源自疟原虫属感染之网织红细胞的外来体，其获得方法及用途的制作方法

专利名称：源自疟原虫属感染之网织红细胞的外来体，其获得方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明所属领域为用于防止和预防疟疾的疫苗，更具体地，本发明涉及分离自疟原虫属(Plasmodium sp.)感染之网织红细胞的外来体、获得其的方法和所述外来体在防止和预防疟疾中的用途，以及其在发现和鉴定新的疟原虫抗原中的用途。本发明还涉及包含疟原虫属抗原的人工外来体。最后，本发明涉及借助用疟原虫属感染网织红细胞所获得的外来体发现的特异性抗原。
背景技术：
疟原虫属是引起疟疾(也被称为“瘴气(puladism) ”)的病原体。在疟原虫属中有不同的物种，其中一些是无害的。相反地，另ー些物种有高度感染性并且是引起全球大多数人类疟疾的原因。在后者中，最重要的物种是恶性疟原虫(P. falciparum)和间日疟原虫(P. vivaxノ。所有人类疟原虫物种(恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫(p.malariae)、卵形疟原虫(P. ovale)、诺氏疟原虫(P. knowlesi))均不同程度地感染红细胞和/或其前体网织 红细胞，网织红细胞需要成熟和分化过程以达到它们作为红细胞的最終功能状态。在不同的疟原虫物种当中，有些物种具有比其他物种更高的网织红细胞感染能力，例如主要感染该细胞类型的间日疟原虫。在网织红细胞成熟井分化成红细胞的过程中，红细胞中不必要的ー些蛋白质被隔绝在位于多囊体(multi-vesicular body,MVB)的内部囊泡中，随后作为小的纳米囊泡(被称为外来体)释放到细胞外基质中。最近，对其他细胞(如抗原呈递细胞)能够分泌这种纳米囊泡的发现激励了对外来体的研究，提出的作用不同于最初描述于网织红细胞成熟和分化中的作用。事实上，对不同类型细胞的几个研究已表明外来体因在免疫应答期间在细胞之间传递信息而在免疫系统调节中起作用，因此，它代表细胞间通信的新途径(I)。在这方面，已证实外来体在用兔弓形虫(Toxoplasmagondii)进行的实验性感染中的保护能力，兔弓形虫是顶复(Apicomplexa)门的成员，拒原虫也属于顶复门(2)。此外，描述了以使用外来体作为人类预防剂或免疫刺激剂为基础的几种策略(3)。W09705900等公开了得自抗原呈递细胞(如B细胞、巨噬细胞或树突细胞)的外来体。该文件所述外来体的特殊性在干，因为它们得自抗原呈递细胞，所以抗原存在于MHC-I和MHC-II环境中。文件EP1523990继而描述了得自癌细胞的外来体(鉴定为texosome)或得自载有或未载有抗原的树突细胞的外来体(该文件中将其称为dexosome)。W02004014954使用不同的策略以得到在其表面显示期望抗原的外来体，用基因组中包含期望抗原(muc-1)编码序列的重组病毒转染细胞系CT26(鼠结肠癌)和细胞系TA3HA (小鼠乳腺癌)的细胞，从而分离自该类细胞的外来体在表面上表达所述期望抗原。
W00028001描述了得自基本上缺乏内源性MHC分子的肥大细胞的外来体。但是，该文件中描述的外来体确实在其表面上表达重组MHC。最后，W02008092153描述了得自癌细胞的外来体，其缺乏通常存在于外来体中的ー种或更多种免疫抑制多肽。基于使用分离自疟原虫感染鼠模型或对象的网织红细胞的外来体，本发明人现已开发了防止和预防疟疾的新策略。这些外来体得自疟原虫属感染的外周血，或得自从所述外周血中预先得到的网织红细胞的体外培养物。
附图简述图I:描述了分离自小鼠血浆的外来体的特征。(A)通过动态光散射进行的大小分析。(B)用2%多聚甲醛固定后的负染色。比例尺代表lOOnm。·图2 : (A)分离自对照小鼠和约氏疟原虫(P. yoelii) 17X感染小鼠血液的网织红细胞的吉姆萨染色。(B)来自网织红细胞的外来体的负染色EM图像。比例尺代表200nm。图3 :描述了血液中的寄生虫(parasitemia)随时间的进展和用外来体免疫的小鼠的细胞向性(cell tropism)分析。由以下小鼠的平均值计算血液中的寄生虫曲线2只未免疫对照小鼠、2只用分离自正常动物血液的外来体免疫的对照小鼠、3只用约氏疟原虫非致死株感染的动物的外来体免疫的小鼠，和3只用约氏疟原虫致死株感染的动物的外来体免疫的小鼠。在处死前一天对每组的代表动物的外周血涂片进行吉姆萨染色。图4 :对用exC(n = 6)和exPyNL(n = 6)预先免疫的BALB/C小鼠组进行约氏疟原虫17XL感染的A)存活曲线和B)血液中的寄生虫的时程。未免疫小鼠(η = 5)未经处理。图5 :经外来体免疫的动物血清中抗约氏疟原虫的IgG抗体应答的Western印迹分析。在二次免疫后第20天通过上颌穿刺收集样品。每张图对应这些试验中使用的每组动物的血衆混合物。在Western印迹中，使用得自约氏痕原虫的非致死(AgNL)和致死(AgL)株的总抗原，通过使用与碱性磷酸酶缀合且针对小鼠IgG产生的山羊血清来检测IgG抗体应答。图6 :描述了来自用约氏疟原虫非致死株感染的小鼠血液的外来体免疫的动物中T、CD4+和CD8+细胞的细胞内染色分析。用5微克带有CpG-ODN的PyNL外来体免疫Balb/c小鼠。初次免疫之后两周，用5微克不带有CpG-ODN的外来体进行加强免疫。(A)体外再刺激、细胞内染色以及流式细胞术分析之后计算⑶8+IFN-Y +的百分数。⑶显示⑶4+IFN-Y +的CSFE1t5淋巴细胞的百分数，(C)显示⑶4+IFN-Y+IL-2+的百分数。数据对应于ー个实验，并且表示为3只未免疫小鼠和3只用非致死exPyNL株感染小鼠的外来体所免疫小鼠的平均值土标准误差。图7 :识别17XL-pRBC的免疫血清的明场和荧光图像。NI =未免疫小鼠的血清；exC=用来自未感染小鼠REX的外来体免疫的小鼠血清；exPy I =用来自约氏疟原虫NL感染动物的REX免疫的两只小鼠的血清。图8 (A)-(D)进行外来体中存在的抗原的蛋白质组学分析的MS/MS谱，所述外来体源自约氏疟原虫感染小鼠和间日疟原虫感染患者的外周血。谱的生物信息学分析确定所分析的外来体样品中约氏疟原虫和间日疟原虫两种抗原的存在。
图9 :A) Vir多基因家族保守基序的示意图。B) ViiJ太(Virpeptide)LPl (左)和ViiJ太LP2(右)的示意图。

