专利名称：用于肿瘤磁共振成像的脂质体纳米颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及适用于制备造影剂的新型脂质体，所述造影剂用于增强磁共振成像(MRI)，特别是用于增强肿瘤的磁共振图像。
背景技术：
癌症成像是最重要的疾病领域之一，其中分子成像被设置为在癌症的检测和随后
的治疗中起重要作用。对于通过磁共振成像(MRI)的有效癌症成像，显然需要开发有效且生物相容性的分子成像探针U。在此领域中，纳米技术做出了巨大贡献，因为纳米药物被设置为在药物递送、疾病检测以及治疗的重要领域做出了重要贡献。纳米技术平台在癌症成像中的应用，已经开启了在癌症检测和治疗的研究中使用多功能的纳米颗粒系统(诸如脂质体)的机会。MRI是一种临床成像模式，其产生含有水的组织的三维不透明图像。当今世界上超过40%的临床成像需要注射某种形式的MRI造影剂。这是由于以下事实MRI存在固有的灵敏度缺乏，且经常为了正确地诊断病状，将顺磁性造影剂静脉内地注入患者，以进一步增强磁共振(MR)信号，并因此增强疾病的部位。这些试剂由掺入了顺磁性金属离子，最通常是钆或铁的分子组成。由于配位金属离子对周围大量水质子的纵向(T1)或横向(T2)弛豫时间的增强效应，而产生图像改善。掺入了钆的造影剂会增大1/1\和1/T2，但是通常被用于T1-加权成像中，其中它们在组织中的1/1\效应大于它们的1/T2增强3。另一方面，含有铁的试剂会导致1/T2的更大幅增加，并因此用T2-加权图像显影(可视化，visualise)。基于钆的MRI造影剂的使用产生正像增强(在图像上的亮信号)，而铁试剂的使用导致负像增强(图像的变暗)。Gd. DTPA [钆(I II)-二亚乙基三胺五乙酸盐复合物](图I)是自1988年中期以来被FDA(食品药品管理局)批准用于临床使用的第一种水溶性的、肾可排泄的造影剂，并且目前常规地以商业名称马根维显 (Magnevist )使用4。图I显示了在临床中最常用的造影剂的几个实例。这些化合物通常是惰性的稳定复合物，其中金属离子与聚(氨基羧化物)配体强烈螯合。这些类型的试剂是非特异性的，主要停留在血流内，且也在肾脏中积累(由于它们的肾小球过滤)，并通常不经代谢地排泄。尽管如此，它们在临床MR成像中的应用具有极大的价值，因为可以使解剖学的异常如神经胶质瘤和脑内的病变显影，而在正常生理条件下，这些试剂不会穿过完整的血脑屏障。也可以使肝脏和其它器官内的病状显影，因为这些造影剂会快速地积累在间质间隙中，并因此可以在这样的增加流体体积的区域中增大信噪比。然而，由于这些试剂是非特异性的，且在注射的几小时内被清除，所以它们在MR成像中的利用限于短成像时间窗，且主要限于血池的增强。最近，在分子成像领域内已经做出许多工作，以改善MRI造影剂的性质，这已经导致使用聚合物、树形化合物和各种纳米颗粒作为Gd载体。我们已经合成了我们自己的新型MRI活性脂质的库。这些脂质随后已经被用来配制用于肿瘤成像的脂质体。
脂质体由脂质成分组成，具有亲水头基和疏水尾基(图2)。当水合时，这些脂质聚集到一起而形成自装配的双层囊泡，所述囊泡包封一个水性隔室(aqueous compartment)。由于此水性腔，它们已经传统地被用作药物递送媒介物，其囊化水溶性药物以改善药物药代动力学。另外，还已经将核酸浓缩到脂质体制剂中，用于有效的转染和基因递送。尽管具有这些额外的功能，但脂质体最初作为生物膜的模型被研究，并且这是在实现它们的生物相容性中的一个关键构思。可以改变脂质体的多用途性质，以改变它们与各种分子或甚至更大的结构如细胞的相互作用。这可以如下实现通过将具有高度带电荷的极性头基的脂质掺入脂质体制剂中而改变脂质体表面的总电荷，例如，阳离子脂质向掺入所述制剂中会产生阳离子脂质体。阳离子脂质已经被用来配制用作体外和体内基因递送系统的脂质体/DNA复合物(脂复合物)。脂质体通常通过它们的尺寸、形状和层状性(Iamellarity)来表征。它们可以由单个双层(单层状)、几个双层(寡层状)或多个双层(多层状)组成。通过使用合适的脂 质，可以调节膜的刚度；并且通过使用具有高或低相变温度的磷脂，可以改变膜的流动性。一般而言，硬脂酸(完全饱和的C18脂链)的脂质衍生物会赋予膜刚度和不透性，而油酸(不饱和的C18脂链)的脂质衍生物导致产生更可透过的且更低稳定性的脂质双层。通过将钆脂质掺入脂质体的膜中，可以使它们成为MRI可见的，并可以获得具有更好的尺寸控制的系统5。脂质体非常适合作为钆进入细胞中的高有效负荷的载体。两性钆复合物掺入到脂质体膜中已经产生了顺磁性标记的脂质体，所述脂质体会显著地增强质子弛豫率。这些顺磁性脂质体已经用于许多研究中，包括细胞标记和跟踪的研究6。Kabalka等人在20年前证实了钆脂质掺入到脂质体制剂中，并且在他们的研究中使用的钆脂质Gd.DTPA.BSA[钆(III). 二亚乙基三氨基五乙酸-二(硬脂酰胺)]现在经常被用于制备顺磁性脂质体7。调节脂质体尺寸、表面电荷和特异性的能力允许有效的病理学成像，如体内实体瘤的成像。通过调节脂质体制剂的组成，使得脂质体的这种调节成为可能。趋于中性的表面电荷最适合体内目的以便减少通过血浆蛋白和网状内皮系统(RES)对脂质体颗粒的识别。这可以通过在脂质体制剂中包含电荷中性的脂质来实现。