专利名称：选择性诱导晶状体上皮细胞脱落和/或死亡以阻止后囊膜混浊的处理溶液和方法
技术领域：
本发明涉及新的处理溶液和方法，所述处理溶液和方法包括单独应用或与其它药物合并应用离子转运机制干扰剂，通过选择性诱导晶状体上皮细胞脱落和/或细胞死亡以阻止后囊膜混浊，而对其它眼部细胞和组织无损害，且无需冗长的术前处理。
背景技术：
人眼晶状体的主要作用是将透过角膜和房水的光线聚集到视网膜上。晶状体的结构和代谢直接有助于保持其完整性和透明度。晶状体在不同的成熟阶段，完全由上皮细胞组成，且独特之处在于，组织在成熟过程中从来没有被抛弃过。当新的晶状体细胞形成后， 老的细胞便被迁移至晶状体内部。不久，晶状体就隔离于直接的血液供应，并依靠房水和玻璃体液以获取营养或做为消除通路。晶状体的光学特征很大程度上依赖于可以保持恒定细胞容积的晶状体细胞和可以降低胞内空间的纤维的密集填塞。因而，保持晶状体的精细结构成为晶状体的一种必要特征。晶状体已经进化了其独特能力，可以通过调整其离子、糖、 氨基酸和水平衡来保持其恒定容积。人眼白内障是由于晶状体丧失透明度而引起的光线传播的中断。白内障可引起视觉模糊和混浊，是至今为止视力精确度降低的最常见的原因。混浊的晶状体可以通过手术操作去除，如白内障囊外摘除术(ECCE)，ECCE包括通过手动或自动真空技术摘除包含皮质的临床核，而后囊和赤道囊完整保留，做为包膜或者口袋，在其中可植入后房型人工晶状体 (intraocular lens)。如果后囊和晶体韧带完整，植入的晶状体通常会保留在该适当位置， 终其一生，而无任何并发症。手术中，小心打开晶状体前囊，摘除白内障，将人工晶状体植入到其余的后囊部。但这同样会引起正常晶状体调节功能的部分丧失。标准的白内障手术包括称为晶状体乳化这一操作。该操作搅动晶状体内容物，引起晶状体内物质的解体，然后通过晶状体乳化探头同时注入和吸出洗涤液将其冲洗出晶状体囊。脱落的死的和活的晶状体上皮细胞都会被该处理的冲洗操作洗涤出囊。在发展新的白内障治疗方法方面，已经取得了进步，包括保留晶状体前囊和用可注射材料替代晶状体内容物方面。手术后，视力得到恢复，但主流白内障手术最常见的并发症是术后晶状体上皮细胞(LECs)的增殖。后囊膜浑浊(PCO)也称为继发性白内障，是白内障囊外摘除术的常见并发症，病人的发病率为20% 40%。在过去十年中，多项试验和临床研究结果使我们更好的理解了 PCO的发病机理。PCO主要是剩余LECs增殖并迁移至晶状体后囊所致。尽管手术中须小心去除大部分残余的晶状体上皮细胞，但它们很难去除。所以，手术操作结束时很多LECs滞留在晶状体囊袋中。LECs的增殖引起人工晶状体所植入的膜或袋随时间推移变得浑浊。LECs的增殖在白内障新的治疗方法应用中也是一个重要问题，如可注射晶状体。形成的浑浊膜被称为“后发性白内障”或PCO。PCO的症状与白内障相同，如不治疗可引起视力逐渐丧失，最后导致失明。人们做出各种努力阻止或减少PCO的形成。这些努力可分为三个领域手术方式的改进，晶状体设计方面的改良和化学手段阻止。已经发展了多种手术策略以阻止PC0，其中包括使用各种手术器具和利用激光、超声和冷冻技术。一旦PCO发生，YAG激光囊切开术可利用激光束在浑浊囊中心形成一个开口，是一种简单，快速的操作。但YAG激光囊切开术有严重风险，主要包括视网膜脱离、青光眼和黄斑囊样水肿的发生。多数研究的兴趣点主要集中在制作人工晶状体的材料类型和人工晶状体边缘的形状设计上，据报道，双凸形和平凸形(planer convex)聚丙烯酸甲酯，还有硅凝胶襻板式人工晶状体和具有锐视觉边缘(sharp optic edges)的晶状体对阻止PCO具有有益效果。 尤其是，Alcon' s Acrysof晶状体在该领域做出了重大进步。但这些晶状体相对昂贵，并带来了它们自己的并发症或限制。