控制。临床结果显示，Exendin-4用于糖尿病治疗效果明显，且副反应较小，但是每天两次的皮下给药给病人带来很多不便。Exendin-4的效能及其内在独特的血糖依赖性作用机制使其更适宜制成缓释制剂，Amylin公司于2000年5月又和Alkermes公司签约合作开发品缓释型注射剂 Exendin-4LAR,目前已完成II期临床试验，结果显示，15周后该药物的两种剂量水平都能很好耐受，并且Exendin-4的血药浓度均达到了预期的治疗范围。同时由于Exendin-4在 II-糖尿病治疗机理方面具有明显优势，开发其长效类似物也是很多国外制药公司研发热
；ο研究表明，多肽类药物经聚乙二醇(PEG)修饰后仍能保持好的生物活性，并能显著延长生物体内的半衰期。目前，已有对Exendin-4进行PEG修饰的研究报道，分别得到的三个位点His1、Lys12, Lys27的氨基PEG修饰产物，在大鼠的代谢研究中发现，代谢半衰期远长于 Exendin-4 (Jin Zhou 等，Eur. J Pharma. Biopharm.，2009，72 :412_417)。此外，还报道了对Exendin-4中Lys12和Lys27的ε -氨基进行脂肪酸或石胆酸或透明质酸修饰，分别得到单修饰和双修饰的修饰物(Su Young Chae 等，J Control. Release, 2010,144 (1) :10_16 ； JControl. Release, 2010,142 :206_213 ；Biomaterials, 2010, 31 :4121_4128)。然而，本领域技术人员理解，不论是用PEG对Exendin-4进行修饰，还是用脂肪酸、 石胆酸或透明质酸对Exendin-4进行修饰，均存在修饰位点专一性较差的问题，从而可能造成产物呈不同单位点修饰物共存的混合物形式，或者可能造成产物呈不同多位点修饰物共存的混合物形式，这对于后续的制药应用是不利的。因此，仍然期望提供一种可以对Exendin-4定位修饰并仍然保持Exendin-4生物学活性的方法以及Exendin-4修饰物例如PEG修饰物，以克服目前对Exendin-4进行修饰例如PEG化修饰时专一性差的问题。
发明内容
本发明要解决的问题是以克服目前对Exendin-4进行修饰例如PEG化修饰时专一性差的缺点，提供一种可以对Exendin-4定位修饰并仍然保持Exendin-4生物学活性的方法以及Exendin-4修饰物例如PEG修饰物。本发明人令人惊奇地发现，对Exendin-4肽链中的个别氨基酸替换为其它氨基酸，得到Exendin-4类似物，这些类似物在进行PEG的化学修饰时具有优良的反应专一性。而且，本发明人发现，本发明Exendin-4类似物经PEG修饰后，其PEG修饰产物可具有GLP-I受体激动活性。本发明基于上述发现而得以完成。发明概述本发明第一方面提供了具有以下式(I)所示的Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰物PEG-M-X- (Ex-4)(I)或其可药用盐，其中各符号如本文所述。本发明第二方面提供了以下式(II)所示的Exendin-4类似物[Aap] Exendin-4(II)其中各符号如本文所述。本发明第三方面提供制备本发明第一方面所述聚乙二醇修饰物的方法。本发明第四方面提供了制备本发明第二方面所述Exendin-4类似物的方法。本发明第五方面提供本发明第一方面任一项所述聚乙二醇修饰物在制备药物中的用途。本发明第六方面提供一种组合物，其包括预防和/或治疗有效量的本发明第一方面所述聚乙二醇修饰物以及任选的药学可接受的载体。本发明第七方面提供本发明第二方面所述Exendin-4类似物在制备本发明第一方面所述聚乙二醇修饰物中的用途。本发明第八方面提供了在有需要的受试者中激活GLP-I受体的方法以及治疗相关疾病或症状的方法。本发明第九方面提供作为GLP-I受体激动剂等或者疾病或症状的预防和/或治疗剂的本发明第一方面所述聚乙二醇修饰物。本发明第十方面提供了用于在有需要的受试者中激活GLP-I受体的组合物，或者用于预防和/或治疗与GLP-I受体活性低下相关的疾病和/或症状的组合物，其包含本发明第一方面所述聚乙二醇修饰物。发明详述本发明第一方面提供了具有以下式(I)所示的Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰物PEG-M-X-(Ex-4)(I)
或其可药用盐，其中，PEG 表示 RO (CH2CH2O)n_CH2CH2-，其中 R 为 H 或 CH3, η 为 25-2500 的整数；M表示一N:O或 O 各自的氮或硫原子一侧与
权利要求
