专利名称：：包含来自构树和忍冬的提取物的抗炎药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于预防、减轻、或治疗炎症或疼痛的药物组合物，所述药物组合物包含来自构树(Broussonetiapapyrifera)和忍冬(Lonicerajaponica)的提取物作为有效成分。
背景技术：
：炎症是当生物组织受到损伤时体内发生的预防性反应，并可以对外伤、烧伤、或细菌感染发生反应而在身体的一部分中引起充血、水肿、发热、和疼痛。炎性信号通过环加氧酶(COX)途径和脂加氧酶(LOX)途径产生，并且前列腺素、白三烯、血栓烷等通过这些途径产生。一旦炎性信号转移到体内的靶位点，发生多种生物学变化。例如，靠近靶位点的将遭受炎症的血管扩张，由此容许更多血液供给到血管，以使炎性反应所需的血液细胞，诸如消灭细菌的嗜中性粒细胞被供给到靶位点。然而，如果该预防性反应在体内异常地或过度地发生，则可以形成多种炎性疾病。因此，已经开发了通过阻碍生成参与产生炎性信号的途径的酶(例如，C0X-l、C0X-2、5-L0X、或12-L0X)来阻断该途径从而抑制炎性反应的药物。同时，除炎性反应外，已经已知LOX参与支气管哮喘(bronchialasthma)，慢性PlSftli^^l(chronicobstructivepulmonarydisease)(COPD),#ft(atopicdermatitis)，银屑病(psoriasis)等。到目前为止，已经开发了具有不同机制的抗炎药物，例如NSAID和SAID。然而，它们具有副作用且不能根本性地治疗C0PD，慢性炎症诸如特应性疾病，和变应性疾病。因此，存在对开发用于抑制炎症的有效、稳定、和经济的药物产品的需要。I^JM(Broussonetiapapyrifera(L.)Vent.)(#禾斗(Moraceae))^$中15、日本和韩国，且构树的树皮已经在韩国传统医学中作为抗炎药物，抗支气管炎药物，止咳剂使用。根据一篇报告，构树的根对PTPlB和酪氨酸酶具有抑制活性(Chen等，2002;Hwang和Lee，2007)，并且，最近报告了来自构树的根、茎、叶和果实的95%乙醇提取物在体内具有镇痛和抗炎作用(Lin等，2008)。而且，从构树的根部树皮成功地分离了数种异戊二烯化黄酮类化合物包括papyriflavonolA和构查耳酮(broussochalcone)A(Son等，2001)。忍冬(Thunb.)(忍冬科(Caprifoliaceae))是缠绕其他物体生长的灌木，且用作解毒药，并用于治疗泌尿系统病症、高烧、和头痛(aiougakukan，1985)。忍冬被认为是抗炎药物并用于治疗上呼吸道感染、糖尿病和风湿性关节炎(Lee等，1998)。而且，从忍冬的整株植物分离了数种成分包括忍冬苦苷(lonicerosides)和环烯醚萜(iridoids)(Lee等，1995；Kwak等，2003和Qian等，2007)。
发明内容技术问题到目前为止，已经开发了具有不同机制的抗炎药物。然而，它们具有副作用，并且在治疗一些疾病中，不能有效地作为基础治疗。因此，存在对开发有效、稳定和经济的药物产品的需要。这样的药物产品可以是包括两种以上有效成分的复合物。然而，当具有抗炎和镇痛作用的物质联合施用于身体时，很难预测在体内产生的作用。本发明的目的是提供一种新型抗炎联合组合物，其在联合施用不同的有效物质时具有协同性抗炎作用。技术方案为了实现该目的，本发明的发明人研究并发现当来自构树和忍冬的提取物联合使用时，这些提取物具有比分别使用时更好的抗炎和镇痛效果，并且基于该发现，他们开发了用于预防、减轻、或治疗炎症或疼痛的组合物，所述组合物包括来自构树和忍冬的提取物作为有效成分。所述药物组合物中包含的来自构树的提取物优选是富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物，并且来自忍冬的提取物优选是来自忍冬的乙醇提取物。