还有其它利用化学药物破坏或者阻止LECs增殖的尝试。在2001年9月21日递交的英国专利申请0122807. 1中，提出的假说为经醛糖还原酶抑制剂，通过调节山梨醇通路降低LECs细胞内山梨醇浓度，因渗透冲击(osmotic shock)诱导LECs死亡而阻止PC0。 但为调节山梨醇通路提议的治疗方案包括手术前预处理晶状体囊袋48h，所以要整合入现在的白内障手术并非易事。其它的化学治疗也曾被尝试过，如，应用免疫毒素偶联的LECs特异性抗体可以降低，但不能完全阻断 PCO 发生，见 Clark et al, J. Cataract Refract. Surg. 1998 Dec ； 24(12) :1614-20 禾口 Meacock et al, J. Cataract Refract. Surg. 2000May ；26 (5) :716_21。 利用乙二胺四乙酸、胰蛋白酶和DISPASE (中性蛋白酶)分离LECs，但破坏了韧带和周围组织，见Nishi，J. Cataract Refract. Surg. 1999 Jan ；25(1) : 106-17和Nishi et al, Opthalmic Surg. 1991 Aug ；22 (8) :444-50 其它药物包括RGD肽，也被测试能否阻止PC0， 抑制晶状体细胞晶状体上皮细胞的迁移和增殖；还有抗有丝分裂药物，如丝裂霉素C和 5-氟尿嘧啶。见 Chung HS, Lim SJ, Kim HB. J Cataract Refract Surg. 20000ct ；26 (10) 1537-42 ；Shin DH, Kim Y. Y.，Ren J. et al.Ophthalmology. 1998 ；105 1222-1226。遗憾的是，如果在有效剂量应用上述化学药物，其中大多数对眼组织周围包括眼部细胞，如角膜内皮细胞(CEDCs)和视网膜色素上皮细胞(RPECs)，都表现出不能接受的毒性水平。发明概述根据本发明，已克服上述讨论的先前阻止PCO手段的缺点。本发明通过快速的、选择性的诱导晶状体上皮细胞(LECs)脱落和/或死亡，阻止PC0，而对其它眼部细胞和组织无明显损伤，因而很容易整合入已有的标准白内障手术和未来具有潜力的新治疗方法中，并使得在白内障手术中或手术后容易去除残存的上皮细胞。通过应用处理溶液可以阻断PC0。 在白内障手术前，手术中，或手术后，将处理溶液应用或引入到晶状体囊袋中。另外，处理溶液也可在白内障手术前应用到可注射人工晶状体上。处理溶液包含一种离子转运机制干扰剂，可以单独应用，也可与其它处理药物合并应用，如渗透胁迫剂(osmotic stress agent) 和建立合适PH的药物，可选择性的诱导晶状体上皮细胞(LECs)脱落和/或死亡，从而阻止后囊膜混浊的发生。由于离子转运机理干扰剂可以干扰广谱细胞的细胞机理和离子分布， 须选择合适的药物浓度使得可以选择性的干扰上皮细胞的细胞机理，而对其它眼部细胞基本上无损害。该处理溶液可选择性的诱导晶状体上皮细胞(LECs)的脱落和/或死亡，而对其它眼部细胞和组织基本上无损害，也无外科手术前冗长的预处理过程。处理溶液可于白内障手术前，手术中和手术后被应用或引入，通过如下方式快速的、选择性的去除LECs :(i)通过干扰细胞正常功能，选择性诱导LECs从其基底或膜上脱落，导致细胞最终死亡或至少使去除LECs变的容易；(ii)通过干扰细胞正常功能，选择性诱导LECs细胞死亡；和/或(iii)通过干扰细胞正常功能，诱导LECs对渗透胁迫的易感性，最终导致细胞脱落和/或死亡。本发明使得干扰广谱细胞离子转运机制的化学药物特异的、独特的靶向LECs。