专利名称：禽霍乱外膜蛋白a基因疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌疾病疫苗的制备方法，具体的说是禽霍乱外膜蛋白A基因疫 苗的制备方法。
背景技术：
禽霍乱也称为禽多杀性巴氏杆菌病，是由禽霍乱菌(又称为禽多杀性巴氏杆菌)弓丨 起的一种家禽的接触性传染病，在我国是常见的多发性传染病，而且在世界各国均有分布， 几乎所有的家禽都能感染该病，其传染流行严重影响家禽业的健康发展，给家禽业带来了 巨大的经济损失。目前我国对于禽霍乱的控制主要采用抗生素药物治疗，但药物治疗存在一定的缺 点，停药后容易复发，长期应用可能会对禽体产生明显的毒害作用，引起产蛋鸡的产蛋率下 降，而且长期或者反复用药容易导致禽霍乱菌产生耐药性。目前对于禽霍乱的预防措施主要采用的是疫苗注射，常用的疫苗包括弱毒活疫苗 和灭活疫苗两种，但两种疫苗的免疫效果并不是特别理想，弱毒活疫苗的免疫持续期不够 长，免疫保护力不够高，而且给家禽注射后具有一定的副作用，甚至可能会造成一些死亡。 灭活疫苗存在保护率低和免疫期短的问题，比弱毒活疫苗更为严重，因此灭活疫苗的免疫 效果尚不及弱毒活疫苗。外膜蛋白A基因是禽霍乱菌主要的保护性抗原之一，进入机体后可诱导机体的免 疫系统产生一定的免疫应答，为机体提供抗禽霍乱感染的保护力，因此，用禽霍乱菌外膜蛋 白A基因可制备相应的疫苗用以预防禽霍乱。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种可用于预防禽霍乱的禽霍乱外膜蛋白A基因 疫苗的制备方法，通过该方法制备出的疫苗，具有制备简单，操作方便的优点，制得的产品 能有效的防止禽霍乱对鸡的伤害。本发明为解决上述问题，提供的技术方案为 步骤一、引物设计
根据禽霍乱菌基因组序列设计用于扩增禽霍乱菌外膜蛋白A基因的两条引物Pl和
P2
Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'； P2 :5’ -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ ； 步骤二、禽霍乱菌外膜蛋白A基因的PCR扩增及纯化
1)在0. 2ml的PCR反应管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶缓冲液2. 5μ1、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏杆菌的基因组 μ 和水16μ1，再将含有上述试剂的PCR反应管放入PCR扩增仪中，进行PCR反应，PCR反应程 序首先进行94°C预变性，时间为5分钟，预变性结束后进入循环过程，每个循环的程序为94° C变性，时间为1分钟，57° C复性，时间为45秒钟，72° C延伸，时间为1分钟，将上述循环 程序重复30次，30次循环结束后，72°C再次延伸，时间10分钟，得到PCR扩增的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物，备用；
2)利用琼脂糖凝胶电泳检测禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物，在凝胶成像系统中观察 到目的基因后，备用；
3)按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1.5ml的离心管a并称其重量，然后 在紫外灯下将凝胶上含有的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物切下来，将切下来的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物放在已称重的1. 5ml的离心管a中，称取离心管a的总重并计算出 从凝胶上切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物的重量，然后将离心管a中的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管a放置在50°C水 浴中加热至离心管a中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯 化柱a位于收集管a中，在21°C条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为 12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟， 取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入500μ1的溶液II，转速为12000转/ 分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心 1分钟，取出DNA纯化柱a置于1. 5ml的离心管b中，在DNA纯化柱a上加入40μ1溶液III， 将离心管b在21° C条件下放置1分钟，将离心管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟， 弃去DNA纯化柱a得到离心管b中的40μ1液体，该液体就是纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A 基因；
步骤三、真核表达载体pcDNA3. I+的酶切及纯化
1)酶切体系的配制在1.5ml的离心管c中加入真核表达载体pcDNA3. I+ 10μ1、限制 性内切酶Kpn I 3μ1、限制性内切酶EcoR I 3μ1、限制性内切酶缓冲液5μ1和水^μ ，混合 均勻止，得到的混合物Α，将上述混合物A放入37° C的水浴锅中反应8小时，备用；
2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测
利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物Α，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3)按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1.5ml的离心管d并称其重量，在紫 外灯下将凝胶上的混合物A切下来，将切下来的混合物A放在已称重的1. 5ml的离心管d 中，称取离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，然后将离心管d中的 混合物A捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管d放置在50° C水浴中加热至混 合物A完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中， 收集管b在21°C条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离 心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C条件 下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内 的液体，向DNA纯化柱b上加入500μ1的溶液II，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离 心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，倒掉收集管b中的液体后将放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b放置于1. 5ml的离心管e中，后在DNA纯化 柱b上加入40μ1溶液III，将离心管e在21°C条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000 转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到离心管中e中的液体，该液体就是酶切并纯化后的真核表达载体PCDNA3. 1+，备用；
步骤四、禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备
