一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法
【专利摘要】本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法。该检测方法首次以4’?碳酰氯?罗丹明为衍生试剂，使用超声辅助?原位衍生?分散液液微萃取技术对氨基酸类和单胺类神经递质进行衍生化，并利用多反应监测模式的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱进行定性定量检测。采用三种内标物（异丙肾上腺素，5?羟吲哚?2?羧酸，正亮氨酸）用于三类化学结构的神经递质线性方程建立。通过内标法定量，准确测定神经递质的存在。本发明具有简单、快速、灵敏度高、选择性好，且回收率结果良好等优势，能快速、准确测定神经递质。
【专利说明】
一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于原位衍生测定多种神经递质的 检测方法，尤其是涉及一种利用4'-碳酰氯-罗丹明作为衍生试剂，超声辅助-原位衍生-分 散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱同时检测多种神经递质的分析方法。
【背景技术】
[0002] 神经递质(neurotransmitter)在突触传递中是担当"信使"的特定化学物质。神经 递质分子极性强、缺乏能够灵敏检测的化学结构，并且在脑微透析液中和尿液中的含量低、 基质干扰严重。采用传统的紫外-可见光谱法、色谱法及质谱法检测的灵敏度都很低，难以 准确定量。化学衍生手段是提高色谱-质谱检测灵敏度的一个很好的解决办法。衍生化技术 能够有效的提高检测灵敏度，现有技术中，对于神经递质的检测分析多采用邻苯二甲醛 (0ΡΑ)或者苯甲酰氯为衍生试剂，但邻苯二甲醛衍生物不稳定、重复性较差、衍生过程时间 长等缺点，一定程度上限制了它的广泛使用；苯甲酰氯易水解，且对皮肤、眼睛和呼吸道具 有刺激作用;且采用邻苯二甲醛(0ΡΑ)或者苯甲酰氯进行检测时，无法同时检测出氨基酸类 和单胺类的神经递质，耗时长，步骤繁琐。因此，开发一种衍生反应条件温和、简单、高效、灵 敏度高且能多成分同时检测的分析方法成为了亟待解决的问题。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术存在的反应时间长，灵敏度低，基质干扰严重，不能同时测定多种成 分，污染严重等问题，本发明提供了一种基于原位衍生测定多种神经递质的分析方法，本发 明利用超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取的样品前处理技术，联合超高效液相色谱三重 四极杆质谱分离检测系统，能够同时测定待测样品中多种氨基酸类和单胺类神经递质，大 大提高了质谱检测灵敏度、选择性和准确度，且得到了良好回收率。
[0004] 本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为： 本发明提供了一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法，其特征在于:所述的 神经递质与衍生试剂4'_碳酰氯-罗丹明发生超声辅助-原位衍生反应，经超声辅助-分散液 液微萃取富集纯化，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联 质谱系统进行分析检测。
[0005] 上述检测方法具体包括以下步骤： a.超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取:取20-50 uL神经递质标准品混合溶液或待 测样品，30 yL内标物溶液、800-1500 yL pH 8.0-10.0的NaHC03-Na2C03缓冲溶液，加入离 心管中，注入80-200 uL萃取剂和200-300 uL 4'-碳酰氯-罗丹明分散剂溶液，混合均匀后 放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，反应结束后高速离心，吸 取下层有机相并用乙腈定容到200 uL，得氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液； 所述内标物溶液是由10 μL浓度为lXl(T5m〇l/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 度 为1 X 1(T5 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10汕浓度为1 X 1(T5 mol/L正亮氨酸的乙 腈溶液组成； 所述的萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴代环己烷，1-溴代辛烷，溴苯； 所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b.将上述氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液经滤膜过滤后，利用超高效液 相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。
[0006] 进一步的，步骤a中所述的萃取剂最优化的为溴苯;所述分散剂最优化的为乙腈。