在本发明的一个实施方案中，通过应用一种离子转运机制干扰剂诱导LECs较其它眼部细胞发生相当大(substantially greater)比率的脱落和/或死亡以阻止PC0。本发明的离子转运干扰剂能够直接或间接干扰LECs细胞外、细胞内和/或细胞间调节离子和水跨细胞膜的机制。这种干扰可以引起细胞收缩和/或膨胀，结果引起细胞的脱落和/或死亡。选择药物的浓度使得含有离子转运干扰剂的处理溶液可引起晶状体上皮细胞发生明显脱落或死亡，而不引起较大百分数的其它眼部细胞脱落和/或死亡。尤其是，离子转运机制干扰剂可包括协同转运干扰剂、钠泵干扰剂、交换干扰剂或通道干扰剂。离子转运干扰剂本身可诱导LECs细胞容积变化和/或细胞脱落和/或死亡，或使 LECs易感，以至于不能对可引起渗透压胁迫的其它药物做出充分的响应，选择性的脱落和 /或杀死LECs，阻止PC0。这些其它药物是一种渗透胁迫剂，例如在LECs中可诱导渗透冲击，引起细胞脱落和/或死亡的渗透剂。本发明的处理溶液具有合适的pH，是根据特定渗透胁迫时的选择性浓度确定的， 可用酸、碱或其它药物升高或降低溶液中氢离子浓度调节溶液PH。本发明的这些和其它优点及新颖特征，还有其中的一些细节，将在接下来的描述中得到更为充分的理解。附图简述
图1.阐明了不同眼部细胞(LECs、RPECs和CEDCs)引入包含各种浓度的NaCl溶液后的生存能力；图2.阐明了在无(菱形)或有30 μ M呋噻米(圆圈)(一种协同转运干扰剂)的情况下，对LECs应用浓度递增的NaCl溶液后的细胞生存能力；图3.阐明了对LECs应用pH水平变化的、包含浓度递增的NaCl溶液后总LECs的生存能力；图4.阐明了对RPECs应用在变化pH水平下包含浓度递增的NaCl溶液后的生存能力；图5.阐明了对LECs和RPECs应用包含彡200mM NaCl、浓度递增的协同转运干扰剂呋噻米和3μ 1 5Ν NaOH的处理溶液后的生存能力；图6.阐明了对LECs、RPECs和CEDCs应用包含彡200mM NaCl、浓度递增的协同转运干扰剂布美他尼和3μ 1 5Ν NaOH的处理溶液后的生存能力； 图7.为3张图片，阐明了本发明的处理溶液处理原代培养的LECs的效应， (A) Omin, (B) 5min 禾口 (C)洗涤后 IOmin0 图8.为4张图片，阐明了本发明的处理溶液处理人器官培养PCO模型中的原代培养LECs的效应，(A)处理前，(B)处理后5min，(C)处理后IOmin和(D)洗涤后；图9.为4张图片，阐明了应用包含彡200mM NaCl、90 μ M呋噻米和3 μ 1 5Ν NaOH 的处理溶液处理RPECs的效应，(A)Omin，(B)处理后5min，(C)处理后IOmin和(D)洗涤后；图10.阐明了对LECs、RPECs和CEDCs应用包含彡200mMNaCl、90μM呋噻米和3μ 1 5N NaOH的处理溶液后的生存能力；图11.阐明了应用包含200 μΜ DHCT和彡200mM高渗NaCl的处理溶液处理 LECs-CCCs 的效应，(A) Omin, (B)约 2min 禾口 (C)洗涤后；图12.阐明了应用含有DHCT和高渗NaCl的处理溶液体内处理兔眼(C，D，E)后的效应，3周后治疗组(C，D，E)和对照组(A，B)的效果比较；图13.阐明了应用包含308 μ M布美他尼和高渗NaCl的处理溶液处理LECs-CCCs 的效应，(A)Omin, (B)5min和(C)洗涤后；图14.阐明了应用含有布美他尼和高渗NaCl的处理溶液体内处理兔眼睛后的效果；图15.阐明了应用包含NEM的处理溶液处理人LECs的效应，(A) Omin，⑶约!Bmin 和(C)洗涤后2min ；和(D，E)在体内兔眼上；图16.阐明了应用包含短杆菌肽和PBS的处理溶液处理LECs-CCCs的效应， (A) Omin, (B)anin 和(C)洗涤后；表1.