图10 =Bioplex測定，表明来自巴西病区的ー些血清可以识别合成的长肽。图11 :免疫荧光測定，表明抗Lpl㈧和抗Lp2(B)可以鉴定间日疟原虫天然感染的Vir蛋白。图12 :包含Lpl和Lp2肽及其组合的免疫金标记人工外来体的图像。所述外来体包含摩尔比为79 20 I的1，2_ニ油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(D0PC)、胆固醇(CHOL) 和4-(对马来酰亚胺苯基)丁酰磷脂酰基乙醇胺(MBP-PE)。用抗LPl和LP2Vir肽的抗体进行免疫标记，然后用蛋白A-金孵育，比例尺代表200nm。
发明详述本发明的第一目的是分离自血浆/网织红细胞培养物的外来体，所述外来体在其内部或表面包含至少ー种疟原虫属抗原(下文称为本发明的外来体)。本发明的外来体已显示出抗疟疾的致免疫能力，因此它们在制备防止和预防该疾病的疫苗中有很高的潜在可用性。存在于本发明外来体中的抗原可以来自于任何疟原虫物种。在本发明的ー个具体实施方案中，存在于外来体中的ー种或更多种抗原来自于间日疟原虫(P. vivax)、恶性症原虫(P. falciparum)、三日症原虫(P. malariae)、卵形症原虫(P. ovale)、约氏症原虫(P. yoeliiノ 、 P. achiotense、 P. achromaticum、 P. aegyptensis、 P. aeuminatum、 P. agamae、P. anasum、P. atheruri、P. azurophilum、P. balli、竹鸡症原虫(P. bambusicolai)、P. basilisci、伯氏症原虫(P. berghei)、P. bigueti、巴西症原虫(P. brasolianum)、P. brygooi λ P. booliati、狷玲症原虫(P. bubal is)、P. bucki、猴症原虫(P. coatneyi)、卡氏症原虫(P. cathemerium)、P. cephalophi、夏氏)E原虫(P. chabaudi)、P. chiricahuae、P. circularis、P. cnemidophori、無原虫(P. coatneyi)、Ρ· coggesnalli、P. colombiense、P. corradettii、鹤鹁症原虫(P. coturnix)、P. coulangesi、杜鹽症原虫(P. cuculus)、P. popo、P. cyclopsi、食蟹猴症原虫(P. cynomolgi)、P. diminutivum、P. diploglossi、狄氏症原虫(P. dissanaikei)、P. dominicana、硬膜症原虫(P. durae)、P. egerniae、P. elongatum、艾氏症原虫(P. eylesi)、P. fabesia、P. fairchildi、P. fallax、P. fieldi、P. foleyi、P. forresteri、P. floridense、脆症原虫(P. fragile)、甘汉氏症原虫(P. garnhami)、鸡症原虫(P. gal Iinaceum)、P. giganteum、P. giovannolai、P. girardi、P. gonatodi、P. gonderi、P. georgesi、P. gracilis、格里菲斯症原虫(P. griff ithsi)、P. guanggong、丨メJ 德氏症原虫(P. gundersi)、P. guyannense、P. heischi、P. hegneri、P. hermani、P. heteronucleare、六子症原虫(P. hexamerium)、P. holaspi、P. huffi、长臂狠症原虫(P. hylobati)、Ρ· icipeensis、P. inopinatum、猪尾猴症原虫(P. inui)、Ρ· jefferi、P. josephinae、联核症原虫(P. juxtanucleare)、P. kempi、诺氏症原虫(P. knowlesi)、P. kentropyxiλ P. leanucteus、P. lemuris、P. IophuraeΛP.lepidoptiformis、P. lygosomae、P. mabuiae、P. mackerrasae、P. maculilabre、P. maior、P. marginatum、 晨症原虫(P. matutinum)、墨西哥症原虫(P. mexicanum)、P. minasense、P. morulum、嗜核症原虫(P. nucleophilium)、P. octamerium、P. odocoilei、P. papernai、P. paranucleophilum、P. parvulum、P. pedioecetii、P. pelazi、P. percygarnhami、P. petersi、P. pifanoi、P. pinotti、P. pinorrii、猿痕原虫(P. pitheci)、P. pitmani、极痕原虫(P. polare)、P. praecox、瑞氏痕原虫(P. reichenowi) > 残痕原虫(P. relictum) > P. rhadinurum、P. rhodaini、P. robinsoni、万氏痕原虫(P. rouxi)、P. sandoshami、P. sasai、P. schweitzi、P. silvaticum、吼猴痕原虫(P. simium)、半卵形痕原虫(P. semiovale)、P. shortii >P. smirnovi、小鸦痕原虫(P. subpraecox)、细薄痕原虫(P. tenue)、P. tejerai、锐齿蛇痕原虫(P. tomodoni)、Ρ· torrealbai>P. traguli>Ρ. tribolonoti、P. tropiduri、P. uilenbergi、P. watteni、文氏痕原虫(P. wenyoni)、Ρ· vacuolatum、P. vastator、P. vaughani、文可氏痕原虫(P. vinckei)、P. volans 或杨氏痕原虫(P. youngi)。在本发明的一个优选实施方案中，所述外来体包含来自感染人、猴和/或哨齿动物之疟原虫物种的抗原，即，在本发明的一个优选实施方案中，存在于外来体内部或表面的一种或更多种所述抗原属于间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫、巴西疟原虫、夏氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、脆疟原虫、诺氏疟原虫或瑞氏疟原虫。本发明的外来体可以从疟原虫属感染的任何哺乳动物的网织红细胞中分离，尽管优选从人、猴和/或小鼠的网织红细胞中分离它们。一个优选实施方案考虑了人网织红细 胞在施用给人类患者时，尽可能快速地阻止不期望反应的用途。本发明的另一目的是得到本发明的外来体的方法，其包括