1.式(I)所示的Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰物 PEG-M-X-(Ex-4)(I) 或其可药用盐，其中，PEG 表示 RO (CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中 R 为 H 或 CH3, η 为 25-2500 的整数； OM或 O 各自的氮或硫一S-CH2-CH2-HO-NH,原子一侧与PEG部分连接，另一侧与X部分的巯基连接； X-(Ex-4)表示具有如下结构的Exendin-4类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Aa21-Aa22-Aa23-Glu-Trp-Leu-Aa27-Asn-Gly-Gly-Aa31-Ser-Ser-Gly-Ala-Aa36-Aa37-Aa38-Ser-NH2,其中Aa21、Aa22、Aa23、Aa27、Aa31、Aa36、Aa37 和 Aa38 各自独立地是选自下列的氨基酸Cys、Thp、 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr> Val，并且 Aa21、A3-22 Λ A&23、A&27、 Aa31^Aa36, Aa37 和 Aa38 中只有一个为 Cys 或 Thp ； X表示在X- (Ex-4)所示的Exendin-4类似物中，位于21、22、23、27、31、36、37或38位HS的任一个位点并且为半胱氨酸或4-巯基脯氨酸(Thp，)的氨基酸，该氨基酸的巯I O基与M基团连接。
2.式(I)所示的Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰物 PEG-M-X-(Ex-4)(I)或其可药用盐，其中，PEG表示分子量为1，000至100，000的聚乙二醇； O各自的氮或硫I原子一侧与PEG部分连接，另一侧与X部分的巯基连接； X- (Ex-4)表示His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Leu21-Phe22-Ile23-Glu-Trp-Leu-Lys27-Asn-Gly-Gly-Pro31-Ser-Ser-Gly-Al B-Pro36-Pro37-Pro38-Ser-NH2 中第 21、22、23、27、31、36、37 或 38 位氨基酸中的任一个被半胱氨酸或4-巯基脯氨酸(Thp，V^Y.)取代的三十九肽；ι οX表示在Χ-(Εχ-4)所示的三十九肽中，位于21、22、23、27、31、36、37或38位的任一个位点并且为半胱氨酸或4-巯基脯氨酸(Thp，""ζ^γ)的氨基酸，该氨基酸的巯基与M基I O团连接。
3.根据权利要求1的聚乙二醇修饰物，其中η为50-2000的整数、50-1500的整数、 50-1000的整数、75-1500的整数、75-1000的整数、75-500的整数、或100-500的整数。
4.根据权利要求2的聚乙二醇修饰物，其中所述PEG表示分子量为1，000至100，000、 2，000 至 80，000,3, 000 至 60，000,4, 000 至 60，000,5, 000 至 60，000,3, 000 至 50，000、 4，000 至 40，000,4, 000 至 30，000、或 5，000 至 20，000 的聚乙二醇。
5.根据权利要求1-4任一项的聚乙二醇修饰物，其中所述X-(Ex-4)表示具有如下结构的 Exendin-4 类似物His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln_Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Aa21-Aa22-Aa23-Glu-Trp-Leu-Aa27-Asn-Gly-Gly-Aa31-Ser-Ser-Gly-Ala-Aa36-Aa37-Aa38-Ser-NH2, ^ψ Aa21 > Aa22> Aa23> Aa27> Aa31 > Aa36> Aa37 禾口 Aa38 各自独立地是选自下列的氨基酸Cys、Thp、Leu、Phe、lie、Lys、Pro,并且 Aa21、Aa22、Aa23, Aa27、Aa31、 Aa36, Aa37和Aa38中只有一个为Cys或Thp。
6.根据权利要求5的聚乙二醇修饰物，其中所述Aa21可选自Cys、Thp、Leu，所述Aa22 可选自Cys、Thp、Phe，所述Aa23可选自Cys、Thp、IIe，所述Aa27可选自Cys、Thp、Lys，所述 Aa31 可选自 Cys、Thp、Pro，所述 Aa36 可选自 Cys、Thp、Pro，所述 Aa37 可选自 Cys、Thp、Pro, 所述 Aa38 可选自 Cys、Thp、Pro ；前提条件是,Aa21 > Aa22> Aa23> Aa27> Aa31 > Aa36> Aa37 禾口 Aa38 中只有一个为Cys或Thp。
7.根据权利要求1-6任一项的聚乙二醇修饰物，其中所述X表示在X-(Ex-4)所示的 Exendin-4类似物中，位于21、22、23、31、36、37或38位的任一个位点并且为半胱氨酸或 4_巯基脯氨酸的氨基酸。
8.根据权利要求7的聚乙二醇修饰物，其中所述X表示在X-(Ex-4)所示的Exendin-4 类似物中，位于21、22、23、31、36、37或38位的任一个位点并且为半胱氨酸的氨基酸。
9.根据权利要求7的聚乙二醇修饰物，其中所述X表示在X-(Ex-4)所示的Exendin-4 类似物中，位于31、36、37或38位的任一个位点并且为4-巯基脯氨酸的氨基酸。
10.根据权利要求1-9任一项的聚乙二醇修饰物，其是Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物或其可药用盐。
11.根据权利要求1-9任一项的聚乙二醇修饰物，其是Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物或其可药用盐，并且其中所述的聚乙二醇修饰为单聚乙二醇修饰。