涉及不同处理溶液在体内兔眼中阻止PCO的效应。发明详述尽管将联系一种或多种优选实施方案来描述本发明，但并不应被理解为本发明仅限于这些实施方案。相反，本发明包含所有可能包括在对说明书形成结论的权利要求的精神和范围内的可选择的、修改的和等效的方案。本发明通过单独应用或与其它药物合用离子转运机制干扰剂，快速的、选择性的诱导晶状体上皮细胞从晶状体囊脱落和/或死亡，从而阻止PCO，而对其它眼部细胞和组织基本无损害，也无冗长的外科手术前处理。LECs与其它眼部细胞有区别，这一特性使选择性脱落和/或死亡成为可能。结果是，在选用的药物剂量和浓度下，LECs经历了容积变化 (如收缩)，脱落，被杀死和/或被从晶状体清除的过程，而其它细胞和组织保持不受损害。水份可以有效控制人细胞膜两侧的热力平衡。因为事实上，所有人细胞的细胞膜对水而言都是高通透性的，细胞容积取决于渗透活性溶质(电解质和渗透剂)的细胞内含量和细胞外液的摩尔渗透压浓度和/或液体张力。一般而言，细胞内和细胞液体张力是相同的，在生理条件下，大多数哺乳细胞并非暴露于较大跨度的体液张力中。体液的摩尔渗透压浓度约为^5mOsm/kg H2O,受体液稳态的限制在非常狭窄的界限内(士3%)调节。但，在病理生理情况下，体液稳态遭受扰乱，已观察到血流摩尔渗透压浓度可以在约220m0sm/kg H2O到约350m0sm/kg H2O之间变化。在极端的情况下，缺失了容积调节机制，体细胞可分别膨胀和收缩20%到30%。晶状体上皮细胞和其它细胞一样，可利用容积调整的过程抵抗细胞外摩尔渗透压浓度的变化，以保持恒定的细胞容积。晶状体上皮细胞，纤维和睫状上皮细胞的容积调节机制先前已有描述。见例，CW. McLaughlin et al,Amer. J. Phsiol. Cell Physiol. 2001 Sept ； 281(3) :C865-75 JJ. Zhang et al, Exp. Physiol. 1997 Mar :82(2) :245-59 JJ. Zhang et al, Exp. Physiol. 1994 Sept :79(5) :741-53 JJ. Zhang et al, J. Physiol. 1997 Mar 1 ； 499 (Pt. 2) :379-89。渗透干扰后，继而进入容积调整期，细胞趋于恢复到在等张等渗介质中的容积。细胞容积的变化可激活特异性的代谢和膜转运通路，结果导致渗透活性溶质的净积累或净损失。调节性容积减少(调节性容积回缩)(RVD)是响应细胞外低渗透压或张力时，用以减少加或保持细胞容积的方法。调节性容积增加(RVI)是响应细胞外高渗透压或张力时，用以增加或保持细胞容积的方法。当细胞溶质含量(如细胞内张力)或细胞外张力改变时，将发生快速的穿膜水流以恢复平衡。因为质膜具有高度适应性，可引起细胞膨胀或收缩。细胞改变细胞内离子浓度以建立平衡的一条通路是通过利用位于细胞膜表面的离子转运机制。这种机制使离子迁入或移出细胞，结果改变了细胞内离子强度和渗透压。 如，各种类型细胞RVD过程中，被激活离子转运机制包括传导性K+和Cl—通道(单独的传导性K+和Cl—转运通路)，K+-C1—协同转运通路和功能偶联的K+-H+和Cr-HCO3-交换。各种类型细胞RVI过程中，被激活离子转运机制包括Na+-K+-Cr协同转运通道和功能偶联的Na+-H+ 和 C1_-HC03_ 交换。不同类型细胞之间离子转运机制在本质和反应性上具有惊人的多样性。见 Hoffmann and Simonsen, Physiol Rev. 1989 Apr ；69 (2) :315_82。例如在体内角膜内皮细胞中未发现布美他尼依赖的协同运输机制，但在晶状体上皮细胞中却有高表达。Haas， Μ. 1994 Am. J. Physiol. 