有利效果根据本发明，包括来自构树和忍冬的提取物作为有效成分的组合物可以用作有效的抗炎剂、消炎剂、或镇痛剂，因为当该提取物联合使用时，获得比它们分别使用时更好的抗炎和镇痛效果。根据本发明的药物组合物具有广泛的治疗范围和协同性的强治疗效果，这归因于包含来自构树和忍冬的提取物。当来自构树和忍冬的提取物联合使用时，治疗效果增加。因此，理想的效果可以通过使用比分别使用所述提取物时更小的量来获得。而且，使用较小量可以导致较少的副作用或不良作用。图1显示来自构树和忍冬的提取物对通过5-L0X介导由A23187-处理的RBL-I细胞生成白三烯的影响。*和#分别表示与用A23187处理的对照组相比P<0.<0.01的显著性。图2显示来自构树的富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物和/或来自忍冬的乙醇提取物对由LPS-处理的RAW264.7细胞生成PGE2的影响。LPS-处理的组生成120士8.OnMPGE2(各组的基础水平分别为1.2士0.4nMPGE2and0.8士0.3μΜNO)。η=3。*和#分别表示与用LPS-处理的对照组相比P<0.05和P<0.01的显著性。发明实施方式本发明涉及用于减轻或治疗炎症和/或疼痛的药物组合物，所述组合物包含来自构树的提取物或所述提取物的馏分和来自忍冬的提取物作为有效成分，还涉及通过使用所述药物组合物治疗炎症和疼痛的方法。本发明基于这样的发现，即当来自构树的富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物和来自忍冬的乙醇提取物联合施用时，与当所述提取物分别施用时相比，在体外和体内试验中发生优秀的协同性抗炎和镇痛作用。本发明的发明人通过使用乙酸乙酯分馏来自构树根部树皮的提取物制备富含疏水性异戊二烯化黄酮类化合物的馏分(EBP)并制备来自忍冬整株植物的乙醇提取物(ELJ)。EBP强烈抑制5-脂加氧酶(5-L0X)介导的由A23187-处理的大鼠嗜碱细胞性白血病(RBL-I)细胞生成白三烯。ELJ对此具有弱抑制活性。然而，当EBP和ELJ联合使用时，显示出强协同性抑制活性(图1)。EBP和ELJ还抑制环加氧酶_2_催化的PGE2的生成(图幻。关于花生四烯酸诱导的小鼠耳水肿，5-200mg/kg的口服施用的EBP抑制耳水肿。包括重量比11的EBP和ELJ的混合物，即BL比分别施用的EBP和ELJ更强地抑制耳水肿(表1)。关于λ-角叉藻聚糖(Carrageenan)诱导的爪水肿，BL具有强协同性抗炎作用(表2)。在乙酸诱导的扭体试验中，BL当以50-400mg/kg的量口服施用时，表现出强镇痛活性(表3)。这样的结果显示被测试的物质均具有体外和体内的抗炎活性，并且还显示当EBP和ELJ联合使用时，获得比当它们分别使用时更强的协同性抗炎作用。基于该实验结果，本发明提供用于预防、减轻、或治疗炎症和/或疼痛的药物组合物，其包含来自构树和忍冬的提取物作为有效成分。本发明还提供预防、减轻、或治疗炎症和/或疼痛的方法，其通过将来自构树和忍冬的提取物作为有效成分施用于受试者来实现。来自构树的提取物可以通过，例如，利用水热流体醇水溶液、或疏水性溶剂进行提取来制备。另外，含水醇提取物也可以利用疏水性溶剂提取。然而，提取方法不局限于此。来自忍冬的提取物可以通过，例如，利用水热流体、醇水溶液、或疏水性溶剂进行提取来制备。然而，提取方法不局限于此。为了用于根据本发明的药物组合物中，来自构树的富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物可以作为来自构树根部树皮的提取物来使用，且来自忍冬的乙醇提取物可以作为来自忍冬的提取物来使用。来自构树的富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物可以通过，例如，使用乙醇提取构树，真空条件下干燥所述提取物，和利用乙酸乙酯分馏所述提取物来制备。