a)获得疟原虫属感染的血液样品，
b)任选地，分离并且培养来自a)的血液样品中的网织红细胞，
c)通过将来自a)或b)的血液样品依次超速离心(sequentialultracentrifugation)获得源自网织红细胞的外来体级分。在ー个具体的实施方案中，所述血液样品可以是下述疟原虫感染的血液间日疟原虫、恶性痕原虫、三日痕原虫、卵形痕原虫、约氏痕原虫、P. achiotense、P. achromaticum、P. aegyptensis、P. aeuminatum、P. agamae、P. anasum、P. atheruri、P. azurophilum、P. balli、竹鸡症原虫、P. basilisci、伯氏症原虫、P. bigueti、巴西症原虫、P. brygooi、P. booliati、狷玲症原虫、P. bucki、猴症原虫、卡氏症原虫、P. cephalophi、夏氏症原虫、P. cniricahuae、P. circularis、P. cnemidopnori、猴疮原虫、P. coggeshalli、P. colombiense、P. corradettii、鹤鹁症原虫、P. coulangesi、杜鹽症原虫、P. popo、P. cyclopsi、食蟹猴症原虫、P. diminutivum、P. diploglossi、狄氏症原虫、P. domincana、硬膜症原虫、P. egerniae λ P. elongatum、艾氏症原虫、P. fabesia、P. fairchildi、P. fallax、P. fieldi、P. foleyi、P. forresteri、P. floridense、脆症原虫、甘汉氏症原虫、鸡症原虫、P. giganteum、P. giovannolai、P. girardi、P. gonatodi、P. gonderi、P. georgesi、P. gracilis、格里菲斯症原虫、P. guanggong、冈德氏症原虫、P. guyannense、P. heischi、P. hegneri λ P. hermani、P. heteronucleare、六子原虫、P. holaspi、P. huffi、长臂猿症原虫、P. icipeensis、P. inopinatum、猪尾猴症原虫、P. jefferi、P. josephinae、联核泊原虫、P. kempi、诺氏)E原虫、P. kentropyxi、P. leanucteus、P. lemuris、P. IophuraeΛP. lepiaoptiiormis、P. lygosomae、P.mabuiae、P.mackerrasae、P.maculilabre、P. maior λ P. marginatum、晨症原虫、墨西哥症原虫、P. minasense、P. morulum、嗜核症原虫、P. octamerium、P. odocoilei、P. papernai、P. paranucleophilum、P. parvulum、P. pedioecetii、P.pelaezi、P. percygarnhami> P.petersi、P.pifanoi> P.pinotti、P. pinorrii、猿痕原虫、P. pitmani、极痕原虫、P. praecox、瑞氏痕原虫、残痕原虫、P. rhadinurum、P. rhodaini、P. robinsoni、劳氏痕原虫、P. sandoshami、P. sasai、P. schweitzi、P. silvaticu m、吼猴痕原虫、半卵形痕原虫、P. shortii、P. smirnovi、小号鸟痕原虫、细薄痕原虫、P. tejerai、锐齿蛇痕原虫、P. torrealbai、P. traguli、P. tribolonoti、P. tropiduri、P. uilenbergi、P. watteni、又氏？E 原虫、P. vacuolatum、P. vastator、P. vaughani、文可氏痕原虫、P. volans或杨氏痕原虫。然而，在本发明的一个优选实施方案中，血液样品被下述痕原虫感染间日痕原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫、巴西疟原虫、夏氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、脆疟原虫、诺氏疟原虫或瑞氏疟原虫。尽管所述方法中的步骤b)是任选的，但它是实施本发明的优选选择。通过进行步骤b)，外来体级分比源自网织红细胞的外来体更纯。如果不进行步骤b)，外来体级分可含有不同于网织红细胞的其他细胞类型(如树突细胞)的少量外来体。可以通过下述过程从全血样品中分离网织红细胞
i)以700 IOOOXg离心15 25分钟，
ii)用Percoll梯度以200 300g离心25 35分钟。步骤b)中网织红细胞的分离还可以借助磁珠系统进行。例如，磁珠可以与抗⑶71的抗体缀合，因为⑶71是网织红细胞的主要表面标志物。在分离网织红细胞之后，将其在普通条件下体外培养。所述方法的步骤c)包括从步骤a)的血液样品或从步骤b)体外培养的网织红细胞中依次超速离心的步骤。在ー个具体的优选实施方案中，所述依次超速离心包括
i)以400 700Xg离心15 25分钟，
ii)以900 IOOOXg离心15 25分钟，
iii)以10，000 14，OOOXg 离心 20 40 分钟，