267, C869-C885 ；Lawrence et al 2001,Exp. Eye Res. 73，660。不同细胞间容积的设定点也显著不同，例如细胞具有某一容积设定点，在该容积点时候，有能力进行RVD和RVI的细胞既不膨胀也不收缩。不同的细胞具有不同的容积设定点，在该点时， 转运机制被打开或者关闭，见Parker，J. C Am J Physiol. 1993,265 :C1191_1200 ；ParkerJC et al. J Gen Physiol. 1995 Jun ； 105 (6) :677_99。晶状体细胞关闭 RVI 和 RVD 程序的设定点或基线与其它眼部细胞不同。对贴壁细胞而言，细胞形状和整合素与细胞外介质的相互作用在决定细胞脱落、生存或诱导程序性细胞凋亡中起关键性作用。容积调节机制对细胞分裂也是必需的。另外，在不同眼部细胞的不同部位发现了协同转运机制，这可能影响前房治疗的效果。例如，睫状上皮细胞的协同转运并非直接暴露于前房中。(Jacob and Civann, Am. J. Physiol. 271 (40) :C703_720，1996)。这将LECs与其它眼部细胞和体细胞区分开来。干扰晶状体上皮细胞离子转运机制，阻止细胞对低渗或高渗的细胞外环境或其它细胞应激做出充分反应。细胞未对这些应激做出反应迟早将引发细胞脱落和/或死亡。晶状体上皮细胞未能对应激做出响应或使其不能对应激做出响应，可能有如下几种反应。一种反应是细胞死亡，另外一种可能的反应是从其下面的基底或膜上脱落。例如， 细胞可能收缩，以至于细胞再也不能保持黏附在基底上，这可能与细胞骨架的重排有关。细胞收缩也可引起贴壁细胞重新排列其焦点黏附接触或连接这些接触的骨架。细胞脱落最终引起细胞死亡和/或使细胞去除变得容易。细胞死亡导致细胞从周围细胞和细胞外基质(ECM)脱落。脱落发生时，细胞未必立即死亡。例如，已证明破坏细胞外基质(ECM)接触可诱导失巢凋亡，失巢凋亡是细胞从其分站(substation)细胞脱落后诱发的一种细胞凋亡形式。晶状体上皮细胞另一个可能的反应是弱化或敏化了细胞，使得细胞对渗透胁迫或冲击变得脆弱。例如，一旦细胞被致敏，便使其不能对渗透冲击或胁迫做出适当的反应，以至于对敏化细胞引入冲击或胁迫将引起细胞容积改变、脱落和/或细胞死亡。如某些实例所示，LECs处理后，在冲洗、洗涤或其它搅动的方法使脱落和/或坏死细胞清除前后，观察细胞面积(或通过其它技术包括光学成像技术、光学和落射荧光显微镜、共聚焦显微镜、电子显微镜、免疫荧光技术、原位杂交技术和蛋白质鉴定和分析技术)，证明了其容积改变、脱落和/或死亡。本发明的处理溶液和方法通过选择性、快速的引起至少LECs三个中的一个反应，阻止PC0，而对其它眼部细胞基本无损害。一方面，本发明的眼部处理溶液和方法利用一种离子转运机制干扰剂，通过诱导 LECs较其它眼部细胞如角膜内皮细胞(CEDCs)和视网膜色素上皮细胞(RPECs)相当大比率的从其基底或膜脱落和/或死亡，阻止PC0。因此，本发明的一个显著优点是用本发明药物处理，通过清除晶状体囊袋中的相当大比率的LECs阻止PC0，而对其它眼部细胞和组织无
显著性损害。离子转运机制干扰剂是一种能够直接或间接在细胞内、细胞外和/或细胞间干扰调节离子和水在晶状体上皮细胞膜内或跨膜流动机制的药物。离子转运机制干扰剂可干扰正常细胞离子分布机制，由此干扰细胞功能。或单独应用或与其它药物合并应用本发明的离子转运机制干扰剂，可扰乱LECs细胞离子正常分布，由此选择性的、直接或间接诱导 LECs脱落和/或死亡，阻止PC0。选择药物的浓度使得处理溶液能够干扰LECs的离子转运机制，引起细胞容积改变、脱落和/或死亡，但基本上不干扰其它眼部细胞的离子转运机制。