专利名称：用于缓解神经突生长抑制的蛋白激酶a和/或酪蛋白激酶ⅱ的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经损伤或神经疾病领域，具体地，本发明涉及缓解神经元再生(例如神经突生长，neurite outgrowth)的抑制。
背景技术：
神经元延伸神经突以与其他神经元或其靶组织进行通讯。成体中枢神经系统 (CNS)中的这种神经元网络在损伤后仅不良地再生。这在本领域中是个问题，导致患者神经元网络损伤后的不良结局。成体哺乳动物中枢神经系统不能再生部分归因于与损伤的髓鞘质相关的神经突生长抑制剂。髓鞘质相关的糖蛋白(MAG)、Nogo-A(也称为网状蛋白4A，Reticulon 4A)和少突胶质细胞髓鞘质糖蛋白(OMgp)为可结合Nogo受体I(NgRl)的髓鞘质相关的神经突生长抑制剂。这些髓鞘质相关蛋白，Nogo-A、MAG以及OMgp通过结合Nogo受体将来自少突胶质细胞的信号传输至神经元中。该Nogo信号传导在中枢神经系统(CNS)的发育和维持中具有关键作用。它可抑制神经元的分化、迁移以及神经突生长，导致损伤的成体中枢神经系统恢复不良。Nogo-A通过被称为Nogo-66的结构域结合NgRl。Nogo-66结构域由66个氨基酸组成，单独的Nogo-66结构域(无Nogo-A的其他区域)足以抑制神经突生长。MAG(但既非 Nogo-A也非OMgp)不仅能通过NgRl而且能通过NgR2 (NgRl同源性蛋白)抑制神经突生长 (6)。NgRl使得信号传导复合物含有LING0-1和p75N 或TAJ/TROY (McGee和 Strittmatter Trends Neurosci 26,193-198(2003) ；Schwab φ, Trends Mol Med 12， 四3-四7(2006))。p75N 和TAJ/TROY均属于TNF α受体家族，且提出其作为用于启动抑制神经突生长的细胞内信号的主要组分。不确定NgR2是否使复合物含有LING0-1和ρ75·或 TAJ/TR0Y。尽管关于Nogo信号传导的信息在扩展，但关于控制该信号传导的机制的信息有限。这在本领域是个问题。已知细胞内cAMP的水平增加克服了 Nogo信号传导对于神经突生长的抑制性作用(16)。然而，cAMP克服Nogo信号传导的作用的详细机制尚未知。BDNF (神经营养因子神经生长因子家族的成员)不仅在体外刺激数种神经细胞的神经突生长(17-19，20)，而且部分地促进脊髓损伤的恢复。使用BDNF预处理提高了培养的神经元中细胞内cAMP的水平，甚至在存在髓鞘质相关抑制剂的情况下也允许神经元延伸神经突05)。另外，BDNF参与海马中损伤诱导的神经突萌发06)。这些报道表明，甚至在存在神经突生长的髓鞘质相关抑制剂的情况下，BDNF也可潜在辅助中枢神经系统中神经网络的再生。然而，该作用有限，且不足以实现神经元网络的完全再生。人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y显示了在使用维甲酸(RA)处理5天之后的BDNF 依赖性神经突生长(18)。SH-SY5Y细胞响应RA启动向神经元样细胞的分化，并开始表达神经元特异性蛋白。然而，通过RA自SH-SY5Y细胞分化的神经细胞仅显示有限的形态学变化。对于SH-SY5Y衍生的神经细胞的有效神经突生长，需要BDNF处理，否则需要使用RA进行较长时间的处理07)。在神经元方面已经研究了酪蛋白激酶II (CK2)。酪蛋白激酶II 参与神经元中两种不同表面蛋白的磷酸化。这两种蛋白都与Nogo受体无关。另外，在该领域中的研究完全依赖于对于酪蛋白激酶II抑制剂的使用。由此，本领域中已经研究了细胞内CK2的功能。已知细胞内CK2活性为神经突自身生长所需。已知存在细胞外CK2。然而， 如上所述，关于细胞外CK2的信息很大程度上尚属未知。更具体地，有信息表明，淀粉状蛋白β前体蛋白和神经蛋白聚糖Cfceuroglican C)可在神经元表面通过内源性细胞外CK2 而被磷酸化。然而，这些磷酸化对于神经突生长的作用(如果存在的话)尚属未知。酪蛋白激酶II已经在某些体外制剂中用于处理胶原/层粘连蛋白。这些处理从未涉及细胞。这些处理仅涉及诸如胶原或层粘连蛋白之类的基质蛋白的体外制剂。