[0007] 进一步的，步骤a中所述的4'-碳酰氯-罗丹明-分散剂溶液的摩尔浓度为IX 10-2 mol/L〇
[0008] 本发明所使用的衍生化试剂4'-碳酰氯-罗丹明采用以下方法制备而成：将0.922 g 4'-羧基-罗丹明加入30 mL氯化亚砜，滴入0.1 mL N，N-二甲基甲酰胺，磁力搅拌，升温至 50~80°C，反应5~6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色固体，用乙醚重结晶，得紫 色针状晶体即为4'-碳酰氯-罗丹明。
[0009] 进一步的，所述步骤a中所述超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取为在温度20-50 °C，超声频率为40 KHz条件下反应1 -5 min。
[0010] 进一步的，所述神经递质包括氨基酸类神经递质和单胺类神经递质；所述氨基酸 类神经递质包括谷氨酸，γ -氨基丁酸，门冬氨酸，色氨酸，甘氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸;所述 单胺类神经递质包括:左旋多巴，多巴胺，去甲肾上腺素，肾上腺素，3-甲氧酪胺，去甲变肾 上腺素，变肾上腺素，高原儿茶酸，3，4-二羟基扁桃酸，DL-3，4-二羟基苯基二醇，高香草酸， 香草扁桃酸，3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇，羟色胺酸，5-羟色胺，5-羟吲哚乙酸，犬尿素，3-羟 基犬尿氨酸，3-羟基邻氨基苯甲酸，犬尿酸。
[0011] 本发明所使用的超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷 伦SB C18色谱柱：2.1 mm X 50 mm，1.8 μπι，进样体积为2 yL，柱温30 °C，采用梯度洗脱 法。
[0012] 上述的梯度洗脱法，流速为0.2 mL/min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸， 流动相B为乙腈含有0.1%甲酸;色谱分离梯度条件为0 min流动相组成为95%A+5%B，3 min时 85%A+15%B，5 min时65%A+35%B，12 min时5%A+95%B，16 min时5%A+95%B或0 min流动相组成 为95%A+5%B，2 min时88%A+12%B，6 min时60%A+40%B，10 min时5%A+95%B，12 min时5%A+95% B;质谱的条件为:干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 °C， 流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
[0013 ]本发明流动相中各分数均指体积分数。
[0014]本发明所述的神经递质标准品混合溶液为将神经递质标准品加入体积分数为50% 的乙腈/水配制，得到浓度为5.0 X 1(T5 mol I/1的神经递质标准品溶液。本发明所使用的 三种内标物用于三类化学结构的神经递质的线性方程建立:异丙肾上腺素（IP)，5-羟吲哚-2_羧酸(5-HICA)，正亮氨酸(NIe)。
[0015]本发明首次使用4'-碳酰氯-罗丹明对多种神经递质分子的活性基团进行衍生化， 建立的超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取技术简单、快速、高效。由于4 碳酰氯-罗丹明 试剂结构中含有一个稳定的分子内永久正电荷，利用原位衍生联合超高效液相色谱三重四 极杆质谱法，能够带来显著的质谱增敏检测效果。另外，本发明克服了常规方法的等问题， 大大提高了质谱检测灵敏度、选择性和准确度，且得到了良好回收率结果。本发明对脑微透 析液和尿液中的氨基酸类和单胺类神经递质的同时检测提供了一种高效、可靠的技术手 段。本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确且高灵敏地同时检测氨基酸类和单胺类 神经递质。
[0016] 本发明中首次使用含有一个分子内永久正电荷的衍生化试剂4'-碳酰氯-罗丹明 来衍生神经递质。因此，神经递质通过衍生化反应得到的衍生物进行检测时，衍生产物母离 子能够产生特异性的含有罗丹明结构的报告离子，带来显著的质谱增敏检测效果。通过内 标法定量，带来了该检测方法良好的灵敏度、选择性和准确度，和良好的回收率结果;本发 明通过将传统的、毒性的氯代萃取溶剂更换为溴代溶剂，解决了环境不友好的问题。氨基酸 类和单胺类神经递质所含有的活性氨基或酚羟基，能够和衍生试剂4碳酰氯-罗丹明迅速 反应。以高原儿茶酸(D0PAC)为例，4'-碳酰氯-罗丹明为衍生试剂的衍生化反应示意图如下 所示：
本发明的优点及有益效果： 1.本发明首次使用4'-碳酰氯-罗丹明作为衍生化试剂对神经递质进行原位衍生，衍 生化反应条件温和、快速，衍生产物稳定，衍生化技术显著提高了分析物的色谱分离度和检 测灵敏度。
[0017] 2.本发明所提供的超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取前处理技术，联合超高 效液相色谱三重四极杆质谱检测手段，采用内标法定量，实现了多种神经递质的简单、快 速、准确、高灵敏的同时测定且环境友好。
[0018] 3.本发明的检测分析方法成功应用于大鼠脑微透析液或尿液中多种神经递质的 检测，方法适用性良好。
【附图说明】