因LECs脱落和/或死亡，很容易被从晶状体囊袋中清除，而其它眼部细胞基本无损伤。离子转运干扰剂是可以干扰LECs中的一种或多种细胞机制的药物(1)协同转运机制(例如K+-Cl-协同转运，Na+-Cl-协同转运，Na+-K+-2Cr协同转运和氨基酸转运)； (2)钠泵；(3)离子交换(例如，功能偶联的Na+-H+和Cr-HCO3交换；功能偶联的K+-H+和 C1_-HC03_交换，C1_-C1_>交换，Ca2+-Na+交换)；和(4)离子通道(例如钾通道、氯通道、容量敏感性有机渗透剂和阴离子通道(VSOAC)、孔道形成蛋白/肽和其它阴离子通道)。离子通道机制干扰剂可以直接或间接激活或抑制这些细胞机制。在低渗介质中，脊椎动物细胞开始因渗透水平衡发生膨胀，但后来通过KCl的净损失和随之发生的细胞水的损失调整其容积以恢复正常细胞容积。细胞膨胀激活转运通道导致钾、氯和有机渗透剂净流出。各种细胞RVD过程中，离子转运机制被激活，包括，传导性 K+和Cl—通道(独立的传导性K+和Cl—转运通路)，K+-C1—协同转运通路和功能偶联的K+-H+ 和C1_-HC03_交换。例如，钾和氯主要通过激活K+和Cl_协同运输通道或分别激活钾和阴离子通路而流出细胞。相反，在高渗介质中，脊椎动物细胞开始因渗透水平衡而收缩，但后来通过KCl净获得和随之发生的细胞水的摄入而调整其容积以恢复正常细胞容积。细胞收缩激活了转运通路，结果导致氯、钠和钾净内流。各种细胞在RVI过程中，离子转运机制被激活，包括 Na+-CF或Na+-K+-2Cr协同转运通路，和功能偶联的Na+-H+和Cr-HC03_交换。离子转运机制干扰剂的实例包括但不限于
N-乙基顺丁烯二酰亚胺缬氨霉素短杆菌肽儿茶酚胺类 丐离子载体(Ionophore) A23187(包括，例如离子载体A23187加钙)钙调节蛋白匹莫齐特髓袢利尿药(例如，呋噻米、布美他尼、依他尼酸、吡咯他尼、托拉塞米)噻嗪类利尿剂(例如，双氢氯噻嗪、氢氯噻嗪、环戊噻嗪、苯噻嗪、氯噻嗪、苄氟噻嗪、氯噻酮、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、甲苯喹唑酮、泊利噻嗪、喹乙宗、三氯噻嗪)氨氯吡咪4,4' - 二异硫氰酸二苯乙烯_2，2' - 二磺酸(DIDS)十字孢碱(SITS
尼氟灭酸二苯乙烯衍生物(例如4，4' -二硝基二苯乙烯(dinitr0Stilbene)-2' 2_ 二磺酸(disulfonic acid)奎宁细胞松弛素B。总之，有四种类型的离子协同转运机制干扰剂⑴协同转运干扰剂；(2)钠泵干扰剂；(3)交换干扰剂；和(4)通道干扰剂。正如下面所反映的是，一种离子转运干扰剂可以被归于上述四类中的一类或多类，这是不言而喻的。协同转运干扰剂是能够直接或间接干扰细胞的协同转运机制的药物。特别是，协同转运干扰剂能激活或抑制LECs的协同转运机制。选择协同转运干扰剂的浓度，使得处理溶液诱发LECs较其它眼部细胞发生相当大比率的脱落和/或死亡。协同转运的实例包括 K+-CF或Na+-K+-2Cr协同转运。协同转运干扰剂的例子包括利尿剂，例如(i)噻嗪利尿剂，如双氢氯噻嗪、氢氯噻嗪、氢氯噻嗪、环戊噻嗪、苯噻嗪、氯噻嗪、 苄氟噻嗪、氯噻酮、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、甲氯噻嗪、甲苯喹唑酮、泊利噻嗪、喹乙宗、三氯噻嗪。