专利名称：一种f基因型腮腺炎减毒活疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及腮腺炎减毒活疫苗，更具体地说，本发明涉及将分离得到的F基因 型腮腺炎减毒毒种，接种于人二倍体细胞(KMB17株)并进行后续工艺处理及冻干技 术，制备的腮腺炎减毒活疫苗。
背景技术：
腮腺炎病毒(mumps virus，MuV)是引起流行性腮腺炎的病原体。依据其SH 抗原上核苷酸的差异，腮腺炎病毒可分为A-L共12个基因型。随着近年来国内在腮腺 炎流行毒株方面的分子流行病学分析的深入，日益增加的资料均表明，目前在我国流行 的腮腺炎病毒株主要为F基因型；与此同时，我们主要使用的减毒活疫苗为国际通用的 Jeryl-Lyim株培育得到的S79株，其基因为国外流行的A基因型。越来越多的研究者发 现MuV的特异性免疫在不同基因型之间是存在差别的，即使用同一疫苗对不同基因型病 毒的感染会产生不同的保护效果。这可能也是尽管已在大范围人群内使用了疫苗，流行 性腮腺炎近年来仍呈现一种高发态势的可能原因。2005年至今，腮腺炎的病例数均高居 全国丙类传染病报告数的第二位。针对以上流行病学的实际情况，研究开发具有主要流 行倾向并具有较好免疫原性的F基因型腮腺炎减毒活疫苗，具有重要的现实意义。
其次，目前常规使用的S79株及Jeryl-Lyrai株减毒活疫苗均为鸡胚细胞上制备， 而鸡胚细胞作为一种异源性细胞基质，可能带来诸如过敏反应以及携带传染性禽逆转录 病毒等程度轻重不等的副反应。而人源性细胞基质(人二倍体细胞)具有能够充分鉴定 和标准化的优点，可实现细胞种子库系统，建立的细胞库可多年用于生产，有利于质量 控制；并且二倍体细胞理论上不存在致肿瘤的潜在危险性。因而，无论从理论上还是应 用上看，使用人二倍体细胞作为细胞基质制备的腮腺炎减毒活疫苗，可以避免采用鸡胚 细胞作为细胞基质可能带来的危害，将具有更实际的应用价值。
之前本申请人曾进行过关于《F基因型腮腺炎减毒毒种及其用途》的专利申 请，在该申请中，主要涉及到的是减毒毒种的研究，包括了毒种的制备、毒种减毒性状 的观察、毒种免疫原性的分析、安全性的分析及种子库的建立；而未将该毒种进一步研 发成为F基因型的腮腺炎减毒活疫苗，而只有将减毒毒种进一步制备为减毒活疫苗，才 能起到真正的预防控制流行性腮腺炎疾病的作用，而发挥其实际的意义。由此，本发明 与前申请《F基因型腮腺炎减毒毒种及其用途》的区别及不同点就在于将前申请中所涉 及的F基因型腮腺炎减毒毒种经后处理加工及冻干工艺后研制成为F基因型腮腺炎减毒活 疫苗，从而可用于流行性腮腺炎疾病的预防或治疗。发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用人二倍体细胞作为细 胞基质的流行基因型(F基因型)腮腺炎减毒活疫苗。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
A.本发明提供了一种腮腺炎减毒活疫苗的毒种，保藏编号为CGMCC No .3579。 其包括原始种子、主种子和工作种子三个库；具有序列表所示的结构和特征。
B.本发明提供了一种人用腮腺炎减毒活疫苗。
C.本发明提供了所述减毒活疫苗的制备方法，该方法采用下列步骤
1.根据KMB-17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第细胞，弃 去培养液；
2.按接种量0.1-0.25moi将病毒种子稀释于不含血清的细胞维持液中，不经吸附 直接接种于前述单层细胞。置37°C培养7 9天，
待细胞完全病变后，收集收获液；
3.将病毒收获液以5000rpm 30min离心去除细胞碎片；
4.加入等量的冻干保护剂至上述离心后的病毒原液中，冻干保护剂配方为 (2X)蔗糖8%、海藻糖8%、甘氨酸2%、右旋糖酐2%、人白蛋白1%、精氨酸 0.2%,谷氨酸钠1%。
5.分装并进行冻干，冻干后即为所需的腮腺炎减毒活疫苗。
D.本发明减毒活疫苗在预防腮腺炎疾病中的应用
将本发明的腮腺炎减毒活疫苗免疫恒河猴后，SP-A株减毒活疫苗能诱导产生良 好的体液免疫效应，其免疫后不同时间点的中和效价均明显优于S79株减毒活疫苗。并 且，SP-A株腮腺炎减毒活疫苗与S79株腮腺炎减毒活疫苗在实验动物体内所诱导的免疫 反应均具有免疫保护效果，并具有在野毒株的攻击下能够保护所有被免疫个体的能力。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