[0019]图1为实施例1中针对帕金森病和阿尔茨海默症的神经递质标准品分析方法质谱 检测分离图。
[0020] 图2为实施例1中高原儿茶酸(D0PAC)衍生物质谱裂解机理示意图。
[0021] 图3为实施例2中帕金森病大鼠脑微透析液中神经递质的质谱检测分离图。
[0022] 图4为实施例4中针对抑郁症的神经递质标准品分析方法质谱检测分离图。
[0023] 图5为实施例5中抑郁症大鼠脑微透析液中神经递质的质谱检测分离图。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不 对其内容进行限定。
[0025]本发明中衍生化萃取物经0.45 μπι滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串 联质谱系统进行分析检测。
[0026]本发明所使用的衍生化试剂4'-碳酰氯-罗丹明合成方法如下:将0.922 g 4'-羧 基-罗丹明（2 mmol，合成方法参考
【申请人】发表的论文Journal of Chromatography A, 2016, 1437: 49-57. ),30.0 mL氯化亚砜加入100 mL单口烧瓶中，滴入0.1 mL Ν,Ν-二甲基 甲酰胺，磁力搅拌，升温至50~80°C，反应5~6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色 固体。用乙醚重结晶，得到0.42 g紫色针状晶体即为4'-碳酰氯-罗丹明，收率45.5%。
[0027] 实施例1 针对帕金森病和阿尔茨海默症大鼠脑微透析液中神经递质标准品分析方法： 神经递质标准品（19种，购自Sigma试剂公司）用乙腈/水配制，得到浓度为5.0 X 10_5 mol Γ1的神经递质标准品溶液。取50 nL神经递质标准品溶液置于1.5 mL的离心管中，向所 述的标准品溶液中加入30 yL内标物溶液（内标物溶液由10 yL浓度为1ΧΠΓ5 mol/L异丙肾 上腺素的乙腈溶液，10 UL浓度为lXl(T5m〇l/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 uL浓度 为1父10-5!11〇1/1正亮氨酸的乙腈溶液组成）、加入800 111^!19.5的他!^03-恥20)3缓冲溶 液，随后立即加入80 uL溴苯和200 uL摩尔浓度为0.01 mol/L的4'-碳酰氯-罗丹明-乙腈溶 液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀，将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min(25 °C，40 KHz)后取出，高速离心（10000 rpm，2 min)， 有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 HL。衍生化产物溶液经滤膜过滤后取2 yL进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分 析； 检测分析:流动相六为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸;色谱 分离梯度条件为〇 min流动相组成为95%A+5%B，3 min时85%A+15%B，5 min时65%A+35%B，12 min时5%A+95%B，16 min时5%A+95%B;质谱条件为：干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾 器气压40 psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV; 图1为针对帕金森病和阿尔茨海默症的神经递质标准品分析方法质谱检测分离图，分 析物之间分离度良好。质谱分析实验结果表明，分析物多反应监测模式(MRM)下产生相同的 主要子离子m/z 398.1和m/z 443.1，m/z 398.1用作定量子离子，m/z 443.1用作定性子离 子。以高原儿茶酸（D0PAC)衍生物为例，图2为高原儿茶酸（D0PAC)衍生物质谱裂解机理 示意图，母离子为[M]+ m/z为1018.49能够产生两个特异性子离子m/z 398.1和m/z 443.1。对MRM模式的参数进行了优化，分析物的定量离子对、定性离子对、最优化碎裂电压 (V)和电离能(eV)以及分析方法的相关系数、检出限见表1。
[0028]表 1
实施例2 1.大鼠分组、给药及脑微透析取样： 将16只体重为200~250 g的雄性SD大鼠分为2组，第1组为对照组，第2组为模型组。帕 金森模型造模过程及行为学评价与文献（Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2011，98: 286-291)保持一致。