iv)以90，000 110，OOOXg离心I 3小时，任选地，在第一次依次超速离心之后，将所得沉淀悬浮于缓冲溶液(优选PBS)中，通过以粒径区分外来体级分的滤器过滤(所述滤器的孔径应为约0. 20 μ m)。该操作之后，优选以90000 IlOOOXg再离心I 3小时。所述依次离心优选地必须在O 7°C的低温下进行，以维持经纯化的外来体中蛋白质的完整性和蛋白质结构。如果外来体直接从全血中得到，即如果不进行所述方法的步骤b)，则通常得到主要由源自网织红细胞之外来体形成的外来体级分。然而，所述级分可包含极少部分的源自其他血液细胞类型的外来体。尽管所得级分中源自网织红细胞的外来体是足够富集的，任选地，如果期望更为富集的级分，可以对所得外来体级分进行利用免疫分离的纯化方法。免疫分离意指利用针对存在于外来体中的网织红细胞特异性分子的特异性抗体。在ー个具体的实施方案中，免疫分离可以通过使用针对转铁蛋白受体的特异性抗体进行。源自网织红细胞的外来体的免疫分离可以通过包被有抗转铁蛋白受体抗体的磁珠进行。源自网织红细胞的外来体通过抗转铁蛋白受体抗体贴附到磁珠后，可以借助酸处理从与上述抗体分尚。正如实施例中证实的，分析本发明的外来体允许发现和鉴定存在于其内部或表面的疟原虫属抗原。因此，分离自疟原虫属感染之网织红细胞的外来体在发现和鉴定疟原虫属抗原中的用途也是本发明的ー个目的。本发明中鉴定的抗原之ー是约氏疟原虫的蛋白Yir，其是间日疟原虫的蛋白Vir的直系同源物(ortologue)。本发明人从该蛋白质开发了两种Vir衍生肽，已证实其在免疫豚鼠后有抗原性，并且能够引起识别间日疟原虫感染患者的网织红细胞的特异性IgG免疫应答。因此，具有SEQ ID NO I或与SEQ ID NO I有至少85%同源性的Vir衍生肽以及具有SEQ ID NO I或与SEQ ID NO 2有至少85%同源性的Vir衍生肽也是本发明的ー个目·的。这些肽分别被称为Lpl和Lp2。本发明的另一方面是在其内部或表面包含至少ー种疟原虫属抗原的人工外来体。通过已知方法(de la Pefta等· 2009)开发了包含经鉴定的疟原虫抗原(即Lpl
和Lp2)的人工外来体，但是可将任何其他疟原虫抗原整合到人工外来体制剂中。使用人工外来体降低经免疫患者发生自身免疫应答的风险。在本发明的一个优选实施方案中，人工外来体主要与感染猴、小鼠或人的疟原虫物种抗原偶联，如间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫、巴西疟原虫、夏氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、脆疟原虫、诺氏疟原虫、瑞氏疟原虫。在ー个优选实施方案中，人工外来体包含间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫的抗原。本发明的ー个优选实施方案是包含疟原虫属抗原的人工外来体，所述疟原虫属抗原包含具有SEQ ID NO I或与SEQ ID NO I有至少85%同源性的Vir衍生肽和/或具有SEQ ID NO 2或与SEQ ID NO I有至少85%同源性的Vir衍生肽。 本发明的另一目的是药物组合物，其包含本发明的外来体或本发明的人工外来体和/或 SEQ ID NO I 和 /SEQ ID NO 2 的肽或与 SEQ ID NO I 或 SEQ ID NO 2 有至少 85%同源性的肽，以及至少ー种可药用赋形剂。所述赋形剂可选自载体、支持材料、润滑剂、填充剂、溶剂、稀释剂、着色剂、调味剂(如糖)、抗氧化剂和/或粘合剤。这些辅料和/或赋形剂及其必须使用的量的选择将取决于药物组合物的施用形式。本发明的药物组合物可适于通过ロ服途径或肠胃外途径(例如通过肺部途径、通过鼻途径、通过直肠途径和/或通过静脉内途径)的任何剂型。因此，本发明的制剂可适于局部或全身施用，特别适用于表皮、皮下、肌肉内、关节内、腹膜内、肺部、ロ含、舌下、鼻、经皮、阴道、ロ服或肠胃外施用。本发明的最后ー个目的是抗疟疾疫苗，其包含本发明的外来体或本发明的人工外来体和/或SEQ ID NO I和/SEQ ID NO 2的肽或与SEQ IDNO I或SEQ ID NO 2有至少85%同源性的肽。以下实施例用来阐明本发明但不旨在限制其范围。实施例
实施例I :外来体的纯化
I.I.从小鼠血液中直接纯化
从收集在EDTA中的小鼠血液中获得血浆并从中纯化外来体。使用血液中的寄生虫(parasitemia)为10-40%的约氏疟原虫17X和17XL株感染和未感染的Balb/c小鼠血浆。为了分离外来体，将血清在4°C下依次离心500Xg下30分钟，12000Xg下35分钟，100000X g下2小时。将最終的沉淀物重悬于PBS中(通常为5倍的血清初始体积)，通过
O.22 μ m的滤器过滤并在4°C下以IOOOOOXg离心2小时。将沉淀物重悬于I XPBS中并通过Bradford测定确定蛋白质的量。从I. 5mL血清中得到约5微克外来体。立即使用所得物质或借助快速冷却冷冻并在_80°C下储存。
·
借助动态光散射(DLS)和电子显微镜(EM)分析外来体以确定它们的纯度并观察它们的形态(图 I)。对于 DLS 测量，使用 Zetasizer Nano S (Malvern Instruments)在25°C下分析50μ1 O. I μ g/μ I的PBS悬液。用4°C下在2%多聚甲醛中固定过夜的新鲜外来体制备物来进行EM分析。将外来体置于formvar网格上I分钟，然后在蒸馏水中洗涤。用こ酸双氧铀的2%蒸馏水溶液对网格负染色I分钟。在完全干燥之后，在JEOL 1010透射电子显微镜下观察网格。两种技术均显示出纳米囊泡的均一群体，纳米囊泡的直径与先前描述的外来体尺寸相符。
I.2.从体外培养的小鼠网织红细胞中纯化