现有技术中，细胞的酪蛋白激酶II处理尚属未知。将外源性酪蛋白激酶II应用于细胞在现有技术中尚属未知。Ulloa 等(1993EMB0，卷 12，第 1633-1640 页)使用了反义寡核苷酸(antisense oligos)和特异性抑制剂来抑制N2A小鼠神经母细胞瘤细胞系的CK2活性。在既不使用维甲酸(RA)也不使用BDNF的情况下，N2A细胞也延伸神经突。通过使用N2A细胞系，他们发现， N2A细胞的神经突生长受到CK2耗竭的抑制，还发现CK2耗竭改变了微管相关蛋白MAPlB的磷酸化。MAPlB是细胞骨架重排所需要的，而细胞骨架重排为神经突生长所需。由此，他们得出结论，MAPlB磷酸化的改变通过CK2耗竭而导致神经突生长抑制。MAPlB磷酸化是细胞内的。已知与细胞骨架重排相关的其他蛋白在细胞内通过CK2磷酸化。这些细胞内磷酸化事件为神经突自身生长所需。由于正常神经元以及N2A细胞可在不受任何刺激的情况下而延伸神经突，推断这些细胞内磷酸化事件是由神经元内基础水平的细胞内CK2所催化。该论文不涉及Nogo信号传导。至今尚不了解磷酸化和Nogo信号传导之间的关系。迄今，Nogo信号传导调节机制尚未知。本发明设法克服现有技术相关的问题。
发明内容
成体神经组织再生不良或根本不发生再生是一个问题。这在由诸如损伤或疾病之类的因素引起的损害之后尤其是一个问题。已经识别了控制再生抑制的多种机制。一种这样的机制是通过Nogo的受体信号传导而抑制神经突生长。尽管该途径中的多种配体和受体得以良好表征，但现有技术中尚未揭示缓解该抑制的可靠途径。本发明已经解决了这些问题。通过对于Nogo信号传导的详细研究，本发明人已经识别了可抑制所述信号传导的途径。另外，本发明人已经识别了对于调节Nogo信号传导来说关键的Nogo受体内的特定分子靶。该靶是Nogo受体的丝氨酸观1。该残基的磷酸化消除了神经突生长抑制剂与受体结合，由此缓解神经再生抑制。另外，本发明人教导并证实了可通过诸如使用蛋白激酶A和/或酪蛋白激酶II处理而实现该目的的有效途径。本发明基于这些令人^C讶的发现。因此，一方面，本发明提供了一种用于缓解神经元的神经突生长抑制的方法，其中所述神经元包含Nogo受体，所述方法包括使所述神经元与能够导致Nogo受体磷酸化的组合物接触，其中所述组合物包含蛋白激酶A或酪蛋白激酶II。合适地，所述组合物包含蛋白激酶A和酪蛋白激酶II。合适地，所述磷酸化是与所述Nogo受体的丝氨酸281对应的氨基酸残基的磷酸化。合适地，所述Nogo受体是人NgRl。另一方面，本发明涉及蛋白激酶A多肽在制备用于脊髓损伤的药剂中的用途。另一方面，本发明涉及用于治疗脊髓损伤的蛋白激酶A多肽。另一方面，本发明涉及酪蛋白激酶II多肽在制备用于脊髓损伤的药剂中的用途。另一方面，本发明涉及用于治疗脊髓损伤的酪蛋白激酶II多肽。另一方面，本发明涉及用作药剂的组合物，其包含蛋白激酶A和酪蛋白激酶II。另一方面，本发明涉及上文所述的组合物在制备用于脊髓损伤的药剂中的用途。另一方面，本发明涉及用于治疗脊髓损伤的上文所述的组合物。另一方面，本发明涉及蛋白激酶A多肽或酪蛋白激酶II多肽在制备用于导致神经突生长的药剂中的用途。另一方面，本发明涉及用于导致神经突生长的蛋白激酶A多肽或酪蛋白激酶II多肽。另一方面，本发明涉及一种治疗受试者的脊髓损伤的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量能够导致Nogo受体磷酸化的组合物，其中所述组合物包含蛋白激酶A或酪蛋白激酶II。合适地，所述施用定位于损伤部位。
具体实施例方式Nogo信号传导可抑制中枢神经系统中神经元的神经突生长(3，4)、分化(9，10)、 迁移(1 以及突触形成(11)。因此，Nogo信号传导已被鉴定为中枢神经系统再生(在生理条件下不发生)的主要抑制因子。本发明人发现，Nogo受体的磷酸化(例如，通过酪蛋白激酶II(CD))抑制髓鞘质相关蛋白的结合，所述鞘质相关蛋白抑制诸如神经突生长之类的神经元再生。本发明人证实，脑源性神经营养因子(BDNF)可任选用于诱导Nogo受体的磷酸化，这阻抑神经母细胞瘤衍生的神经元的神经突生长的Nogo依赖性抑制。在进一步的实施方式中，细胞外CK2处理通过髓鞘质相关蛋白克服了神经突生长抑制。