1)在1.5ml的离心管f中依次加入纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性内 切酶Kpn I 3μ1、限制性内切酶EcoR I 3μ1、限制性内切酶缓冲液5μ1和水Μμ ，混合均勻 止，得到的混合物B，将上述混合物B放入37°C的水浴锅中反应5小时，取出备用；
2)利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物B，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3.按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1. 5ml的离心管g并称其重量，在紫 外灯下将凝胶的混合物B切下来，将切下来的混合物B放在已称重的1. 5ml的离心管g中， 称取离心管g的总重并计算出从凝胶上切下的混合物B的重量，然后将离心管g中的混合 物B捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管g放置在50° C水浴中加热至混合物 B完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱c上，DNA纯化柱c位于收集管c中，收集管 c在21°C条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒 掉收集管c内的液体，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C条件下将放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分 钟，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入500μ1的溶液II，放入离心机中， 转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，倒掉收集管c中的液 体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c并放置于1. 5ml 的离心管h中，后在DNA纯化柱c上加入40μ1溶液III，将离心管h在21°C条件下放置1分 钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c得到离心管中h中 的40μ1液体，该液体就是酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因，备用；
4)在1.5ml的离心管i中，依次加入酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3. 1+2μ1、DNA连接酶 μ 、DNA连接酶缓冲液2μ1和水 5μ1，混合均勻止，将离心管i放入16° C的水浴锅中，反应12小时，备用；
5)待反应结束后，在离心管i中加入200μ1的大肠杆菌JM83，先将离心管i置于0°C 的冰水混合物中，时间30分钟，取出置于42° C条件下，放置90秒，再取出，将离心管i置于 O0C的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管i中加入0. 5ml的LB液体培养基，形成含有 LB液体培养基的混合液，备用；
6)将离心管i置于37°C的摇床中振荡培养，转速200转/分钟，时间为1.5小时，结 束后，取ΙΟΟμΙ含LB液体培养基的混合液涂布于含浓度为5(^g/ml氨苄青霉素的LB培养 固体培养基上，将涂布后的LB培养固体培养基置于37°C的培养箱内，倒置培养16小时，备 用；
7)挑取培养后的LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入5ml含氨苄青霉素的 的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μβ/πι1，后将含氨苄青霉素的LB液体培养基 置于37° C恒温摇床内，在转速为200转/分钟，振荡培养16小时；
8)待振荡培养结束后，取Iml含有菌落的LB液体培养液加到1.5ml的离心管j中，将 离心管j放入离心机内离心，转速12000转/分钟，离心5分钟，弃去离心管j中的上层澄 清液体，加入ΙΟΟμΙ的预先冷却至4° C的溶液IV，均勻混合后，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，后将离心管j置于0°C的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管j中加入150μ1的 预先冷却至4° C的溶液VI，混合均勻，后将离心管j放于0° C的冰水混合物中，静置5分钟，取出放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4°C的条件下离心10分钟，后取出，备 用；
9)取离心管j中的上层澄清液体400μ1，将其加到1.5ml的离心管k中，向离心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振荡混勻后，放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟， 4° C条件下离心10分钟，待离心结束后取上层液体400μ1移入到1. 5ml的离心管m中，加入 800μ1的无水乙醇，将离心管m于-20° C条件下，放置20分钟，后取出放入冷冻离心机内，转 速13000转/分钟，4° C条件下离心10分钟，弃去离心管m中的上层澄清液体；
10)在离心管m中加入浓度为70%的乙醇0.5ml，放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C条件下离心5分钟，弃去上层澄清液体，得到沉淀物I，该沉淀物I为pCA质粒，待 PCA质粒干燥后，加入30μ1超纯水进行溶解，得到的溶液为pCA质粒溶液；
11)在1.5ml的离心管η中，加入2μ1的pCA质粒溶液，后依次向离心管η中加入 μ 的限制性内切酶Kpn I、 μ1的限制性内切酶EcoR I、 μ 的限制性内切酶缓冲液和水5μ1， 混合均勻后，置于37° C条件下，反应2小时，形成酶切液；
12)利用琼脂糖凝胶电泳检测pCA质粒酶，在凝胶成像系统中进行观察，观察到1050bp 大小的条带，PCA质粒是本发明制备的禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗；
步骤五、禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA质粒的大量制备
1)挑取步骤四中含有PCA质粒的大肠杆菌JM83；
2)挑取培养后LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入25ml含氨苄青霉素的的 LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为5(^g/ml，后将LB液体培养基，置于37°C恒温摇 床内振荡培养，转速200转/分钟，至液体在600纳米处的吸光度，OD600值为0. 6止，将振 荡培养后的液体转至500ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为 5(^g/ml，置于37°C恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，培养15小时；
3)待振荡培养结束后，将含有菌落的500mlLB液体培养基放入IOOOml的离心管中， 将IOOOml的离心管放入冷冻离心机内，转速6000转/分钟，4°C条件下离心时间15分钟， 弃去上层澄清液体得到沉淀物II，向离心管中加入18ml的预先冷却至4°C的溶液IV，将沉 淀物II悬浮，再加入2ml浓度为10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，将IOOOml的离心管置于20° C条件下，放置5分钟，后向IOOOml的离心管中加 入20ml预先冷却至4° C的溶液VI，混合均勻，将其放于0° C的冰水混合物中，静置10分钟， 取出放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C条件下离心20分钟，取上层澄清液体，备 用；