从网织红细胞培养物的上清液中纯化外来体。从收集在EDTA中的小鼠血液获得网织红细胞。使用血液中的寄生虫为20-40%的约氏疟原虫17X株感染和未感染的Balb/c小鼠的血液。为了分离网织红细胞，在700-1000Xg下离心血液20分钟。在磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤两次后，通过将它们置于Percoll/NaCl密度梯度层上来纯化血液中的网织红细胞。为此，将5毫升Percoll溶液(密度，I. 096g/mL)置于15mL的管中。将2毫升Percoll (密度，I. 058g/mL)层叠其上。将稀释在PBS中至最终血细胞比容为50%的2毫升血液层叠在每支管上方。在4°C下将管以250Xg离心30分钟。从两个Percoll层的分界面处收集网织红细胞并用PBS洗涤两次。在37°C下以1-5X IO7个细胞/mL的密度将纯化的网织红细胞(图2A)在补充有5mM谷氨酰胺、3%小牛血清、50U/mL青霉素和50 μ g/mL链霉素的DMEM中培养24小时。为了避免培养基中外源性外来体的任何可能污染，将胎牛血清预离心(IOOOOOXg过夜)。在4°C下通过以下离心从上清液中分离外来体500Xg下20分钟，900-1000Xg下20分钟，12000Xg下30分钟以及IOOOOOXg下2小时。将最终沉淀重悬于大体积的PBS中(通常为5倍的初始体积)，通过O. 22 μ m的滤器过滤并在4°C下以IOOOOOXg离心2小吋。将沉淀物重悬于PBS中，通过Bradford测定确定所回收蛋白质的量。通过电子显微镜(EM)分析外来体以确定它们的纯度并观察它们的形态(图2B)。EM分析用4°C下在2% PFA中固定过夜的新鲜外来体进行。然后将外来体置于formvar网格上20分钟，然后在PBS中洗涤。然后用I %的戊ニ醛固定网格5分钟，在蒸馏水中洗涤并用草酸双氧铀溶液(pH = 7)负染5分钟，用こ酸双氧铀(4% )-甲基纤维素(2% )在4°C下负染10分钟。在彻底干燥之后，用JEOL 1010透射电子显微镜观察网格。该技术显示出样品中囊泡的均一群体，载剂直径与先前报道的外来体尺寸相符。1.3.从体外培养的人网织红细胞中纯化外来体从巴塞罗那血液和组织库(www.bancsang.net)的未经处理的血袋中得到人外周血网织红细胞。为了得到样品，按照实施例I. 2中已经描述的方法用Percoll密度梯度进行离心。样品预先用Plasmodipur滤器(Eurodiagnostica)除去白血球。与该方法并行的,还使用纯化系统Midi-MACS(Miltenyi Biotec)并按照制造商说明书通过缀合有抗⑶71 (网织红细胞的主要表面标志物)的磁珠浓缩人网织红细胞。将通 过两种方法浓缩的人网织红细胞在不同的培养基(DMEM，RPMI)中培养24小吋，按照实施例
I.2中描述的方法通过超速离心从上清液中浓缩人网织红细胞来源的外来体(hREX)。
1.4.从间日疟原虫感染的人网织红细胞中纯化按照Ribaut等描述的方法(4)使用磁柱系统Midi-MACS (Miltenyi Biotec)收集成熟形式的间日疟原虫感染的网织红细胞。在不完全培养基中洗涤感染的网织红细胞并在不同的培养基(DMEM，RPMI)中培养24小时。
按照实施例I. 3中描述的方法通过超速离心从上清液中浓缩间日疟原虫感染的人网织红细胞来源的外来体(hiREX)。
实施例2 :外来体的致免疫特性
2.I.从小鼠血·液中直接纯化得到的外来体的致免疫特性用外来体免疫Balb/c小鼠，所述外来体源自未感染小鼠(exC)以及如实施例I. I中得到的用非致死(exPyNL)和致死(exPyL)株外来体所感染的小鼠。为了免疫，在通过腹膜内注射开他敏(100mg/mL)和咪达唑仑(5mg/Kg)联合麻醉小鼠之后，静脉内(i. V.)注射给予100 μ I PBS中的5 μ g外来体。外来体的两个实验用两种剂量的外来体以20天为间隔免疫Q. V.)的4-6只Balb/c小鼠(周龄为9_11周)的组来进行。未免疫(NI)小鼠未经处理。二次免疫后第20天，用5 X IO5-IO6只致死株(约氏疟原虫17XL)寄生虫感染所有小鼠，并且每天控制血液中的寄生虫。显著地，用每种株的外来体免疫的小鼠有一半表现出血液中寄生虫曲线的变化，其相比于NI和exC小鼠有更长的存活时间(图3)。此外，用经感染动物的外来体免疫的小鼠不仅表现出血液中的网织红细胞(reticulocytemia)的增加，而且表现出致死株的正常红细胞的细胞趋向为网织红细胞的变化(表I)。
朱免疫动翁死亡后感染的Sfeit细龜
雨存it天数_鑛紅細胞％血液浓度
NI0.65 ± O J20.6 + 0.85
exC0.5 ± 0.333.08 ±1.723.02 ±1.48
exPyL 2.5 ±1.37 49.15 + 21.46 30.98 ±16.11 exPyNL_f 3.5 士 1.29_[35.57 ± 18.66 23.68 ± 12.83
表 I :用未感染动物(exC，n = 4)以及用 Pyl7XL (exPyL, η = 4)和 Pyl7XNL (exPyNL, η=6)感染的小鼠血液中的外来体免疫的Balb/c小鼠组。未免疫(NI)小鼠未经处理。感染的网织红细胞的百分数和网织红细胞血液浓度在死亡前一天測量。不同组的结果表示为平均值土标准误差。
2.2.通过纯化体外培养的网织红细胞得到的外来体的致免疫特件用外来体免疫Balb/c小鼠，所述外来体获得自未感染的(exC)网织红细胞培养物，以及如实施例I. 2中得到的用非致死约氏疟原虫17X株(exPyNL)感染的网织红细胞培养物。为了免疫，对小鼠皮下注射(s.c.) IOyg外来体和IOygCpG ODN-1826。20天后，用
5μ g外来体免疫小鼠。二次免疫后第20天，用5X IO5约氏疟原虫17XL感染所有小鼠并且每天跟踪血液中的寄生虫。两个实验用6只经免疫的雌BALC/c小鼠(周龄为9-11周)进行。未免疫小鼠(NI)未经处理。显著地，相比于致死寄生虫约氏疟原虫17XL感染，用约氏疟原虫17X感染之网织红细胞中的外来体免疫的小鼠存活5/6 (图4)。
实施例3 :体液和细胞应答
3.I-用从小鼠血·液直接纯化的外来体引发的体液IrG免疫应答和细胞免疫应答在证实了实施例I. I中纯化的外来体的致免疫能力后，开始实验以评估保护性应 答是否与体液和/或细胞免疫应答有夫。为了研究特异性抗体的产生，在先于二次免疫前20天时收集血清并在_20°C下储存。使用NI、exC、exPyNL和exPyL组动物的血清混合物来分析由外来体免疫诱导循环抗约氏疟原虫的抗体。使用总的约氏疟原虫抗原裂解物进行Western印迹，该裂解物这样获得用1.5M NH4CL、0. IM KHCO3和O. OlM EDTA裂解经感染的红细胞，然后进行几次冻融循环。用来自于非致死感染的外来体免疫的小鼠产生针对两种株的约氏疟原虫抗原的特异性IgG抗体(图5)。正如预期的，在未免疫动物的血清中没有检测到针对约氏疟原虫的抗体。借助胞内染色进行单个细胞的细胞因子产生分析以评估细胞免疫应答。二次免疫后第20天，将经免疫动物的脾脏细胞(脾细胞)一式三份接种到96孔板上(5 X IO5细胞/孔)。