这例如在成体大鼠神经元中得以证实。因此， 本发明提供了用于控制Nogo信号传导并由此调节神经元再生的新策略。本发明人首次揭示了磷酸化与Nogo信号传导之间的关系。本发明人首次揭示了胞外结构域磷酸化对于神经突生长的Nogo依赖性抑制的作用。Nogo受体的磷酸化可能不为神经突自身生长所需，但它是克服神经突生长抑制所需要的。神经突生长的抑制发生在体内条件下，例如在中枢神经系统的损伤之后。另外，本发明人揭示了，Nogo信号传导抑制哺乳动物细胞(例如SH-SY5Y衍生的神经细胞)的神经突生长，并且该抑制受到使用CK2而无BDNF的细胞外处理的阻抑。CK2 处理抑制Nogo-66、MAG以及OMgp与其受体的结合，允许在这些神经突生长抑制剂的存在下的神经突生长。由此，本发明人有利地揭示了本发明的BDNF依赖性作用。合适地，BDNF不用于本发明的方法。合适地，特别从本发明的方法中省略了 BDNF。合适地，本发明的组合物不包含BDNF。定义术语“包含”(包括、含有)应理解为在本领域中具有其常规含义，即，包括指明的特征或特征组，但该术语不排除还存在任何其他指明的特征或特征组。Nogo 警体从广义上，“Nogo受体”可指介导神经突生长的Nogo依赖性抑制的任何蛋白，不仅特别指在经典膜定位意义上的受体(NgR)，还可指任何介导Nogo信号传导的任何Nogo结合蛋白(例如通过除NgR家族成员以外的蛋白)；实际上，本发明人使用正常神经元获得的结果显示了 CK2处理可阻断这种NgR非依赖性Nogo信号传导，以及NgR依赖性信号传导。然而，合适地，除非上下文另有指明，术语“Nogo受体”可具有本领域中的常规含义。NgRl与其同源性蛋白NgR2和NgR3属于具有8个富亮氨酸重复子区域的糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白的家族，所述蛋白不具有细胞内结构域。尽管NgRl可与Nogo-A、 MAG以及OMgp相互作用，但NgR2仅以维甲酸依赖性方式与MAG相互作用。该相互作用也可抑制神经突生长。尚不知晓NgR3的配体。NgRl使得复合物包含LING0-1和神经营养因子受体p75NTK。可选地，神经元中广泛表达的孤儿肿瘤坏死因子受体成员TAJ/TR0Y代替？75-包含在所述复合物中。尚不知 NgR2是否可使复合物具有LING0-1、p75NTK或TAJ/TR0Y(如见于NgRl)。因此，Nogo信号传导可至少通过少突胶质细胞中的至少三种配体启动，可通过至少两种受体将信号转导至神经元中。Nogo信号传导中特异性的配体-受体系统对于神经突生长抑制的相对作用在不同神经细胞类型中可不同。 本发明涉及存在于细胞表面的Nogo受体。事实上，本发明的具体教导是，外源性物质用于激发靶细胞的细胞表面上Nogo受体的磷酸化。因此，合适地，本文所使用的术语 "Nogo受体”是指存在于靶细胞的细胞表面的Nogo受体蛋白。合适地，所述靶细胞是脊椎动物靶细胞，更合适地，是哺乳动物靶细胞，最合适地，是人靶细胞。在一些实施方式中，所述靶细胞最合适地是待治疗的受试者所具有的人细胞，例如人神经元，例如成体神经元。广义上，术语“Nogo受体”是指任何已知的Nogo受体(例如NgRl、NgR2或NgR3) 的多肽。另外，在靶向Nogo受体中，多于一种的Nogo受体可被磷酸化。这可给本发明带来有利之处，例如缓解不依赖于特定Nogo受体类型(表达于所选的特定靶细胞)的神经突生长抑制。另外，可通过靶向多种Nogo受体蛋白而实现较强和/或较迅速的作用。重要的是要注意到各Nogo受体在氨基酸残基281处具有保守丝氨酸。因此，根据本发明的Nogo受体突变体可同样包括任何已知的NgR多肽，条件是它们具有所讨论的特定突变或取代。合适地，根据本发明的Nogo受体是NgRl、NgR2或NgR3中的一种或多种。更合适地，根据本发明的Nogo受体是NgRl或NgR2中的一种或多种。这样一个优点是这些Nogo 受体表征较好，并因此适于在体内产生更特定或确定的作用。最优选地，根据本发明的Nogo 受体是NgRl。这具有许多优点，其中一些优点列出在实施例部分。本发明主要涉及脊椎动物(例如哺乳动物)应用。因此，合适地，本发明的Nogo受体是脊椎动物(例如哺乳动物)Nogo受体。最合适地，本发明的Nogo受体是人Nogo受体。