在美国通常应用的品牌名包括Aquatensen(甲氯噻嗪)、Diucardin(氢氟噻嗪)、 Diulo (甲苯喹唑酮)、Diuril(氯噻嗪)、Enduron (甲氯噻嗪)、Esidrix (氢氯噻嗪)、 Hydro-chlor (氢氯噻嗪),Hydro-D (氢氯噻嗪),HydroDIURIL (氢氯噻嗪),Hydromox (喹乙宗)、Hygroton (氯噻酮)、Metahydrin (三氯噻嗪)、Microzide (氢氯噻嗪)、Mykrox (甲苯喹唑酮)>Naqua (三氯噻嗪),Naturetin (苄氟噻嗪)、Oretic (氢氯噻嗪),Renese (泊利噻嗪)、Saluron (氢氟噻嗪)、Thalitone (氯噻酮)、Trichlorex (三氯噻嗪)、Zaroxolyn (甲苯喹唑酮)、Apo-Chlorthalidone (氯噻酮)、Apo-Hydro (氢氯噻嗪)、DiuchlorH (氢氯噻嗪)、Duretic (甲氯噻嗪)、HydroDIURIL (氢氯噻嗪)、Hygroton (氯噻酮)、Naturetin (苄 Μ β Ri )、Neo-Codema (Mtt^Ri )、Novo-Hydrazide ()、Novo-Thalidone (
酮)、Uridon (氯噻酮)、Urozide (氢氯噻嗪)和Zaroxolyn (甲苯喹唑酮)。
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(ii)长效利尿药，如benzmetanide、布美他尼、托塞米、依他尼酸、呋噻米(又称为呋喃苯胺酸)。通常应用的品牌名包括=Bumex (布美他尼),Demadex (托塞米),Edecrin (依他尼酸)>Lasix (呋噻米),Myrosemide (呋噻米),Apo-Furosemide (呋噻米),Edecrin (依他尼酸)>Furoside (呋噻米),Lasix (呋噻米),Lasix Special (呋噻米),Novosemide (呋噻米)和Uritol (呋噻米)。(iii)保钾利尿药。美国通常应用的品牌名为Aldactone (螺内酯)，Dyrenium(氨苯蝶啶)和Midamor (阿米洛利)。加拿大通常应用的品牌名为Aldactone (螺内酯)、 Dyrenium(氨苯蝶啶)、Midamor (阿米洛利)和Novospiroton(螺内酯)。(iv)碳酸酐酶抑制剂，如Acetazolamide (乙酰唑胺)、Dorzolamide (多佐胺)和 Brinzolamide (布林唑胺)。(ν)含钾利尿剂=Burinex K(R) (Leo)(布美他尼)、Centyl K(R)(苄氟噻嗪)、 Lasikal(R)和 Neo-NaClex-K(R)。(vi)合用的利尿药，如Triam-co [氨苯蝶啶氢氟噻嗪合用50/25] ；Amil-co [阿米洛利氢氯噻嗪合用5/50]、co-amilozide 5/50 [阿米洛利/呋塞米合用5/50]、 Moduretic[阿米洛利氢氯噻嗪合用5/50]、Dyazide[氨苯蝶啶氢氯噻嗪合用50/25]、 Navispare [阿米洛利 2. 5mg+cycIopenthiazide 环戊噻嗪 250mcg]、co-amiIofruse 5/40[阿米洛利呋塞米合用5/40]Fru-co[阿米洛利/呋塞米合用5/40]Frusene[氨苯蝶啶50mg+呋塞米40mg]、Kalspare[氨苯蝶啶50mg+氯噻酮50mg] ；Burinex A[阿米洛利 5mg+布美他尼lmg] Lasoride [阿米洛利呋塞米合用5/40]、Frumil [阿米洛利/呋塞米合用5mg/40mg]Lasilactone [螺内酯50mg+呋塞米20mg] ,Aldactide 50 [氟噻嗪螺内酯合用 50/50]和Dytide [氨苯蝶啶50mg+苄氟噻嗪25mg] ；Co-flumactone [螺内酯和氢氟噻嗪合用]。