4)在200ml的离心管中，加入步骤3中的上层澄清液体80ml，再加入32ml的异丙醇， 振荡混勻后在20° C条件下放置10分钟，后放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C的 条件下离心20分钟，待离心结束后倒掉上层澄清液体，得到200ml的离心管中的沉淀物III， 再向200ml的离心管中加入50ml的70%的乙醇，将200ml的离心管放入冷冻离心机内，转 速12000转/分钟，4°C的条件下离心5分钟，弃去澄清液体，待沉淀物III干燥后备用；
5)在含有沉淀物III的200ml离心管中加入:3ml的pH值为8.O的三羟甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸，TE溶液，使沉淀物III溶解，将溶解后的溶液转移至15ml的离心管中，在0°C的 冰水混合物中，放置10分钟，后向15ml的离心管中加入3ml的浓度为5mol/l的氯化锂溶 液，放入冷冻离心机内，转速10000转/分钟，离心时间10分钟，取上层澄清液体，备用；6)在IOml的离心管中加入步骤5中的上层澄清液体和等体积的异丙醇，混合均勻止放 于20° C条件下，放置10分钟，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C条件下离心10 分钟，弃去上层澄清液体，加入5ml浓度为70%的乙醇，放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C的条件下离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物IV，干燥，备用；
7)向含有沉淀物IV的IOml的离心管中加入0.5ml含有浓度为100mg/ml的RNA酶A的 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，将沉淀物IV溶解，后向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，将IOml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C的条件下离心10分钟，取0. 5ml的上层澄清液体转至5ml的离心管内，加入Iml 的无水乙醇，置于-20° C条件下，放置20分钟，放入冷冻离心机内，转速13000转/分钟， 4°C条件下离心10分钟，弃去上清液弃掉，得到沉淀物V，干燥备用；
8)向含有沉淀物V的5ml离心管中加入Iml超纯水，使沉淀物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化镁，PEG-MgCl2溶液，置于20° C条件下，放置30分钟，放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心20分钟，弃去上层澄清液体，加入0. 5ml浓度为70%的乙醇，放入离心 机内，转速13000转/分钟，离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物VI，该沉淀物就是 大量制备的PCA质粒即大量制备的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗；
9)向含有沉淀物VI的5ml离心管中加入Iml浓度为0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液，使 沉淀物VI溶解，溶解后的溶液为大量制备的PCA质粒溶液，后用分光光度计测定溶液中所 含的PCA质粒的浓度，备用；
10)对禽霍乱菌的外膜蛋白A基因进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像系统 中观察到条带为1050bp时，证明禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗制备成功。本发明涉及到以下菌种和试剂
禽霍乱菌Uria/ PasteMrella)购买自中国兽医药品监察所，见生物材料保
藏证明附件1、附件2、附件4;
大肠杆菌(Escherichia, coli /AK )购买自华美生物工程有限公司，见生物材料 保藏证明附件3;
DNA凝胶回收试剂盒由碧云天生物技术研究所提供，该试剂盒中自配有成品的溶液I、 溶液II和溶液III。有益效果
本发明提供了一种禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备方法，该方法制备简单，容易操作。本发明所用的真核载体为PCDNA3. 1(+)，该载体具有合适的多克隆位点，有高效能 稳定和瞬时转染哺乳动物及人类细胞的能力，具有高效率CMV立即早期启动子和增强子、 T7启动子、BGH多腺苷酸信号、SV40早期启动子等，有利于外源基因的表达，同时该载体含 有氨苄青霉素抗性基因(AmpD，可用作筛选标记，该基因中还含有免疫增强CpG DNA序列， 可增强疫苗的免疫效果。
具体实施例方式步骤一、引物设计
根据禽霍乱菌基因组序列设计用于扩增禽霍乱菌外膜蛋白A基因的两条引物Pl和P2
Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'；
P2 :5’ -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ ；
步骤二、禽霍乱菌外膜蛋白A基因的PCR扩增及纯化
1)在0.2ml的PCR反应管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶缓冲液2. 5μ1、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏杆菌的基因组 μ 和水16μ1，再将含有上述试剂的PCR反应管放入PCR扩增仪中，进行PCR反应，PCR反应程 序首先进行94°C预变性，时间为5分钟，预变性结束后进入循环过程，每个循环的程序为 94° C变性，时间为1分钟，57° C复性，时间为45秒钟，72° C延伸，时间为1分钟，将上述循环 程序重复30次，30次循环结束后，72°C再次延伸，时间10分钟，得到PCR扩增的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物，备用；
2)称取1.0克琼脂糖粉末加入到IOOml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂 糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙锭溶液，至混合均勻止，后倒入制胶板中，插入制胶梳， 凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲 液中，将禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳 仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的 基因后，备用；
3)按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1.5ml的离心管a并称其重量，然后 在紫外灯下将凝胶上含有的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物切下来，将切下来的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物放在已称重的1. 5ml的离心管a中，称取离心管a的总重并计算出 从凝胶上切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物的重量，然后将离心管a中的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管a放置在50°C水 浴中加热至离心管a中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯 化柱a位于收集管a中，在21°C条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为 12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟， 取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入500μ1的溶液II，转速为12000转/ 分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心 1分钟，取出DNA纯化柱a置于1. 5ml的离心管b中，在DNA纯化柱a上加入40μ1溶液III， 将离心管b在21° C条件下放置1分钟，将离心管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟， 弃去DNA纯化柱a得到离心管b中的40μ1液体，该液体就是纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A 基因；