上述模型组大鼠需要经历以下3个实验阶段:第1个阶段，为 造模成功后且能自由活动的帕金森病模型大鼠，自由饮水、饮食，在清醒状态下自动收集脑 微透析液，并采用上述分析方法测定其中神经递质的含量;第2阶段，对第1阶段的大鼠迅速 灌胃给予黄芩素(280 mg · kg^1)进行治疗，并自动收集脑微透析液;待神经递质浓度恢复到 接近第一阶段时，准备实施第3阶段的实验；第3阶段，上述大鼠给予传统西药美多巴（60 mg · kg，进行治疗，并自动收集脑微透析液;超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超 高效液相色谱三重四极杆质谱法测定脑微透析液中神经递质： 上述3个不同实验阶段的脑微透析液各取20 uL，分别加入30 uL内标物溶液（内标物溶 液由10 yL浓度为1X10-5mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 uL浓度为1X10-5mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 nL浓度为1Χ10-5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成），加入 1000 yL pH为9的NaHC〇3-Na2C〇3缓冲溶液，分别加入100 uLl-溴-3-甲基丁烷和200 yL摩尔 浓度为IX l〇_2mol/L 4'-碳酰氯-罗丹明乙腈溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。 将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min(35 °C， 40 KHz)后取出。高速离心（10000 rpm，2 min)，有机相沉积在离心管底部，用微量注射器 吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 yL，经滤膜过滤，采用同实施例1相同的 梯度洗脱及质谱条件进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。图3为帕金森病大 鼠脑微透析液神经递质质谱检测分离图。
[0029]正常组和帕金森病模型组大鼠（含3个实验阶段)脑微透析液中神经递质含量(n= 3)，以及正常大鼠脑微透析样品测定回收率结果，如表2所示。
[0030]表 2
与正常组比较，#表示P < 0.05，###表示P < 0.01;与实验阶段1比较，*表示 P < 0.05，*** 表示 P < 0.01; 实施例3 1.阿尔茨海默症模型大鼠及尿液取样： 8只体重为200~250 g的雄性SD大鼠，需要经历以下2个实验阶段:第1个阶段为正常状 态大鼠，自由饮水、饮食，收集其尿液，用于检测神经递质浓度;第2个实验阶段，阿尔茨海默 症模型大鼠造模过程及行为学评价参照文献进行（Journal of Mass Spectrometry, 2015, 50: 354-363)，并与文献一致，表明造模成功。自由饮水、饮食，收集其尿液。
[0031]超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法测 定脑微透析液中神经递质含量： 上述2个不同实验阶段的尿液各取50 yL，分别加入30 yL内标物溶液（内标物溶液由10 口1^农度为1\10-5111〇1/1异丙肾上腺素的乙腈溶液，10汕浓度为1\10- 5111〇1/15-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 uL浓度为1ΧΠΓ5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组成），加入1500 uL ?!18的似!10)3-似20)3缓冲溶液，分别加入200汕溴代环己烷和300汕摩尔浓度为1\10一 2 m〇l/L4'_碳酰氯-罗丹明乙腈溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。将该混合液放入 超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，5 min( 10 °C，40 KHz)后取出。 高速离心（10000 rpm，2 min)，有机相沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移 至另一小瓶中，用乙腈定容至200 yL。经滤膜过滤，采用同实施例1相同的梯度洗脱及质谱 条件进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。
[0032] 正常组和阿尔茨海默症模型组大鼠尿液中神经递质含量(n=3)，以及正常大鼠尿 液样品测定回收率结果，如表3所示。
[0033]表 3
与正常组比较，*表示P < 0.05，***表示P < 0.01 实施例4 针对抑郁症大鼠脑微透析液的神经递质标准品分析方法： 神经递质标准品（18种，购自Sigma试剂公司）用乙腈/水配制得到浓度为5.0 X 10-5 mol I/1的神经递质标准品溶液，取50 yL置于1.5 mL的离心管中，加入30 yL内标物溶液（内 标物溶液由10 μL浓度为1XUT5 mol/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 uL浓度为1ΧΠΓ5 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 度为1ΧΠΓ5 mol/L正亮氨酸的乙腈溶液组 成），加入800 yL pH 9.5的NaHC03-Na2C03缓冲溶液，随后立即加入80 uLl-溴代辛烷和200 HL摩尔浓度为1ΧΠΓ2 m〇l/L4'_碳酰氯-罗丹明丙酮溶液，漩涡混匀器震荡5 s使溶液混合 均匀。将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，1 min (25 °C，40 KHz)后取出。高速离心（10000 rpm，2 min)，有机相沉积在离心管底部，用微量 注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 uL。衍生化产物溶液经有机滤膜 过滤后取2 uL进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析。