人Nogo受体具有与人Nogo受体氨基酸序列对应的多肽序列。自然地，根据本发明的Nogo 受体多肽可通过任何合适的方法来制备，例如从非人宿主细胞重组制备。然而，为了便于理解，如果其氨基酸序列与人氨基酸序列对应，则将非人细胞制备的Nogo受体多肽认为是人 Nogo受体。本文揭示并讨论了 Nogo受体突变体。从上述讨论应理解，这些突变体可包含多种各Nogo受体亚型个体(例如NgRl、NgR2、NgR3等)中的一种。为了便于理解，在Nogo受体参考序列的上下文中讨论了特定的氨基酸或特定的突变。参考序列应理解，将使用其在多肽上的编号位置来讨论特定的氨基酸残基，这是本领域常规的方法。当使用编号位置来引用特定的氨基酸残基时，使用人NgRl的氨基酸序列作为参考序列来取编号。最合适地，Nogo受体参考序列是NM023004的人NgRl氨基酸序列MKRASAGGSRLLAWVLWLQAWQVAAPCPGACVCYNEPKVTTSCPQQGLQAVPVGIPAASQRIFLHGNRISHVPAASFRACRNLTILWLHSNVLARIDAAAFTGLALLEQLDLSDNAQLRSVDPATFHGLGRLHTLHLDRCGLQELGPGLFRGLAALQYLYLQDNALQALPDDTFRDLGNLTHLFLHGNRISSVPERAFRGLHSLDRLLLHQNRVAHVHPHAFRDLGRLMTLYLFANNLSALPTEALAPLRALQYLRLNDNPWVCDCRARPLWAWLQKFRGSSSEVPCSLPQRLAGRDLKRLAANDLQGCAVATGPYHPIVWTGRATDEEPLGLPKCCQPDAADKASVLEPGRPASAGNALKGRVPP⑶SPPGNGSGPRHINDSPFGTLPGSAEPPLTAVRPEGSEPPGFPTSGPRRRPGCSRKNRTRSHCRLGQAGSGGGGTCDSEGSGALPSLTCSLTPLGLALVLWTVLGPC如在本领域中所公知的，这用于对目的残基进行定位。这并非总是严格的计数-必须注意上下文。例如，如果目的蛋白(例如，人EHD2)的长度稍有不同，则人序列中对应于(例如)S281的正确残基的定位可需要对序列进行比对，且需要选取等同或对应的残基，而非仅取目的序列的第281位残基。这在本领域技术人员的技术范围之内。附图
中给出了示例的比对。对于本领域技术人员显而易见的是，本发明主要参考NgRl来举例说明。应注意， NgRl表现出与其他NgR家族多肽具有高序列同源性。因此，在一些方面，本发明涉及NgRl 在开发用于应用其他NgR家族蛋白的治疗剂中的用途。在本发明的一些方面，期望采用测试特定的多肽是否被认为是NgR家族多肽的功能性试验。除了(或替代)上文所述基于序列的标准，还可使用下述功能性标准结合配体， 例如本文所述的那些配体。另外，还可使用神经突生长测定中起作用的能力，例如，通过在实施例部分描述的使用RA处理而导致的SH-SY5Y细胞中的过表达。因此，为了确定特定多肽是否实际上被认为是NgR家族多肽，可检测该多肽是否在神经突生长测定中起作用。如果NgR蛋白支持本文中的Nogo信号传导，该多肽可被认为是Nogo受体(NgR家族多肽)。 当然，本发明的目的是缓解神经突生长抑制，当评价NgR蛋白时应注意，野生型蛋白在该测定中抑制神经突生长，特别在未使用本发明的激酶处理的情况下。本发明的Nogo受体突变体本发明涉及Nogo受体多肽，其特征在于，丝氨酸281被除了丝氨酸以外的任何其他氨基酸取代。合适地，S281被非磷酸基受体氨基酸取代，因此，合适地S281不是S、T或 Y。
合适地，本发明提供了具有S281A的NogoR，其优点在于该位点不可磷酸化。这意味着，该受体具有抵抗配体结合的CKII/PKA抑制的生物学特性。换句话说，这样的突变体具有甚至在存在CKII/PKA的情况下响应Nogo配体而进行信号传导的新功能。合适地，本发明提供了具有S281D的NogoR，其优点在于模仿S281的磷酸化。这意味着该受体具有被永久“关闭”的生物学特性，这样通过使用该受体使得神经突生长抑制得以永久缓解。更具体地，该受体不结合Nogo配体。换句话说，这样的突变体具有不响应 Nogo配体而结合(或信号传导)的新功能，不管是否存在CKII/PKA均如此。