步骤三、真核表达载体pcDNA3. 1(+)的酶切及纯化
1)酶切体系的配制在1.5ml的离心管c中加入真核表达载体pcDNA3. 1 (+) 10μ1、限 制性内切酶Kpn I 3μ1、限制性内切酶EcoR I 3μ1、限制性内切酶缓冲液5μ1和水29μ1，混 合均勻止，得到的混合物Α，将上述混合物A放入37° C的水浴锅中反应8小时，备用；
2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测
称取1. 0克琼脂糖粉末加入到IOOml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖 粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙锭溶液，至混合均勻止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液 中，将混合物A加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始 电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3)按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1. 5ml的离心管d并称其重量，在紫 外灯下将凝胶上的混合物A切下来，将切下来的混合物A放在已称重的1. 5ml的离心管d 中，称取离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，然后将离心管d中的 混合物A捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管d放置在50° C水浴中加热至混 合物A完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中， 收集管b在21°C条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离 心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C条件 下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内 的液体，向DNA纯化柱b上加入500μ1的溶液II，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离 心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，倒掉收集管b中的液体后将放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b放置于1. 5ml的离心管e中，后在DNA纯化 柱b上加入40μ1溶液III，将离心管e在21°C条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000 转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到离心管中e中的液体，该液体就是酶切并纯 化后的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)，备用；
步骤四、禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备
1)在1.5ml的离心管f中依次加入纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性内 切酶Kpn I 3μ1、限制性内切酶EcoR I 3μ1、限制性内切酶缓冲液5μ1和水24μ1，混合均勻 止，得到的混合物B，将上述混合物B放入37°C的水浴锅中反应5小时，取出备用；
2)称取1.0克琼脂糖粉末加入到IOOml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂 糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙锭溶液，至混合均勻止，后倒入制胶板中，插入制胶梳， 凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲 液中，将混合物B加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开 始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3)按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1.5ml的离心管g并称其重量，在紫 外灯下将凝胶的混合物B切下来，将切下来的混合物B放在已称重的1. 5ml的离心管g中， 称取离心管g的总重并计算出从凝胶上切下的混合物B的重量，然后将离心管g中的混合 物B捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管g放置在50° C水浴中加热至混合物 B完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱c上，DNA纯化柱c位于收集管c中，收集管 c在21°C条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒 掉收集管c内的液体，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C条件下将放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分 钟，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入500μ1的溶液II，放入离心机中， 转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，倒掉收集管c中的液 体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c并放置于1. 5ml 的离心管h中，后在DNA纯化柱c上加入40μ1溶液III，将离心管h在21°C条件下放置1分 钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c得到离心管中h中的40μ1液体，该液体就是酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因，备用；
4)在1.5ml的离心管i中，依次加入酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3. 1 (+) 2μ1、 ΝΑ连接酶 μ1、 ΝΑ连接酶缓冲液2μ1和 水5μ1，混合均勻止，将离心管i放入16° C的水浴锅中，反应12小时，备用；
5)待反应结束后，在离心管i中加入200μ1的大肠杆菌JM83，先将离心管i置于0°C 的冰水混合物中，时间30分钟，取出置于42° C条件下，放置90秒，再取出，将离心管i置于 O0C的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管i中加入0. 5ml的LB液体培养基，形成含有 LB液体培养基的混合液，备用；