所述脾细胞在存在或不存在10 μ g/ml约氏疟原虫抗原或5 μ g的冷冻外来体制备物的情况下，培养在补加了通过温度失活的10%胎牛血清(FCS)、HEPES (IOmM)，L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(ImM)、2 β -巯基こ醇(50 μ Μ)和青霉素-链霉素(O. ImM)的DMEM培养基中。为了分析增埴，在培养前用vybrant CFDASE cell tracer试剂盒(Invitrogen)用5-6-羧基荧光素ニこ酸琥珀酰亚胺酷(CFSE)将细胞染色。在37°C下孵育板72小时并在最后的4小时加入豆蘧酰佛波醇こ酯(50ng/ml)、离子霉素(500ng/ml)和布雷菲德菌素A(10yg/ml)孵育。收集细胞、洗涤并染色20分钟以使用与不同荧光团缀合的抗体检测不同的表面标志物。用PBS/BSA洗漆两次后，在室温下用cytofix/cytoperm(BDBiosciences)中固定细胞20分钟,然后洗漆并重悬浮于透化(perm)/清洗溶液中使其透化。透化之后，用不同细胞因子的特异性缀合抗体染色细胞30分钟。在FACS Calibur中分析样品。培养72小时后孔中细胞颜色和数量的视觉检查表明，仅在存在外来体和约氏疟原虫抗原的exPyNL脾细胞中有较高的増殖性应答。产生IFN- Y的CD8+T脾细胞数量在exPyNL免疫动物中在用外来体和总约氏疟原虫抗原再刺激之后增加(图6A)。产生IFN- Y的CD4+增殖T淋巴细胞(CSFE低)(单独的或与IL-2组合)在总约氏疟原虫和外来体再刺激之后的相同动物组中检测出较高的数量(图6B、6C)。
3.2.用从体外培养网织红细胞中纯化的外来体引发的体液IgG免疫应答本实施例表明实施例I. 2中纯化的外来体能够引起寄生虫特异性体液IgG免疫应答，其识别成熟期的约氏疟原虫感染的红细胞(PRBC)。使用免疫后20天收集的经免疫小鼠的血清通过免疫荧光研究外来体引发的体液IgG免疫应答，并且测试寄生虫识别。免疫荧光測定在17XL感染的血液涂片上进行，所述血液涂片用冷的甲醇固定并在室温下用5% BSA/PBS封闭30分钟之后风干。载玻片在4°C下用在O. 5% BSA/PBS中1/10稀释的小鼠血清孵育过夜并在室温下孵育I小时。室温下使用1/200稀释的与Alexa Fluor 488 (Invitrogen)缀合的抗小鼠IgG抗体对反应IgG进行I小时的检测。洗漆之后，在室温下将核用DAPI (Invitrogen, 5mg/mL)染色7分钟。使用装配有63X倒置油物镜的Leica TCS-SL显微镜在明场和绿色荧光下对识别pRBC的血清成像。使用未免疫小鼠和用未感染动物的外来体免疫的小鼠的血清作为阴性对照。如图7所示,用exPy免疫引发能够识别被感染红细胞的IgG抗体。
实施例4 :抗原的蛋白质组学分析除使用Balb/c-约氏疟原虫鼠模型在疟疾实验性感染中产生外来体致免疫性的数据之外，还产生了证实得自约氏疟原虫感染小鼠的外来体或得自间日疟原虫感染患者的外来体中包含寄生虫抗原的数据。为此目的，通过质谱分析未感染小鼠、约氏疟原虫致死和非致死株感染的小鼠、健康人类志愿者以及间日疟原 虫疟疾患者的经纯化外来体的5微克等分试样。
4.I.通过质谱偶联液相色谱分析将外来体制备物重悬于在8M尿素中的O. 4M NH4HCO3中。将样品在50°C下用5mMDTT还原15分钟，在室温下用IOmM碘こ酰胺进行烷基化30分钟并用HPLC级的水稀释直至得到IM的尿素浓度。在用1/50(酶/蛋白质比)具有测序纯度的胰蛋白酶消化16小时后，加入1%甲酸(FA)终止反应(5)。用POROS R2ziptips使样品脱盐(6)并在真空泵中干燥。随后将样品重悬于O. I % FA中(固定在2D LC-MS系统中(LC-Eksigent lD-plus，MS_带有ETD 的 Thermo Fisher LTQ XL, ESI 源-Triversa, Adivion)。将样品分别置于强阳离子交换(SCX)柱中(5 μ L, Optimized Technologies),通过注入浓度增加的 NaCl (0-500mM NaCl在5%こ腈/0. 5% FA中)自动洗脱。将洗脱的肽置于自制C18柱(lcm, 75 μ m, PhenomenexLuna C18, 5 μ m)中并洗漆。借助 C18 毛细管柱(20cm, 75 μ m, Phenomenex Luna C18, 5 μ m)在具有0.1%FA的ACN线性梯度中实现分离。在依赖数据的采集模式中采集谱图(图8)。
4.2.生物信息学分析将MS/MS谱图(图5)转换为DTA格式并发送到Sequest中进行数据库检索(可在Bioworks 3. 3. I, Thermo Fisher Scientific获得)。对间日痕原虫和约氏痕原虫使用的数据库是PLasmoDB(http://plasmodb. org)中最新发布的那些，并且污染序列(contaminating sequence)(如人角蛋白、猪胰蛋白酶、培养基蛋白质)的数据库在(http://www. ebi. ac. uk/IPI/IPIhelp.html 或 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/sites/entrez db = Protein&itool = toolbar)中检索。将所有的序列连接到反向版本以计算假阳性(7)。筛选所得数据得到大约1-2%的假阳性误差水平。显著地，得自感染小鼠或间日疟原虫感染患者的外来体表明疟原虫蛋白质的存在(表II)。各谱图的数据100%确认了这些肽对应于疟原虫蛋白质。所有的这些结果明确地证实所述外来体包含引起疟疾(包括由间日疟原虫引起的人疟疾)的寄生虫的蛋白质，以及它们在鼠模型中能够呈递抗原、产生免疫和保护性应答。
权利要求
1.分离自网织红細胞的外来体，其在内部或表面包含至少ー种疟原虫属(Plasmodiumsp.)抗原。