[0034]检测分析:流动相厶为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸； 色谱分离梯度条件为：〇 min流动相组成为95%A+5%B，2 min时88%A+12%B，6 min时60%A+40% B，10 min时5%A+95%B，12 min时5%A+95%B;质谱的条件同实施例1，图4为针对抑郁症大鼠脑 微透析液神经递质标准品分析方法质谱检测分离图，分析物之间分离度良好。质谱分析实 验结果表明，分析物多反应监测模式（MRM)下产生相同的主要子离子m/z 398.1和m/z 443. l，m/z 398.1用作定量子离子，m/z 443.1用作定性子离子。对MRM模式的参数进行了优 化，分析物的定量离子对、定性离子对、最优化碎裂电压(V)和电离能（eV)以及分析方法的 相关系数、检出限和回收率见表4。
[0035]表 4
实施例5 1.大鼠分组、给药及脑微透析取样： 将16只体重为200~250 g的雄性SD大鼠分为2组，第1组为正常对照组，第2组为抑郁症 模型组，抑郁症模型大鼠造模参照文献（Analytical Chemistry, 2012，84: 10044-10051)进行，造模成功，与文献结果一致。抑郁症模型组大鼠需要经历以下3个实验阶段:第 1个实验阶段为抑郁症模型大鼠造模成功后，自由饮水、饮食，自动收集脑微透析液;第2个 实验阶段，对第1个实验阶段的大鼠灌胃给予和厚朴酚(40.0 mg · kg^1)，自动收集脑微透析 液，待和厚朴酚药效消失，该组大鼠进入第3个实验阶段;第3个实验阶段，对第2个实验阶段 的大鼠灌胃给予传统西药"氟西汀"（l〇.〇mg · kg"1)，自动收集脑微透析液。
[0036]超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱法测 定脑微透析液中神经递质： 上述3个不同实验阶段的脑微透析液各取20 yL，加入含内标物，加入800 yL pH 9.5的 NaHC03-Na2C03缓冲溶液，加入80 uL萃取剂和200 uL分散剂(含衍生试剂）的混合溶液，漩涡 混匀器震荡5 s使溶液混合均匀。将该混合液放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍 生-分散液液微萃取，1 min(25 °C，40 KHz)后取出。高速离心（10000 rpm，2 min)，有机相 沉积在离心管底部，用微量注射器吸取沉积相转移至另一小瓶中，用乙腈定容至200 uL。衍 生化产物溶液经滤膜过滤，进行超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测分析:流动相六为5% 乙腈水溶液含有〇. 1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸;色谱分离梯度条件为:0 min流动 相组成为95%A+5%B，2 min时88%A+12%B，6 min时60%A+40%B，10 min时5%A+95%B，12 min时 5%A+95%B;质谱的条件同实施例1。
[0037] 实施例5中，正常组和抑郁症模型组大鼠（含3个实验阶段)脑微透析液神经递质含 量(n=3)如表5所示。
[0038] 表5
与正常组比较，*表示P < 0.05，***表示P < 0.01;与实验阶段1比较，#表示 p < 〇.〇5，### 表示 P < 0.01; 对比例1 该对比例过程与实施例1相同，不同在于衍生化反应过程中：衍生化过程采用邻苯二甲 醛(0ΡΑ)为衍生试剂。
[0039] 对比例2 该对比例过程与实施例1相同，不同在于衍生化反应过程中：衍生化过程采用苯甲酰氯 为衍生试剂。
[0040] 对比例3 该对比例过程与实施例1相同，不同在于未经衍生化反应，采用高效液相色谱-电化学 直接检测法。
[0041 ]下表6为实施例1同对比例1、2和3的实验结果对比。
[0042]表 6
由表6可知，本发明利用超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取技术，具有快速、简单、灵 敏等优点。本发明分析方法检出限比对比例低5-100倍左右，具有较高的灵敏度。本发明使 用溴苯为萃取剂，代替了传统的氯代试剂，降低了实验过程中所使用的试剂的毒性，更符合 绿色化学的精神。
[0043] 本发明分析方法中神经递质的线性范围2.60 X 10-3-20.80 nM，检出限分布于7.42 X 10-4-0.48 nM之间，定量限分布于2.60 X 10-3-1.67 nM之间。表1-5结果表明，所建立的分 析方法能够很好地应用于检测大鼠脑微透析液和尿液中相关神经递质的含量。