6)将离心管i置于37°C的摇床中振荡培养，转速200转/分钟，时间为1.5小时，结 束后，取ΙΟΟμΙ含LB液体培养基的混合液涂布于含浓度为5(^g/ml氨苄青霉素的LB培养 固体培养基上，将涂布后的LB培养固体培养基置于37° C的培养箱内，倒置培养16小时，备 用；
7)挑取培养后的LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入5ml含氨苄青霉素的 的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μβ/πι1，后将含氨苄青霉素的LB液体培养基 置于37° C恒温摇床内，在转速为200转/分钟，振荡培养16小时；
8)待振荡培养结束后，取Iml含有菌落的LB液体培养液加到1.5ml的离心管j中，将 离心管j放入离心机内离心，转速12000转/分钟，离心5分钟，弃去离心管j中的上层澄 清液体，加入ΙΟΟμΙ的预先冷却至4° C的溶液IV，均勻混合后，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，后将离心管j置于0°C的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管j中加入150μ1的 预先冷却至4° C的溶液VI，混合均勻，后将离心管j放于0° C的冰水混合物中，静置5分钟， 取出放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4°C的条件下离心10分钟，后取出，备 用；
9)取离心管j中的上层澄清液体400μ1，将其加到1.5ml的离心管k中，向离心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振荡混勻后，放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟， 4° C条件下离心10分钟，待离心结束后取上层液体400μ1移入到1. 5ml的离心管m中，加入 800μ1的无水乙醇，将离心管m于-20° C条件下，放置20分钟，后取出放入冷冻离心机内，转 速13000转/分钟，4° C条件下离心10分钟，弃去离心管m中的上层澄清液体；
10)在离心管m中加入浓度为70%的乙醇0.5ml，放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C条件下离心5分钟，弃去上层澄清液体，得到沉淀物I，该沉淀物I为pCA质粒，待 PCA质粒干燥后，加入30μ1超纯水进行溶解，得到的溶液为pCA质粒溶液；
11)在1.5ml的离心管η中，加入2μ1的pCA质粒溶液，后依次向离心管η中加入 μ 的限制性内切酶Kpn I、 μ1的限制性内切酶EcoR I、 μ 的限制性内切酶缓冲液和水5μ1， 混合均勻后，置于37° C条件下，反应2小时，形成酶切液；
12)称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使 琼脂糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙锭溶液，至混合均勻止，后倒入制胶板中，插入制 胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电 泳缓冲液中，将PCA质粒酶切液加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压 为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中进行观察，观察到 1050bp大小的条带，证明该pCA质粒是本发明制备的禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗；步骤五、禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA质粒的大量制备
1)挑取步骤四中含有PCA质粒的大肠杆菌JM83；
2)挑取培养后LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入25ml含氨苄青霉素的的 LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为5(^g/ml，后将LB液体培养基，置于37°C恒温摇 床内振荡培养，转速200转/分钟，至液体在600纳米处的吸光度(0D_值)为0. 6止，将振 荡培养后的液体转至500ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为 5(^g/ml，置于37°C恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，培养15小时；
3)待振荡培养结束后，将含有菌落的500mlLB液体培养基放入IOOOml的离心管中， 将IOOOml的离心管放入冷冻离心机内，转速6000转/分钟，4°C条件下离心时间15分钟， 弃去上层澄清液体得到沉淀物II，向离心管中加入18ml的预先冷却至4°C的溶液IV，将沉 淀物II悬浮，再加入2ml浓度为10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，将IOOOml的离心管置于20° C条件下，放置5分钟，后向IOOOml的离心管中加 入20ml预先冷却至4° C的溶液VI，混合均勻，将其放于0° C的冰水混合物中，静置10分钟， 取出放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C条件下离心20分钟，取上层澄清液体，备 用；
4)在200ml的离心管中，加入步骤3中的上层澄清液体80ml，再加入32ml的异丙醇， 振荡混勻后在20° C条件下放置10分钟，后放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C的 条件下离心20分钟，待离心结束后倒掉上层澄清液体，得到200ml的离心管中的沉淀物III， 再向200ml的离心管中加入50ml的70%的乙醇，将200ml的离心管放入冷冻离心机内，转 速12000转/分钟，4°C的条件下离心5分钟，弃去澄清液体，待沉淀物III干燥后备用；
5)在含有沉淀物III的200ml离心管中加入:3ml的pH值为8.O的三羟甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸(TE)溶液，使沉淀物III溶解，将溶解后的溶液转移至15ml的离心管中，在0° C的 冰水混合物中，放置10分钟，后向15ml的离心管中加入3ml的浓度为5mol/l的氯化锂溶 液，放入冷冻离心机内，转速10000转/分钟，离心时间10分钟，取上层澄清液体，备用；
6)在IOml的离心管中加入步骤5中的上层澄清液体和等体积的异丙醇，混合均勻止放 于20° C条件下，放置10分钟，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C条件下离心10 分钟，弃去上层澄清液体，加入5ml浓度为70%的乙醇，放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C的条件下离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物IV，干燥，备用；
7)向含有沉淀物IV的IOml的离心管中加入0.5ml含有浓度为100mg/ml的RNA酶A的 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)溶液，将沉淀物IV溶解，后向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，将IOml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C的条件下离心10分钟，取0. 5ml的上层澄清液体转至5ml的离心管内，加入Iml 的无水乙醇，置于-20°C条件下，放置20分钟，放入冷冻离心机内，转速13000转/分钟， 4° C条件下离心10分钟，弃去上清液弃掉，得到沉淀物V，干燥备用；