然而，多种用于制备富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物的方法中的任一种也可以用于此。所用的乙醇的量可以在5-100%，且优选50-100%的范围内。根据本发明的药物组合物中作为有效成分使用的来自构树的富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物与来自忍冬的乙醇提取物的重量比可以在10.1-110的范围内，优选10.5-14，更优选11。根据本发明的药物组合物可以作为适合于根据制药领域中普遍使用的方法口服施用并以施用单位制备的制剂或作为注射制剂来施用。适合于口服施用的制剂实例是硬胶囊和软胶囊、片剂、混悬剂、糖浆剂、散剂、持续释放制剂、肠溶衣制剂、颗粒剂、油糖剂、微粒剂、丸剂、提取物、液体制剂、芳香水制剂、乳剂、酏剂、流浸膏剂、沉淀制剂、酊剂、醑剂等。所述口服施用的制剂，除两种以上药物有效成分以外，可以包括，一种或多种无药物活性的常用载体。无药物活性载体的实例是填充剂，诸如淀粉、乳糖、羧甲基纤维素、或高岭土；粘合剂，诸如水、明胶、醇、葡萄糖、阿拉伯胶(GummiArabicum)、或黄蓍胶；崩解剂，诸如淀粉、糊精、藻酸钠；和润滑剂，诸如滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、或液体石蜡。另外，还可以使用用于促进溶解的溶解助剂。根据本发明的药物组合物可以通过，例如，口服施药、鼻内施药、静脉内施药、腹膜内施药、皮下施药、或局部施药，根据适合于药物施用类型和治疗有效剂量的方法来施用。所述药物组合物还可以通过利用其他已知的方法，例如雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceuticalScience)中公开的方法来施用。例如，注射剂可以通过利用生理学适合的缓冲溶液，例如Hank溶液，Ringer溶液，或盐水缓冲溶液来制备。所述溶液可以包括混悬液、稳定剂、和/或分散剂。备选地，根据本发明的药物组合物还可以以粉末形式制备，并且在施用前，可以与合适的载体，诸如无菌水一起使用。备选地，所述药物组合物可以以脂质体制剂、混悬液、或持续释放制剂来制备。所述药物组合物可以单独使用或与手术、激素治疗、药物治疗、和生物反应控制剂联合使用。本发明的药物组合物可以用于治疗多种需要抗炎和镇痛作用的疾病，诸如急性或慢性支气管炎(AcuteorchronicBronchitis)、哮喘(Asthma)、C0PD、特应性皮炎、银屑病、变应性鼻炎(Allergicrhinitis)、胃炎(Gastritis)、消化性溃疡(P印ticulcers)、肠易激综合征(Irritablebowelsyndrome)、胃食管返流疾病(gastroesophagealrefluxdisease)、月干炎(Hepatitis)、血管炎性疾病(Vascularinflammatorydiseases)、骨关节炎(osteo-arthritis)、风湿性关节炎(Rheumaticarthritis)、退行性关节炎(degeneraticarthritis)禾口多发性关节炎(polyarthritis)、腰痛(lumbago)、拔31jpSt^(achingpainsafterdentalextraction)>^^(headaches)>7^jp^(postoperativepains)禾口炎症、牙痛(toothache)、或痛经(menalgia)，并且所述药物组合物还可以用于治疗其他种类的疾病。本发明的药物组合物可以用于治疗多种炎性呼吸系统疾病、炎性自身免疫疾病、炎性皮肤疾病、炎性胃肠疾病、和炎性心血管疾病、炎性骨骼肌疾病，等。所述药物组合物的施用剂量和施用时间根据受试者的年龄、性别、状态、重量、施用途径、所用药物类型而不同。每日施用剂量可以在约0.0lug/kg10g/kg的范围内，并可以在0.01mg/kg100mg/kg的范围内。本文中使用的全部技术术语，除非另外定义，可以被理解为具有与相关