2.根据权利要求I所述的外来体，其中存在于所述外来体中的ー种或更多种所述抗原属于间日症原虫(Plasmodium vivax)、恶性症原虫(Plasmodium falciparum)、三日症原虫(Plasmodium malariae)、卵形症原虫(Plasmodium ovale)、约氏症原虫(Plasmodiumyoelli)、P. achioitense、P. achromaticum、P. aegyptensis、P. aeuminatum、P. agamae、P. anasum、P. atheruri、P. azurophilum、P. balli、竹鸡症原虫(P. bambusicolai)、P. basilisci、伯氏症原虫(P. berghei)、P. bigueti、巴西症原虫(P. bras i Iianum)、P. brygooi、P. booliati、狷玲症原虫(P. bubal is)、P. bucki、猴症原虫(P. coatneyi)、卡氏症原虫(P. cathemerium)、P. cephalophi、夏氏)E原虫(P. chabaudi)、P. chiricahuae、P. circularis、P. cnemidophori、無原虫(P. coatneyi)、Ρ· coggesnalli、P. colombiense、P. corradettii、鹤鹁症原虫(P. coturnix)、P. coulangesi、杜鹽症原虫(P. cuculus)、P. popo、P. cyclopsi、食蟹猴症原虫(P. cynomolgi)、P. diminutivum、P. diploglossi、狄氏症原虫(P. dissanaikei)、P. dominicana、硬膜症原虫(P. durae)、P. egerniae、P. elongatum、艾氏症原虫(P. eylesi)、P. fabesia、p. fairchildi、P. fallax、P. fieldi、P. foleyi、P. forresteri、P. floridense、脆症原虫(P. fragile)、甘汉氏症原虫(P. garnhami)、鸡症原虫(P. gal Iinaceum)、P. giganteum、P. giovannolai、P. girardi、P. gonatodi、P. gonderi、P. georgesi、P. gracilis、格里菲斯症原虫(P. griff ithsi)、P. guanggong、丨メJ 德氏症原虫(P. gundersi)、P. guyannense、P. heischi、P. hegneri、P. hermani、P. heteronuc_Leare、7Kf(P. hexamerium)、P. holaspi、P. huffi、~bc胃症原虫(P. hylobati)、Ρ· icipeensis、P. inopinatum、猪尾猴症原虫(P. inui)、Ρ· jefferi、P. josephinae、联核症原虫(P. juxtanucleare)、P. kempi、诺氏症原虫(P. knowlesi)、P. kentropyxi、P. leanucteus、P. lemuris、P. IophuraeΛP.lepidoptiformis、P. IygosomaeΛP. mabuiae、P. mackerrasae、P. maculilabre、P. maior、P. marginatum、 晨症原虫(P. matutinum)、墨西哥症原虫(P. mexicanumO、P. minasense、P. morulum、嗜核症原虫(P. nucleophilium)、P. octamerium、P. odocoilei、P. papernai、P. paranucleophilum、P. parvulum、P. pedioecetii、P. pelaezi、P. percygarnhami、P. petersi、P. pifanoi、P. pinotti、P. pinorrii、猿症原虫(P. pitheci)、P. pitmani、极症原虫(P. polare)、P. praecox、瑞氏症原虫(P. reichenowi)、残症原虫(P. relictum)、P. rhadinurum、P. rhodaini、P. rooinsoni、万氏拒原虫(P. rouxiノ、P. sandosnami、P. sasai、P. scnweitzi、P. silvaticum、吼猴症原虫(P. simium)、半卵形症原虫(P. semiovale)、P. shortii、P. smirnovi、小号鸟症原虫(P. subpraecox)、细薄症原虫(P. tenue)、P. tejerai、锐齿蛇症原虫(P. tomodoni)、P. torrealbai、P. traguli、P. tribolonoti、P. tropiduri、P. uilenbergi、P. watteni、文氏症原虫(P. wenyoni)、Ρ· vacuolatum、P. vastator、P. vaughani、文可氏症原虫(P. vinckei)、P. volans、杨氏症原虫(P. youngi)。
3.根据权利要求2所述的外来体，其中存在于所述外来体中的一种或更多种所述抗原属于间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫、巴西疟原虫、夏氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、脆疟原虫、诺氏疟原虫、瑞氏疟原虫。
4.根据前述权利要求中任一项所述的外来体，其中所述外来体分离自猴、小鼠和/或人的网织红細胞。
5.根据前述权利要求中任一项所述的外来体，其用于防止和预防疟疾。