8)向含有沉淀物V的5ml离心管中加入Iml超纯水，使沉淀物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化镁(PEG-MgCl2)溶液，置于20°C条件下，放置30分钟，放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心20分钟，弃去上层澄清液体，加入0. 5ml浓度为70%的乙醇，放入离心 机内，转速13000转/分钟，离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物VI，该沉淀物就是 大量制备的PCA质粒即大量制备的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗；9)向含有沉淀物VI的5ml离心管中加入Iml浓度为0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液，使 沉淀物VI溶解，溶解后的溶液为大量制备的PCA质粒溶液，后用分光光度计测定溶液中所 含的PCA质粒的浓度，备用；
10)对禽霍乱菌的外膜蛋白A基因进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像系统 中观察到条带为1050bp时，证明禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗制备成功；
步骤六、动物免疫实验
取1日龄的没经过免疫的雏鸡40只，每日按正常日粮饲养，4周龄时将其平均分为试 验组和对照组，每组20只，试验组共三次免疫，第一次免疫时间为4周龄，第二次免疫时间 为6周龄，第三次免疫时间为8周龄，注射提取的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗即pCA质粒， 每次免疫的剂量200μβ/只，采用大腿内侧肌肉注射；对照组的20只鸡不进行任何免疫； 步骤七、动物攻毒实验
10周龄时，对试验组和对照组进行肌肉注射禽霍乱菌，攻毒剂量为每只鸡注射IXlO9 个禽霍乱菌，攻毒之后，对两组继续饲养至12周龄时止，记录两组在12周龄时的存活量，并 计算出试验组和对照组的保护率，保护率越高说明免疫预防效果越好； 试验组的保护率的计算方法如下 (试验组在12周龄时存活量+20) X 100% 对照组的保护率的计算方法如下 (对照组在12周龄时存活量+20) X 100%
结果显示，试验组在12周龄时存活13只，试验组的保护率为65% ；对照组在12周龄全 部死亡，对照组的保护率为0%，说明利用本发明制备出的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗pCA给 鸡进行三次免疫之后能使被免疫鸡有效地预防禽霍乱。所述的LB培养固体培养基的组成成分为按重量比每升LB培养固体培养基中含有 1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1. 5%的琼脂粉和水。所述的LB液体培养基的组成成分为按重量比每升LB液体培养基中含有1%的胰 蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水。所述的溶液I的组成成分为按质量比每升溶液I中含有50 mmol/L的葡萄糖、25 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10 mmol/L的乙二胺四乙酸，余量为水。所述的溶液II的组成成分为按重量比每升溶液II中含有lOmmol/L的氢氧化钠、 10%的十二烷基磺酸钠，余量为水。所述的溶液III的组成成分为按重量比每升溶液III中含有60%的5 mol/L的乙酸 钾、11. 5%的冰醋酸，余量为水。所述的磷酸盐缓冲液的组成成分为按重量比每升磷酸盐缓冲液中含有0. 8%的氯 化钠、0. 02%的磷酸二氢钾、0. 02%的氯化钾、0. 29%的十二水合磷酸氢二钠，余量为水。
权利要求
1. 一种禽多杀性巴氏杆菌病核酸疫苗的制备方法，其特征在于步骤一、引物设计根据禽霍乱菌基因组序列设计用于扩增禽霍乱菌外膜蛋白A基因的两条引物Pl和P2 Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'；P2 :5’ -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’ ；步骤二、禽霍乱菌外膜蛋白A基因的PCR扩增及纯化1)在0.2ml的PCR反应管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶缓冲液2. 5μ1、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏杆菌的基因组 μ 和水16μ1，再将含有上述试剂的PCR反应管放入PCR扩增仪中，进行PCR反应，PCR反应程 序首先进行94°C预变性，时间为5分钟，预变性结束后进入循环过程，每个循环的程序为 94° C变性，时间为1分钟，57° C复性，时间为45秒钟，72° C延伸，时间为1分钟，将上述循环 程序重复30次，30次循环结束后，72°C再次延伸，时间10分钟，得到PCR扩增的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物，备用；2)利用琼脂糖凝胶电泳检测禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物，在凝胶成像系统中观察 到目的基因后，备用；3)按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1.5ml的离心管a并称其重量，然后 在紫外灯下将凝胶上含有的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物切下来，将切下来的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物放在已称重的1. 5ml的离心管a中，称取离心管a的总重并计算出 从凝胶上切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物的重量，然后将离心管a中的禽霍乱菌 外膜蛋白A基因的产物捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管a放置在50°C水 浴中加热至离心管a中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯 化柱a位于收集管a中，在21°C条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为 12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟， 取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入500μ1的溶液II，转速为12000转/ 分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心 1分钟，取出DNA纯化柱a置于1. 5ml的离心管b中，在DNA纯化柱a上加入40μ1溶液III， 将离心管b在21° C条件下放置1分钟，将离心管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟， 弃去DNA纯化柱a得到离心管b中的40μ1液体，该液体就是纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A 基因；步骤三、真核表达载体pcDNA3. I+的酶切及纯化1)酶切体系的配制在1.5ml的离心管c中加入真核表达载体pcDNA3. I+ 10μ1、限制 性内切酶Kpn I 3μ1、限制性内切酶EcoR I 3μ1、限制性内切酶缓冲液5μ1和水^μ ，混合 均勻止，得到的混合物Α，将上述混合物A放入37° C的水浴锅中反应8小时，备用；2)利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物Α，在凝胶成像系统中进行观察，备用；3)按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1.5ml的离心管d并称其重量，在紫 外灯下将凝胶上的混合物A切下来，将切下来的混合物A放在已称重的1. 