技术领域：
中一般技术人员已知的相同含义。另外，尽管在本说明书中引入了理想的方法和样品，但是与其类似或等同的方法和样品也包括在本发明的范围内。本说明书中提到的所有参考文献可以通过引用结合在本文中。本发明将参考以下实施例进行详述。然而，本发明不局限于这些实施例。实施例试剂和动物A23187和N-[2-环己基氧_4_硝基苯基]甲磺酰胺(NS-398)获自Biomol(PlymouthMeeting,PA)；2-氨基-5，6-二氢-6-甲基-4H-1，3-噻嗪盐酸盐(AMT)获自TocrisCooksonLtd.(UK)；花生四烯酸(AA，99%)，溴化3-G，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(MTT)，去甲二氢愈创木酸(NDGA)，泼尼松龙(prednisolone)，吲哚美辛(indomethacin)，阿司匹林(aspirin)，和脂多糖(LPS,大肠杆菌(Escherichiacoli)0127:B8)获自西格玛化学(SigmaChem.)(St.Louis,MO)；且培养试剂诸如DMEM和FBS获自GibcoBRL(GrandIsland，NY)，且量化蛋白质试剂盒获自Bio-Rad实验室(Hercules,CA)。雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠和ICR小鼠G周龄，无特殊病原体)获自Orient-bio(韩国)。实验室动物用标准实验室食物(PurinaKorea)和水自由喂养，并且在测试前至少7天时，在温度2022°C，相对湿度4060%，12小时/12小时(明/暗)的光照周期条件下的动物饲养室中调节动物。使用的动物测试设计得到KNU动物实验委员会(KIACUC-09-0012)的批准，并且该实验根据在韩国食品药品管理局(KoreaFood&DrugAdministration)关于保护和使用实验室动物的准则中考虑的道德规范标准来进行。统计学分析实验值表示为算术平均值士SD。统计学显著性通过进行ANOVA检验来确定。实施例1由构树和忍冬制备提取物构树由韩国的南部地区(靠近安东(Andong))收集。干燥构树的根部树皮，并且细切干燥的根部树皮并使其进行利用100%乙醇的提取过程。乙醇提取物在真空条件下干燥并将最终提取物分散在水中并用乙酸乙酯分馏，然后干燥乙酸乙酯馏分。干燥的乙酸乙酯馏分(EBP)用于实验。根据Son等Q001)中所述的方法，由EBP中分离PapyriflavonolA和构查耳酮A。忍冬获自东方医药市场(orientalmedicinemarket)。细切干燥的忍冬并然后使其进行利用70%乙醇的提取过程。乙醇提取物在真空条件下干燥并将干燥的乙醇提取物(ELJ)用于实验。根据Kawai等，1988中公开的方法，由该乙醇提取物中分离马钱子苷(Loganin)禾口猜芽菜苷(Sweroside)。EBP中异戊二烯化黄酮类化合物(papyriflavonolA和构查耳酮A)的量和ELJ中环烯醚萜(马钱子苷和獐芽菜苷)的量通过HPLC分析来验证。BL是包含比例为11(w/w)的EBP和ELJ的混合物。实施例2大鼠嗜碱性白血病-1(RBL-I)细胞培养和白三烯(LT)测量获自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC,Rocksville)的RBL-I细胞在加有10%FBS、2mM谷氨酰胺、和抗生素的RPMI1640中，在5%CO2和温度37°C条件下温育。将细胞置于96孔板中2小时，并预先用测试物质温育10分钟。测试物质溶解在DMSO中，并用合适浓度的无血清DMEM来稀释。将DMSO的终浓度调节为0.1%(ν/ν)0细胞活力根据Mossman(1983)中公开的方法，通过MTT测定来验证。为了激活5-L0X，将A-23187(离子载体，3μΜ)加至所述细胞，并根据Tries等O002)中公开的稍微改良的方法温育细胞15分钟。