合适地，除非特别指明(例如在对应于S281的残基处)，否则本发明的Nogo受体多肽(NogoR)包含NM023004序列。本发明还涉及下述NogoR 与NM023004具有至少60%同一性，合适地与NM023004 具有至少70%同一性，合适地与与NM023004具有至少75%同一性，合适地与NM023004具有至少80%同一性，合适地与NM023004具有至少85%同一性，合适地与NM023004具有至少90%同一性，合适地与NM023004具有至少95%同一性，合适地与NM023004具有至少 97%同一性，合适地与NM023004具有至少98%同一性，合适地与NM023004具有至少99% 同一性，所述NogoR总是具有残基S281不是丝氨酸的特征。合适地，截短形式与跨越所述截短形式的长度的该序列对应。合适地，根据本发明的NogoR多肽包含至少30个氨基酸，合适地至少80个氨基酸，合适地至少130个氨基酸， 合适地至少180个氨基酸，合适地至少230个氨基酸，合适地至少280个氨基酸，合适地至少330个氨基酸，合适地至少380个氨基酸，合适地至少382个氨基酸(例如，全长NgR2)， 合适地至少402个氨基酸(例如，全长NgR3)，合适地至少417个氨基酸(例如，NgRl)。多肽和突变体Nogo受体序列可以被修饰以用于本发明。通常，所进行的修饰使包含丝氨酸观1(或在所述位置的取代)的序列区域得到保持。所进行的氨基酸取代可以是例如1、2或 3至10、20或30个取代，条件是所修饰的序列保留所需的S281残基。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物，例如用于增加治疗上施用的多肽的半衰期。修饰同样适用于本发明的PKA或CKII多肽，在该情况下总是需要在引入任何突变或取代之后保留PKA/CKII激酶活性。可例如根据下表来进行保守性取代。第二列中相同区块中的氨基酸和优选地第三列中相同行中的氨基酸可相互取代
权利要求
1.一种用于缓解神经元的神经突生长抑制的方法，其中，所述神经元包含Nogo受体， 所述方法包括使所述神经元与能够导致Nogo受体磷酸化的组合物接触，其中，所述组合物包含蛋白激酶A或酪蛋白激酶II。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物包含蛋白激酶A和酪蛋白激酶II。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述磷酸化是指与所述Nogo受体的丝氨酸 281对应的氨基酸残基的磷酸化。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述Nogo受体是人NgRl。
5.蛋白激酶A多肽在制备用于脊髓损伤的药物中的用途。
6.蛋白激酶A多肽，其用于治疗脊髓损伤。
7.酪蛋白激酶II多肽在制备用于脊髓损伤的药物中的用途。
8.酪蛋白激酶II多肽，其用于治疗脊髓损伤。
9.一种用作药物的组合物，其包含蛋白激酶A和酪蛋白激酶II。
10.权利要求9所述的组合物在制备用于脊髓损伤的药物中的用途。
11.根据权利要求9所述的组合物，其用于治疗脊髓损伤。
12.蛋白激酶A多肽或酪蛋白激酶II多肽在制备用于导致神经突生长的药物中的用途。
13.蛋白激酶A多肽或酪蛋白激酶II多肽，其用于导致神经突生长。
14.一种治疗受试者脊髓损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的能够导致Nogo受体磷酸化的组合物，其中，所述组合物包含蛋白激酶A或酪蛋白激酶II。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述施用定位于所述损伤部位。
全文摘要
本发明涉及一种用于缓解神经元的神经突生长抑制的方法，其中所述神经元包含Nogo受体，所述方法包括使所述神经元与能够导致Nogo受体磷酸化的组合物接触，其中所述组合物包含蛋白激酶A或酪蛋白激酶。
文档编号A61K38/17GK102341117SQ201080009932
公开日2012年2月1日 申请日期2010年3月5日 优先权日2009年3月6日
发明者武井义则 申请人:医药研究委员会