5ml的离心管d中，称取离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，然后将离心管d中的 混合物A捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管d放置在50° C水浴中加热至混 合物A完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中， 收集管b在21°C条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离 心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C条件 下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内 的液体，向DNA纯化柱b上加入500μ1的溶液II，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离 心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，倒掉收集管b中的液体后将放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b放置于1. 5ml的离心管e中，后在DNA纯化 柱b上加入40μ1溶液III，将离心管e在21°C条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000 转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到离心管中e中的液体，该液体就是酶切并纯 化后的真核表达载体PCDNA3. 1+，备用；步骤四、禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备1)在1.5ml的离心管f中依次加入纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性内 切酶Kpn I 3μ1、限制性内切酶EcoR I 3μ1、限制性内切酶缓冲液5μ1和水Μμ ，混合均勻 止，得到的混合物B，将上述混合物B放入37°C的水浴锅中反应5小时，取出备用；2)利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物B，在凝胶成像系统中进行观察，备用；3)按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作取1.5ml的离心管g并称其重量，在紫 外灯下将凝胶的混合物B切下来，将切下来的混合物B放在已称重的1. 5ml的离心管g中， 称取离心管g的总重并计算出从凝胶上切下的混合物B的重量，然后将离心管g中的混合 物B捣碎，加入等体积的溶液I，混合均勻止，将离心管g放置在50° C水浴中加热至混合物 B完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱c上，DNA纯化柱c位于收集管c中，收集管 c在21°C条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒 掉收集管c内的液体，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C条件下将放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分 钟，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入500μ1的溶液II，放入离心机中， 转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，倒掉收集管c中的液 体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c并放置于1. 5ml 的离心管h中，后在DNA纯化柱c上加入40μ1溶液III，将离心管h在21°C条件下放置1分 钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c得到离心管中h中 的40μ1液体，该液体就是酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因，备用；4)在1.5ml的离心管i中，依次加入酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3. 1+2μ1、DNA连接酶 μ 、DNA连接酶缓冲液2μ1和水 5μ1，混合均勻止，将离心管i放入16° C的水浴锅中，反应12小时，备用；5)待反应结束后，在离心管i中加入200μ1的大肠杆菌JM83，先将离心管i置于0°C 的冰水混合物中，时间30分钟，取出置于42° C条件下，放置90秒，再取出，将离心管i置于 O0C的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管i中加入0. 5ml的LB液体培养基，形成含有 LB液体培养基的混合液，备用；6)将离心管i置于37°C的摇床中振荡培养，转速200转/分钟，时间为1.5小时，结束后，取ΙΟΟμΙ含LB液体培养基的混合液涂布于含浓度为5(^g/ml氨苄青霉素的LB培养 固体培养基上，将涂布后的LB培养固体培养基置于37° C的培养箱内，倒置培养16小时，备 用；7)挑取培养后的LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入5ml含氨苄青霉素的 的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μβ/πι1，后将含氨苄青霉素的LB液体培养基 置于37° C恒温摇床内，在转速为200转/分钟，振荡培养16小时；8)待振荡培养结束后，取Iml含有菌落的LB液体培养液加到1.5ml的离心管j中，将 离心管j放入离心机内离心，转速12000转/分钟，离心5分钟，弃去离心管j中的上层澄 清液体，加入ΙΟΟμΙ的预先冷却至4° C的溶液IV，均勻混合后，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，后将离心管j置于0°C的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管j中加入150μ1的 预先冷却至4° C的溶液VI，混合均勻，后将离心管j放于0° C的冰水混合物中，静置5分钟， 取出放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4°C的条件下离心10分钟，后取出，备 用；9)取离心管j中的上层澄清液体400μ1，将其加到1.5ml的离心管k中，向离心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振荡混勻后，放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟， 4°C条件下离心10分钟，待离心结束后取上层液体400μ1移入到1. 5ml的离心管m中，加入 800μ1的无水乙醇，将离心管m于-20° C条件下，放置20分钟，后取出放入冷冻离心机内，转 速13000转/分钟，4° C条件下离心10分钟，弃去离心管m中的上层澄清液体；10)在离心管m中加入浓度为70%的乙醇0.5ml，放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C条件下离心5分钟，弃去上层澄清液体，得到沉淀物I，该沉淀物I为pCA质粒，待 PCA质粒干燥后，加入30μ1超纯水进行溶解，得到的溶液为pCA质粒溶液；11)在1.5ml的离心管η中，加入2μ1的pCA质粒溶液，后依次向离心管η中加入 μ 的限制性内切酶Kpn I、 μ1的限制性内切酶EcoR I、 μ 的限制性内切酶缓冲液和水5μ1， 混合均勻后，置于37° C条件下，反应2小时，形成酶切液；12)利用琼脂糖凝胶电泳检测pCA质粒酶，在凝胶成像系统中进行观察，观察到1050bp 大小的条带，PCA质粒是本发明制备的禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗；步骤五、禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA质粒的大量制备1)挑取步骤四中含有PCA质粒的大肠杆菌JM83；2)挑取培养后LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入25ml含氨苄青霉素的的 LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为5(^g/ml，后将LB液体培养基，置于37°C恒温摇 床内振荡培养，转速200转/分钟，至液体在600纳米处的吸光度，OD600值为0. 