以前的工作已经证实，新型钆脂质Gd. DOTA. Chol (钆(III) 1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N'，N"，N"'-四乙酸根-胆固醇)(参见图3)是有效的MR信号增强剂，以及MAGfect ( 一种含有该钆脂质的脂质体制剂)是有效的细胞双重标记和转染媒介物6。尽管是相对有效的细胞标记脂质，但已经发现，使用该脂质的高脂质体浓度的制剂是有问题的，这可能是由于胆固醇尾部在高浓度的脂质体双层中的较差锚定。因此，由于此限制，需要提供更牢固的设计用于其中要更高脂质体浓度的体内应用的膜锚定，这导致替代性的饱和烷基链部分代替胆固醇锚定的研究。为此目的，使用溶液和固相化学的组合，合成了顺磁性脂质Gd. DOTA. DSA (2- {4，7- 二羧甲基-10-[ (N，N- 二硬脂酰氨基甲基-N' -酰氨基-甲基]-1，4，7，10_四氮杂环十二烷-I-基}_乙酸钆(III))(参见图4)。经由稳定的且可生物降解的酰胺官能团，DOTA螯合物结合至脂质。该钆脂质还被设计成具有在钆螯合剂和脂质烷基链部分之间的5原子间隔物。认为在头基和脂质烷基尾之间的这种间隔是最佳的，以便确保钆螯合物最大暴露于脂质体颗粒的亲水性表面上的水。此外，这种钆脂质还被设计成具有DOTA配体，而不是更常用的DTPA [ 二亚乙基三氨基五乙酸]，因为前一种大环配体被认为是更有效的钆的螯合剂，能够甚至在核内体的酸性环境中保留金属离子8。选择FDA批准的Gd. DOTA螯合物，因为由于它们更高的稳定性常数，所以已知的是，基于DOTA的结合物与DTPA配体相比在体内更稳定。MRI 效力为了确立Gd. DOTA. DSA的弛豫性质，进行了在水溶液中的脂质的MRI研究，以毫秒为单位产生T1值和弛豫率参数。将钆脂质Gd. DOTA. DSA的效力与临床造影剂马根维显 (Schering AG)和Gd. DTPA. BSA进行比较(参见表I)，且发现在临床相关剂量上相比是有 利地。这些数据也表明，Gd. DOTA. DSA具有与广泛使用的Gd. DTPA. BSA脂质相当的、甚至稍微更好的T1弛豫。使用标准的T1饱和恢复方法(自旋回波序列)来确定T1值(根据方程I)，其中X是TR(重复时间)，而Si是对于给定的TR的测量信号。Si = S0(l-e(-x/T1))方程式I :用于确定T1值的T1饱和恢复方程。表I显示了合成的Gd脂质以及有关的对照的T1弛豫值。
权利要求
1.一种脂质体，所述脂质体包含Gd. DOTA. DSA (2-{4，7-二羧甲基-10-[(N，N-二硬脂酰氨基甲基-N' -酰氨基-甲基]-I，4，7，10-四氮杂环十二烷-I-基}-乙酸钆(III))，其特征在于，所述脂质体还包含中性的完全饱和磷脂组分。
2.根据权利要求I所述的脂质体，其中所述完全饱和磷脂组分是1，2_二(C12-C2tl饱和脂质)-sn-甘油-3-磷酰胆碱，其中所述饱和脂质基团彼此能够相同或不同。
3.根据权利要求I所述的脂质体，其中所述完全饱和磷脂组分是DSPC(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体还包含胆固醇。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体还包含聚乙二醇-磷脂组分。
6.根据权利要求5所述的脂质体，其中所述聚乙二醇-磷脂是DSPE-PEG(2000)[二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)]。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的Gd.DOTA. DSA的量为总脂质体制剂的29-31mol%。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的Gd.DOTA. DSA的量为总脂质体制剂的30mol%。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的完全饱和磷脂组分的量为总脂质体制剂的32-34m0l%。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的完全饱和磷脂组分的量为总脂质体制剂的33mol%。
11.根据权利要求ι- ο中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的胆固醇的量为总脂质体制剂的29-3Imol%。
12.根据权利要求1-10中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的胆固醇的量为总脂质体制剂的30mol %。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的所述聚乙二醇-磷脂组分的量为总脂质体制剂的5-8mol %。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体中的所述聚乙二醇-磷脂组分的量为总脂质体制剂的7mol %。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体在磷酸盐缓冲溶液中稀释10倍时具有小于或等于IOOnm的平均粒度。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体在磷酸盐缓冲溶液中稀释10倍时具有小于或等于80nm的平均粒度。