1.提供了一种使用KMB-17人二倍体细胞基质制备的F基因型腮腺炎减毒活疫 苗的生产制备方法，该疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。
2.提供了一种不含明胶的冻干保护剂，以保证腮腺炎减毒活疫苗具有外观好、 水分低以及良好稳定性的特点，取得了实质性的进展和重要突破。
保藏生物材料的说明
本发明所涉及的毒种，已2010年01月12日在位于中国北京市朝阳区北辰西路 1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，分类命名 为腮腺炎病毒，保藏编号为CGMCC Na .3579。
图-1 SP-A株减毒活疫苗与S79株减毒活疫苗免疫后的中和抗体效价比较 图；具体实施方式
通过借助以下实施例将更加详细地说明本发明。需要指出的是，以下实施例仅 仅是说明性的，本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。
实施例1
——病毒原液的培养及收获
用腮腺炎疫苗毒种第M代工作种子按0.1-0.25moi稀释于不含血清的细胞维持液 中，不经吸附直接接种于单层KMB17细胞。置37°C培养7 9天，待细胞完全病变后，收集收获液。将所收获病毒原液进行5000rpm 30min离心去除细胞碎片。
实施例2
——腿腺炎减毒活疫苗半成品的制备
使用MEM营养液稀释病毒原液至5.0 lgCCID50/ml，加入等量冻干保护剂，即 为半成品。冻干保护剂配方为OX)蔗糖8%、海藻糖8%、甘氨酸2%、右旋糖酐 2%>人白蛋白1%、精氨酸0.2%、谷氨酸钠
实施例3
——腿腺炎减毒活疫苗病毒原液、半成品的检测
(1)、病毒原液均为无异物、无沉淀的澄清液体，无菌检测、支原体检测均应为 阴性，无异常毒素，且病毒滴度需大于5.0 lgCCID50/ml (见表-1)。
表-1 病毒原液的检测结果
权利要求
1.一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗，其特征在于该减毒活疫苗的毒种，保藏编号 为CGMCC N2 .3579 ；其包括原始种子、主种子和工作种子三个库，具有序列表所示的结 构和特征。
2.权利要求1所述减毒活疫苗的制备方法，其特征在于该方法采用以下步骤(1)根据KMB-17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB-17细胞，弃去培养液；(2)按接种量0.1-0.25moi将病毒种子稀释于不含血清的细胞维持液中，不经吸附直 接接种于前述单层细胞。置37°C培养7 9天，待细胞完全病变后，收集收获液；(3)将病毒收获液以5000rpm30min离心去除细胞碎片；(4)加入等量的冻干保护剂至上述离心后的病毒原液中，冻干保护剂配方为(2X) 蔗糖8%、海藻糖8%、甘氨酸2%、右旋糖酐2%、人白蛋白1%、精氨酸0.2%、谷氨酸 钠1%。(5)分装并进行冻干，冻干后即为所需的腮腺炎减毒活疫苗。
3.权利要求1所述减毒活疫苗在制备预防或治疗腮腺炎疾病的药中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种F基因型腮腺炎减毒活疫苗及其制备方法和应用。本发明涉及将分离得到的F基因型腮腺炎减毒毒种，接种于人二倍体细胞(KMB17株)并进行后续工艺处理及冻干技术，制备的腮腺炎减毒活疫苗。该疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。本发明提供了一种不含明胶的冻干保护剂，以保证腮腺炎减毒活疫苗具有外观好、水分低以及良好稳定性的特点。
文档编号A61P31/14GK102018956SQ20101054490
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者刘龙丁, 史长军, 崔平芳, 李琦涵, 梁燕, 王丽春, 董承红, 谢忠平, 马绍辉 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所