6止，将振 荡培养后的液体转至500ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为 5(^g/ml，置于37°C恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，培养15小时；3)待振荡培养结束后，将含有菌落的500mlLB液体培养基放入IOOOml的离心管中， 将IOOOml的离心管放入冷冻离心机内，转速6000转/分钟，4°C条件下离心时间15分钟， 弃去上层澄清液体得到沉淀物II，向离心管中加入18ml的预先冷却至4°C的溶液IV，将沉 淀物II悬浮，再加入2ml浓度为10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，将1000ml的离心管置于20° C条件下，放置5分钟，后向1000ml的离心管中加 入20ml预先冷却至4° C的溶液VI，混合均勻，将其放于0° C的冰水混合物中，静置10分钟，取出放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C条件下离心20分钟，取上层澄清液体，备 用；4)在200ml的离心管中，加入步骤3中的上层澄清液体80ml，再加入32ml的异丙醇， 振荡混勻后在20° C条件下放置10分钟，后放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C的 条件下离心20分钟，待离心结束后倒掉上层澄清液体，得到200ml的离心管中的沉淀物III， 再向200ml的离心管中加入50ml的70%的乙醇，将200ml的离心管放入冷冻离心机内，转 速12000转/分钟，4°C的条件下离心5分钟，弃去澄清液体，待沉淀物III干燥后备用；5)在含有沉淀物III的200ml离心管中加入:3ml的pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸，TE溶液，使沉淀物III溶解，将溶解后的溶液转移至15ml的离心管中，在0°C的 冰水混合物中，放置10分钟，后向15ml的离心管中加入3ml的浓度为5mol/l的氯化锂溶 液，放入冷冻离心机内，转速10000转/分钟，离心时间10分钟，取上层澄清液体，备用；6)在IOml的离心管中加入步骤5中的上层澄清液体和等体积的异丙醇，混合均勻止放 于20° C条件下，放置10分钟，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4° C条件下离心10 分钟，弃去上层澄清液体，加入5ml浓度为70%的乙醇，放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C的条件下离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物IV，干燥，备用；7)向含有沉淀物IV的IOml的离心管中加入0.5ml含有浓度为100mg/ml的RNA酶A的 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，将沉淀物IV溶解，后向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，将IOml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000转/ 分钟，4°C的条件下离心10分钟，取0. 5ml的上层澄清液体转至5ml的离心管内，加入Iml 的无水乙醇，置于-20°C条件下，放置20分钟，放入冷冻离心机内，转速13000转/分钟， 4°C条件下离心10分钟，弃去上清液弃掉，得到沉淀物V，干燥备用；8)向含有沉淀物V的5ml离心管中加入Iml超纯水，使沉淀物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化镁，PEG-MgCl2溶液，置于20° C条件下，放置30分钟，放入离心机内，转速 13000转/分钟，离心20分钟，弃去上层澄清液体，加入0. 5ml浓度为70%的乙醇，放入离心 机内，转速13000转/分钟，离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物VI，该沉淀物就是 大量制备的PCA质粒即为制备的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗；9)向含有沉淀物VI的5ml离心管中加入Iml浓度为0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液，使 沉淀物VI溶解，溶解后的溶液为大量制备的PCA质粒溶液，后用分光光度计测定溶液中所 含的PCA质粒的浓度，备用；10)对禽霍乱菌的外膜蛋白A基因进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像系统 中观察到条带为1050bp时，证明禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗制备成功；所述的载体为真核表达载体pcDNA3. I+ ；所述的LB培养固体培养基的组成成分为按重量比每升LB培养固体培养基中含有1% 的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1. 5%的琼脂粉和水；所述的LB液体培养基的组成成分为按重量比每升LB液体培养基中含有1%的胰蛋白 胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；所述的溶液I的组成成分为按质量比每升溶液I中含有50 mmol/L的葡萄糖、25 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10 mmol/L的乙二胺四乙酸，余量为水；所述的溶液II的组成成分为按重量比每升溶液II中含有lOmmol/L的氢氧化钠、10%的十二烷基磺酸钠，余量为水；所述的溶液III的组成成分为按重量比每升溶液III中含有60%的5 mol/L的乙酸钾、 11. 5%的冰醋酸，余量为水；所述的磷酸盐缓冲液的组成成分为按重量比每升磷酸盐缓冲液中含有0. 8%的氯化 钠、0. 02%的磷酸二氢钾、0. 02%的氯化钾、0. 29%的十二水合磷酸氢二钠，余量为水。
全文摘要
一种禽多杀性巴氏杆菌病核酸疫苗的制备方法，以禽多杀性巴氏杆菌基因组序列设计引物，以禽多杀性巴氏杆菌CVCC474菌株基因组为模板通过PCR扩增出目的基因，利用限制性内切酶KpnⅠ和限制性内切酶EcoRⅠ对目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行酶切，后将目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行连接，转化入大肠杆菌感受态JM83中，提取质粒，酶切鉴定后获得禽多杀性巴氏杆菌病核酸疫苗；本发明方法所制备出的禽多杀性巴氏杆菌病核酸疫苗通过动物试验检测表明，可降低禽多杀性巴氏杆菌病的发生，降低禽多杀性巴氏杆菌对禽类侵袭，其制作方法简单，容易操作。
文档编号A61K39/102GK102139116SQ201010605018
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月25日 优先权日2010年12月25日
发明者孙军杰, 孙晓菲, 宫强, 张勇法, 张敏, 曲宁, 牛明福, 程茗 申请人:河南科技大学