17.根据权利要求I所述的脂质体,其中所述脂质体包含Gd.DOTA. DSA、胆固醇、DSPC和DSPE-PEG (2000)。
18.根据权利要求17所述的脂质体，其中Gd.DOTA. DSA、胆固醇、DSPC和DSPE-PEG(2000)分别以比例30 33 30 7mol%存在于所述脂质体制剂中。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的脂质体，其中所述脂质体还包含肿瘤靶向剂。
20.根据权利要求19所述的脂质体，其中所述肿瘤靶向剂包含受体的配体，相对于所述受体在哺乳动物的非肿瘤组织的细胞中的表达，所述受体在肿瘤细胞中过表达。
21.根据权利要求20所述的脂质体，其中所述肿瘤靶向剂包含叶酸部分。
22.根据权利要求20所述的脂质体，其中所述肿瘤靶向剂是磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物。
23.根据权利要求22所述的脂质体，其中所述磷脂-聚乙二醇-叶酸化合物是DSPE-PEG (2000)-叶酸[二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-叶酸]。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的脂质体，其中在所述脂质体中存在的所述叶酸部分的量为总脂质体制剂的l_2mol%。
25.根据权利要求19所述的脂质体，其中所述脂质体包含Gd.DOTA. DSA、胆固醇、DSPC、DSPE-PEG (2000)和 DSPE-PEG (2000)-叶酸。
26.根据权利要求25所述的脂质体，其中Gd.DOTA. DSA、胆固醇、DSPC、DSPE_PEG (2000)和DSPE-PEG (2000)-叶酸分别以比例30 33 30 5. 5 I. 5mol %存在于所述脂质体制剂中。
27.一种磁共振造影剂，所述磁共振造影剂包含权利要求1-26中任一项所述的脂质体以及药用载体。
28.根据权利要求27所述的磁共振造影剂，其中所述药用载体是水性载体。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的磁共振造影剂，用于医学、例如诊断中。
30.根据权利要求1-26中任一项所述的脂质体在制备磁共振造影剂中的应用，所述磁共振造影剂用于增强哺乳动物中的器官和器官结构的磁共振图像。
31.根据权利要求30所述的应用，用于制备增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像的磁共振造影剂。
32.根据权利要求30或31所述的应用，其中所述磁共振造影剂中的所述脂质体的浓度为 l-50mg/mL,优选 l_30mg/mL。
33.一种对哺乳动物中的器官或器官结构进行磁共振成像的方法，所述方法包括以下步骤 (a)将权利要求27或权利要求28所述的磁共振造影剂给予患者；和 (b)获取所述患者中的关注器官的图像。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述磁共振造影剂被用于增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述磁共振造影剂中的脂质体的浓度为 l-50mg/mL,优选 l_30mg/mL。
36.一种对哺乳动物中的器官或器官结构进行磁共振成像的方法，所述哺乳动物被预先 给予权利要求27或权利要求28所述的磁性造影剂，所述方法包括以下步骤 (i)获取所述患者中的关注器官的图像。
37.一种制备权利要求1-26所述的脂质体的方法，所述方法包括混合Gd. DOTA.DSA (2- {4，7- 二羧甲基-10- [ (N，N- 二硬脂酰氨基甲基-N' -酰氨基-甲基]-I，4，7，10-四氮杂环十二烷-I-基}_乙酸钆(III))的溶液和中性的完全饱和磷脂的溶液。
38.根据权利要求37所述的方法，所述方法还包括以下步骤干燥所述混合物(例如在真空下)，以及任选地再水合所得到的脂质体。
39.一种制备权利要求27或权利要求28所述的磁性造影剂的方法，所述方法包括混合权利要求1-26中任一项限定的脂质体和药用载体。·
全文摘要
本发明提供了包含Gd.DOTA.DSA(2-{4，7-二羧甲基-10-[(N，N-二硬脂酰氨基甲基-N`-酰氨基-甲基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-基}-乙酸钆(III))的新型脂质体，其特征在于，所述脂质体还包含中性的完全饱和磷脂组分(例如DSPC(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱])，其特别适用于制备用于增强哺乳动物中的肿瘤的磁共振图像的磁共振造影剂。
文档编号A61K49/18GK102711840SQ201080061977
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月19日 优先权日2009年11月20日
发明者加文·戴维·肯尼, 吉米·贝尔, 塔米·路易斯·卡尔贝, 安德鲁·戴维·米勒, 纳齐拉·卡马利, 马娅·萨努 申请人:医药研究委员会, 帝国创新有限公司