12.根据权利要求1-11任一项的聚乙二醇修饰物，其选自 [Cys21 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4,[Cys22 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys23 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys31 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys36 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys37 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Cys38 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Thp31 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Thp36 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Thp37 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4, [Thp38 (mPEG5000-MAL) ] Exendin-4,禾口[Cys31 (mPEG20000-MAL) ] Exendin-4， 或其药学可接受的盐。
13.式(II)所示的Exendin-4类似物 [Aap] Exendin-4 (II)其中，Exendin-4 表不His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Al a-Val-Arg-Leu21-Phe22-Ile23-Glu-Trp-Leu-Lys27-Asn-Gly-Gly-Pro31-Ser-Ser-Gly-Al B-Pro36-Pro37-Pro38-Ser-NH2 的三十九肽；Aap表示取代Exendin-4所示三十九肽ρ位的氨基酸，其选自半胱氨酸(S卩，Cys)或4-巯基脯氨酸(即，Thp、
14.根据权利要求13的Exendin-4类似物，其中Aap表示取代Exendin-4所示三十九肽ρ位的半胱氨酸； ρ表示Exendin-4所示三十九肽的21、22、23、31、36、37或38位。
15.根据权利要求13的Exendin-4类似物，其中Aap表示取代Exendin-4所示三十九肽ρ位的4-巯基脯氨酸； P表示Exendin-4所示三十九肽的31、36、37或38位。
16.根据权利要求13-15任一项的Exendin-4类似物，其选自 [Cys21] Exendin-4,[Cys22] Exendin-4, [Cys23] Exendin-4, [Cys31] Exendin-4, [Cys36] Exendin-4, [Cys37] Exendin-4, [Cys38] Exendin-4, [Thp31] Exendin-4, [Thp36] Exendin-4, [Thp37] Exendin-4，和 [Thp38] Exendin-4 ο
17.制备权利要求1-12任一项所述聚乙二醇修饰物的方法，其包括使发明第二方面任一项所述Exendin-4类似物与PEG-M反应的步骤。
18.权利要求1-12任一项所述聚乙二醇修饰物的用途，其为 在制备作为GLP-I受体激动剂的药物中的用途；在制备用于预防和/或治疗与GLP-I受体活性低下相关的疾病和/或症状的药物中的用途；在制备用于控制甘油酯、促进胰岛素分泌、降低循环胰高血糖素、提高胰β-细胞质量、抑制胃的排空、减少营养的摄入、增加胰岛素敏感性的药物中的用途；在制备用于预防和/或治疗与糖代谢相关的疾病和/或症状的药物中的用途； 在制备用于预防和/或治疗II型糖尿病、肥胖和/或肥胖症、β细胞功能低下等糖代谢疾病的药物中的用途；和/或在制备用于控制II型糖尿病患者体内血糖的药物中的用途。
19.一种组合物，其包括预防和/或治疗有效量的权利要求1-12任一项所述聚乙二醇修饰物以及任选的药学可接受的载体。
20.权利要求13-16任一项所述Exendin-4类似物在制备权利要求1_12任一项所述聚乙二醇修饰物中的用途。
全文摘要
本发明涉及Exendin-4类似物的定位聚乙二醇化修饰物及其用途。特别地，本发明涉及式(I)所示的Exendin-4类似物的聚乙二醇修饰物或其可药用盐，其中各符号如说明书所述。本发明还涉及式(II)所示的Exendin-4类似物其中各符号如说明书所述。本发明进一步涉及所述聚乙二醇修饰物的制备方法、其用途、包含其的组合物、以及所述Exendin-4类似物用于制备所述聚乙二醇修饰物的用途。通过本发明可以使聚乙二醇专一性地定位修饰于Exendin-4类似物的肽链中并且修饰物具有有益的生物学活性。PEG-M-X-(Ex-4) (I)[Aap]Exendin-4 (II)。
文档编号A61P3/10GK102397558SQ201010276918
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者刘克良, 梁远军, 许笑宇 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所