[0044]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限 制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为 等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于原位衍生测定多种神经递质的检测方法，其特征在于:所述的神经递质与 衍生试剂4'-碳酰氯-罗丹明发生超声辅助-原位衍生反应，经超声辅助-分散液液微萃取富 集纯化，得到的衍生化产物经滤膜过滤后利用超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进 行分析检测。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:具体包括以下步骤： a. 超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取:取20-50 uL神经递质标准品混合溶液或待 测样品，30灿内标物溶液、800-1500 111^!18.0-10.0的似!1〇)3-似2〇)3缓冲溶液，加入离 心管中，注入80-200 uL萃取剂和200-300 uL 4'-碳酰氯-罗丹明分散剂溶液，混合均匀后 放入超声波振荡器中进行超声辅助-原位衍生-分散液液微萃取，反应结束后高速离心，吸 取下层有机相并用乙腈定容到200 uL，得氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液； 所述内标物溶液是由10 μL浓度为lXl(T5m〇l/L异丙肾上腺素的乙腈溶液，10 度 为1 X 1(T5 mol/L 5-羟吲哚-2-羧酸的乙腈溶液和10 uL浓度为1 X 1(T5 mol/L正亮氨酸的乙 腈溶液组成； 所述的萃取剂为1-溴-3-甲基丁烷，溴代环己烷，1-溴代辛烷，溴苯； 所述的分散剂为丙酮，乙腈，甲醇或乙醇； b. 将上述氨基酸类和单胺类神经递质衍生化产物溶液经滤膜过滤后，利用超高效液 相色谱三重四极杆质谱系统进行定性定量分析检测。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:步骤a中所述的萃取剂为溴苯;所述分 散剂为乙腈。4. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:步骤a中所述的4碳酰氯-罗丹明-分 散剂溶液的摩尔浓度为1 X ΠΓ2 mol/L。5. 根据权利要求2或4所述的检测方法，其特征在于，所述4'-碳酰氯-罗丹明采用以下 方法制备而成:将0.922 g 4'-羧基-罗丹明加入30 mL氯化亚砜，滴入0.1 mL N，N-二甲基 甲酰胺，磁力搅拌，升温至50~80°C，反应5~6 h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得紫色 固体，用乙醚重结晶，得紫色针状晶体即为4'-碳酰氯-罗丹明。6. 根据权利要求2任一项所述的检测方法，其特征在于:所述步骤a中所述超声辅助-原 位衍生-分散液液微萃取为在温度20-50°C，超声频率为40 KHz条件下反应1 -5 min。7. 根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述神经递质包括氨基酸类神经 递质和单胺类神经递质;所述氨基酸类神经递质包括谷氨酸，γ -氨基丁酸，门冬氨酸，色氨 酸，甘氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸;所述单胺类神经递质包括：左旋多巴，多巴胺，去甲肾上腺 素，肾上腺素，3-甲氧酪胺，去甲变肾上腺素，变肾上腺素，高原儿茶酸，3,4_二羟基扁桃酸， DL-3，4-二羟基苯基二醇，高香草酸，香草扁桃酸，3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇，羟色胺酸，5-羟色胺，5-羟吲哚乙酸，犬尿素，3-羟基犬尿氨酸，3-羟基邻氨基苯甲酸，犬尿酸。8. 根据权利要求2任一项所述的检测方法，其特征在于:所述的超高效液相色谱三重四 极杆串联质谱系统中色谱分离使用安捷伦SB C18色谱柱:2.1 mm X 50 mm，1.8 μπι，进样 体积为2 yL，柱温30 °C，米用梯度洗脱法。9. 根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于:所述的梯度洗脱法，流速为0.2 mL/ min，流动相A为5%乙腈水溶液含有0.1%甲酸，流动相B为乙腈含有0.1%甲酸;色谱分离梯度 条件为〇 min流动相组成为95%A+5%B，3 min时85%A+15%B，5 min时65%A+35%B，12 min时5%A +95%B，16 min时5%A+95%B或0 min流动相组成为95%A+5%B，2 min时88%A+12%B，6 min时60% A+40%B，10 min时5%A+95%B，12 min时5%A+95%B。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于:所述的超高效液相色谱三重四极杆 串联质谱系统进行检测时质谱的条件为:干燥气温度300 °C，流速10 L/min，喷雾器气压40 psi，鞘气温度280 °C，流速11 L/min，毛细管电压3.5 kV。
【文档编号】G01N30/06GK105866303SQ201610466429
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】赵先恩, 和永瑞, 魏娜, 王仁君, 颜平, 王玉花, 郑龙芳, 朱树芸, 尤进茂
【申请人】曲阜师范大学