收集所用的培养基，并利用ELISA试剂盒(CaymanChem.)，根据制造商建议的方法，测量由5-L0X生成的半胱氨酰白三烯(LTC4/D4/E4)的浓度。已知当RBL-I细胞通过A23187(钙离子载体)激活时，通过5-L0X生成大量半胱氨酰-LTs。在本实验中，关于15分钟，由RBL-I细胞生成的LTC4/D4/&的量是1，109.5士93.6pg/ml，关于15分钟的基础水平为4.2士1.2pg/ml(η=3)。在上述条件下，当来自构树的富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物馏分(EBP)以lyg/ml、2yg/ml、5yg/ml、10yg/ml、和100μg/ml的量使用时，相应的抑制活性分别为5%、M%、96%、99%和99%。换言之，EBP剂量依赖性地抑制5-L0X-介导的LTC4/D4/h的生成(图1)。作为线性回归分析的结果，IC50值是3.1μg/ml。同时，当ELJ以10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、和250μg/ml的量使用时，相应的抑制活性分别为1^^6%.18^^74%和99%。换言之，ELJ具有相对弱的抑制活性，并且微弱地抑制5-L0X-介导的LTC4/D4/E4生成(IC50=78.7μg/ml)。包含EBP和ELJ的混合物比单独的EBP或ELJ更强地抑制5-L0X的活性。基于EBP的重量，IC50小于1μg/ml。当该混合物的抑制活性与EBP和ELJ的抑制活性的总和相比时，证实该混合物针对5-L0X活性的抑制作用比当分别使用EBP和ELJ时更强得多，并且因此存在由使用该混合物引起的协同作用。例如，当lyg/mlEBP和4g/mlELJ分别使用时，在各情形中，不发生针对生成白三烯(LT)的抑制活性。然而，当EBP和ELJ联合使用时(以重量比14)，抑制活性预测不到地协同增加至61%。当2yg/mlEBP和3μg/mlELJ分别使用时，针对生成白三烯(LT)的抑制活性分别为和0%。然而，当EBP和ELJ联合使用时(以重量比11.5)，抑制活性预测不到地协同增加至92%。当2.5μg/mlEBP和2.5μg/mlELJ联合使用时(以重量比11)，几乎完全抑制5-L0X-介导的LT生成并且抑制活性预测不到地协同增加至96%。该实验中使用的ELJ的量对应于这样的水平，在该水平下，当单独EJL使用时，白三烯生成抑制活性不出现。然而，当ELJ与EBP—起使用时，EBP的5-L0X抑制活性通过添加ELJ而大幅提高，并且包含EBP和ELJ的混合物表现出非常高的抑制作用。此外，另外的实验通过利用包含重量比为11的EBP和ELJ的混合物(BL)来进行。去甲二氢愈创木酸(NDGA)用作比较化合物，并且也具有强5-L0X抑制活性(在1口厘时，99%抑制活性)。实施例3对RAW264.7细胞中生成PGE2的影响进行该实验，以确定来自构树和忍冬的提取物对生成PGE2的影响，PGE2是炎性反应的介质。获自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC,Rocksvilie)的RAW264.7细胞在增补有10%FBS和1%抗生素(100U/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml链霉素(streptomycin))的DMEM中，在5%CO2和温度37°C条件下温育。根据Chi等O001)中公开的方法，用脂多糖(LPQ激活所述细胞。将细胞加载于96孔板OxlO5个细胞/孔)并预温育2小时，然后将测试物质和LPS(1μg/ml)加入其中，并且将由此生成培养基温育M小时，除非另外规定。培养基中PGE2的浓度通过利用PGE2的ELISA试剂盒(CaymanChem.Co.)，根据制造商建议的方法来测量。