6.用于获得根据权利要求I所述的外来体的方法，其包括 a)获得疟原虫属感染的血液样品， b)任选地，分离并且培养来自a)的所述血液样品中的网织红細胞， c)通过将来自a)或b)的所述血液样品依次超速离心来获得源自网织红細胞的外来体级分。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述血液样品可被以下感染间日疟原虫、恶性症原虫、三日症原虫、卵形症原虫、约氏症原虫、P. ach iotense、P. achromaticum、P. aegyptensis、P. aeuminatum、P. agamae、P. anasum、P. atheruri、P. azurophilum、P. balli、竹鸡症原虫、P. basilisci、伯氏症原虫、P. bigueti、巴西症原虫、P. brygooi、P. booliati、狷玲症原虫、P. bucki、猴症原虫、卡氏症原虫、P. cephalophi、夏氏症原虫、P. cniricahuae、P. circularis、p. cnemidopnori、猴疮原虫、p. coggeshalli、P. colombiense、P. corradettii、鹤鹁症原虫、P. coulangesi、杜鹽症原虫、P. popo、p. cyclopsi、食蟹猴症原虫、P. diminutivum、P. diploglossi、狄氏症原虫、P. dominicana、硬膜症原虫、P. egerniae、P. elongatum、艾氏症原虫、P. fabesia、P. fairchildi、p. fallax、P. fieldi、P. foleyi、P. forresteri、P. floridense、脆症原虫、甘汉氏症原虫、鸡症原虫、P. giganteum、P. giovannolai、P. girardi、P. gonatodi、p. gonderi、P. georgesi、P. gracilis、格里菲斯症原虫、p. guanggong、冈德氏症原虫、P. guyannense、P. heischi、P. hegneri λ P. hermani、P. heteronucleare、六子原虫、P. ho Iasp i、P. huffi、长臂猿症原虫、P. icipeensis、P. inopinatum、猪尾猴症原虫、P. jefferi、P. josepinae、联核 原虫、P. kempi、诺氏)E 原虫、P. kentropyxi、P. leanucteus、P. lemuris、P. Iophurae ΛP. lepidoptiiormis、P. lygosomae、P.mabuiae、P.mackerrasae、P.maculilabre、P. maior λ P. marginatum、晨症原虫、墨西哥症原虫、P. minasense、P. morulum、嗜核症原虫、P. octamerium、P. odocoilei、P. papernai、P. paranucleophilum、P. parvulum、P. pedioecetii、P. pelaezi、p. percygarnhami、P. petersi、P. pifanoi、P. pinotti、P. pinorrii、猿症原虫、P. pitmani、极症原虫、P. praecox、瑞氏症原虫、残症原虫、P. rhadinurum、P. rhodaini、P. robinsoni、^■氏症原虫、P. sandoshami、P. sasai、P. schweitzi、P. silvaticum、吼猴症原虫、半卵形症原虫、P. shortii、P. smirnovi、小号鸟症原虫、细薄症原虫、P. tejerai、锐齿蛇症原虫、P. torrealbai、P. traguli、P. tribolonoti、P. tropiduri、P. uilenbergi、P. watteni、又氏泊原虫、P. vacuolatum、P. vastator、p. vaughani、文可氏症原虫、P. volans、杨氏症原虫。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述血液样品可被以下感染间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫、巴西疟原虫、夏氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、脆疟原虫、诺氏疟原虫、瑞氏疟原虫。
9.根据权利要求6所述的方法，其中步骤b)中网织红細胞的任选分离通过以下离心进行 i)在700 IOOOXg下15 25分钟， ii)用Percoll梯度以200 300g离心25 35分钟。
10.根据权利要求6所述的方法，其中步骤b)中网织红细胞的任选分离通过磁珠系统来进行。
11.根据权利要求9所述的方法，其中步骤C)的所述依次超速离心包括 i)以400 700Xg离心15 25分钟， ii)以900 IOOOXg离心15 25分钟， iii)以10，000 14，OOOXg 离心 20 40 分钟， iv)以90，000 110，OOOXg离心I 3小时。
12.根据权利要求I至5所述的外来体在发现和鉴定疟原虫属抗原中的用途。
13.Vir衍生肽，其具有SEQ ID NO I或与SEQ ID NO I有至少85%的同源性。
14.Vir衍生肽，其具有SEQ ID NO 2或与SEQ ID NO I有至少85%的同源性。
15.人工外来体,其在内部或表面包含至少一种痕原虫属抗原。
16.根据权利要求15所述的人工外来体，其中所述疟原虫属抗原包括具有SEQID NOI或与SEQ ID NO I有至少85%同源性的Vir衍生肽和/或具有SEQ ID NO 2或与SEQ IDNO I有至少85%同源性的Vir衍生肽。
17.药物组合物，其包含权利要求I至5和/或15至16中任一项所述的外来体和/或权利要求13或14中任一项所述的肽，以及至少ー种可药用赋形剂。
18.抗疟疾疫苗，其包含权利要求I至5和/或15至16中任一项所述的外来体和/或权利要求13或14中任一项所述的肽。
全文摘要
本发明所属领域为用于防止和预防疟疾的疫苗，更具体地，本发明涉及分离自疟原虫属(Plasmodium sp.)感染之网织红细胞的外来体、获得所述外来体的方法和所述外来体在防止和预防疟疾中的用途，以及其在发现和鉴定新的疟原虫抗原中的用途。本发明还涉及包含疟原虫属抗原的人工外来体。最后，本发明涉及借助用疟原虫属感染网织红细胞所获得的外来体发现的特异性抗原。
文档编号A61K47/48GK102844046SQ201080064841
公开日2012年12月26日 申请日期2010年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者埃尔南多·安东尼奥·德尔波蒂略奥万多, 洛雷娜·马丁豪拉尔, 玛利亚·卡门·费尔南德斯贝塞拉 申请人:巴塞罗那国际健康研究中心, 加泰罗尼亚高等研究院, 塞莱克斯基金会, 巴塞罗那省立医院诊所