在50ug/ml浓度下EBP和BL统计学显著地抑制由RAW264.7细胞生成C0X-2-催化的PGE2，所述7细胞是LPS-处理的小鼠小噬细胞系(图2)。EBP和BL关于生成PGE2的IC50值分别为21.4μg/ml和29.0μg/ml。实施例4对花生四烯酸(AA)-诱导的小鼠水肿的影响AA-诱导的小鼠耳水肿测定用于确定抗炎动物模型中的体内抗炎活性。根据Kim等(1993)中公开的方法，将2%AA丙酮溶液涂于小鼠耳上(20μ1/耳)，并且在1小时后，利用刻度盘式测厚仪(Mitutoyo，日本)测量耳厚度。AA处理前1小时，将溶解在包含混合比为11的DMSO和水的混合物中的测试物质口服施用于小鼠(0.Iml/小鼠)。各组由5只小鼠组成，并且测量值通过算术平均值士S.D(表1的a)表示。表1的b表示与用AA处理的对照组相比的抑制活性％。*表示与AA处理的对照组相比P<0.05的显著性差异。表1权利要求1.一种用于预防、减轻、或治疗炎症和/或疼痛的药物组合物，所述药物组合物包含作为有效成分的第一物质，其选自由来自构树的提取物、来自构树的提取物的馏分及其药用盐组成的组；作为有效成分的第二物质，其选自由来自忍冬的提取物及其药用盐组成的组；和药用载体。2.一种用于预防或治疗选自由以下组成的组中的疾病的药物组合物炎性呼吸系统疾病、炎性自身免疫疾病、炎性皮肤疾病、炎性胃肠疾病、炎性心血管疾病和炎性骨骼肌疾病，所述药物组合物包含第一物质，其选自由来自构树的提取物、来自构树的提取物的馏分及其药用盐组成的组；第二物质，其选自由来自忍冬的提取物及其药用盐组成的组；和药用载体。3.一种用于预防或治疗选自由以下组成的组中的疾病的药物组合物急性或慢性支气管炎、哮喘、C0PD、特应性皮炎、银屑病、变应性鼻炎、胃炎、消化性溃疡、肠易激综合征、胃食管回流病、肝炎、血管炎性疾病、骨关节炎、风湿性关节炎、退行性关节炎、多发性关节炎、腰痛、拔牙后酸痛、头痛、术后疼痛和炎症、牙痛、和痛经，所述药物组合物包含第一物质，其选自由来自构树的提取物、来自构树的提取物的馏分及其药用盐组成的组；第二物质，其选自由来自忍冬的提取物及其药用盐组成的组；和药用载体。4.权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中所述来自构树的提取物的馏分是通过使用含水醇提取构树和使用疏水性溶剂分馏该醇提取物制备的馏分或富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物，且所述来自忍冬的提取物是乙醇提取物。5.权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中来自构树的提取物或来自构树的提取物的馏分与来自忍冬的提取物的重量比是10.110。6.权利要求1-3中任一项的药物组合物，其中来自构树的提取物或来自构树的提取物的馏分与来自忍冬的提取物的重量比是11。7.利用权利要求1-6中任一项的药物组合物制备的药物制剂，其中所述药物制剂选自由用于口服施用的制剂、适用于粘膜的制剂、注射制剂、吸入制剂、和外用制剂组成的组。8.权利要求7的药物制剂，其中所述用于口服施用的制剂选自由硬胶囊和软胶囊、片剂、混悬剂、糖浆剂、散剂、持续释放制剂、肠溶衣制剂、颗粒剂、油糖剂、微粒剂、丸剂、提取物、液体制剂、芳香水制剂、乳剂、酏剂、流浸膏剂、沉淀制剂、酊剂、醑剂组成的组。全文摘要本发明涉及用于减轻或治疗炎症和/或疼痛的药物组合物，所述药物组合物包括来自构树和忍冬的提取物作为有效成分。本发明基于这样的发现，即当来自构树的富含异戊二烯化黄酮类化合物的提取物和来自忍冬的乙醇提取物联合施用时，与所述提取物分别施用时相比，在体外和体内测试中获得优秀的协同性抗炎和镇痛作用。文档编号A61K36/60GK102292095SQ201080002411公开日2011年12月21日申请日期2010年12月7日优先权日2009年12月7日发明者孙建镐,方诚惠,郭义宗,金光淳,金完培,金显杓,金淳培申请人:Pharmaking株式会社,江原大学校产学协力团