协同转运干扰剂的例子还包括通过K-Cl协同转运促进KCl外流增加，而引起细胞收缩的协同转运干扰剂，包括 DDS-N0H、二氢茚基[氧基]烷酸(DIOA)、冈田酸(OA)、A-23187、1-乙基-2-苯并咪唑啉酮、YM934、克罗吗宁、偕二甲基取代物9- (3,4- 二氯苯基)_3，4，6，7，9，10-六氢-1，8 (2H, 5H)-吖啶二酮(A-184208)、北非蝎毒素(ChTX)、前列腺素E2、十字孢碱、K+离子载体、凡林霉素、肿瘤坏死因子α加(戊二酰)亚胺环己酮、二氮嗪、吡那地尔和尼可地尔、升高细胞内cAMP或cGMP水平的药物(Nelson et al.，1995)，以及花生四烯酸环氧化物。通过激活K-Cl协同转运机制诱导钾和氯及其它离子和渗透剂损失(如细胞内钙排空或升高)的刺激物N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)(包括，例如N-乙基顺丁烯二酰亚胺加铷)碘代乙酰胺汞(Hg2+)和其它任何能够激活或抑制晶状体上皮细胞协同转运机制的药物。钠泵干扰剂为能够直接或间接干扰细胞内被称为钠泵的Na/K/ATP酶泵机制的药物。尤其是，钠泵干扰剂可以激活或抑制LECs的Na/K/ATP酶泵。例如，LECs含有非永久的阴离子大分子，阴离子和水扩散入细胞而导致的胶质渗透压肿胀经常被离子外排泵以等于损耗性泄漏进入(dissipative leak entry)的速率外排离子而抵消。选择钠泵干扰剂的浓度使得处理溶液可诱导LECs较其它眼部细胞发生相当大比率的脱落和/或死亡(如通过肿胀)。钠泵干扰剂的实例包括毒毛花甙G和其它任何能够激活或抑制晶状体上皮细胞钠泵的药物。但，另外一种类型的离子交换机制干扰剂是一种交换干扰剂。交换干扰剂是一种能够直接和间接干扰细胞离子交换的药物。尤其是，交换干扰剂激活或抑制LECs离子交换机制，这不仅引起细胞内和细胞间的离子再分布，而且还可以改变细胞内PH。离子交换机制的实例包括K+-H+和Cr-HCO3-交换，和Cr-HCO3交换功能偶联的Na+-H+交换。例如，通过激活K+-H+和Cr-HCO3-交换诱导钾和氯损失的刺激物都是交换干扰剂。交换干扰剂的实例包括十字孢碱(SITS)阿米洛利二 -异硫氰基-二磺酰基-二乙烯苯(di-isothiocyano-disulfonylstilbene) (DIDs)钙调素(CaM)铜离子(Cu2+)氢离子(H+)和其它任何能够激活或抑制晶状体上皮细胞交换的药物。通道干扰剂是一种能够直接或间接干扰细胞离子通道的药物。尤其是，通道干扰剂能激活或抑制LECs离子通道。离子通道的实例包括钾、氯、钠和VSOAC和孔形成蛋白/ 肽通道或转运通路。例如，通过激活钾和氯通道诱导氯化钾和有机渗透剂损失的任何刺激物都是通道干扰剂。选择通道干扰剂的浓度使得处理溶液能诱导LECs较其它眼部细胞发生相当大比率的脱落和/或死亡。通道干扰剂的实例包括酮康唑(KETO)
5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲
1，9-二脱氧弗司扣林(DDF)
他莫昔芬
维拉帕米
奎宁
钡(Ba2+)
二苯胺-2-羧酸盐或酯(DPC)
蒽-9-甲酸
indocrinone(MK-196)
匹莫齐特
CBIQ
EBIO
1-乙基-2-苯并咪唑酮
他莫昔芬+ATP
巯基氧化剂
蛋白磷酸化抑制剂
4-氯-苯并[F]异喹啉β-CCM、ZK 93426氟马西腺苷磺酰脲花生四烯酸(AA)磷脂酶C (PLC)蛋白激酶CG 蛋白能诱导纤维型肌动蛋白结构发生变化的药物和任何能够激活或抑制晶状体上皮细胞离子通道的药物。孔形成蛋白/肽是能够在晶状体上皮细胞中为通常情况下不能穿越双层膜的分子制造通路的药物。尤其是，PPFI5s形成一个孔或通道以促进细胞内K从LECs中泄漏。在过去的半个世纪中，有上百种肽抗生素被描述，包括短杆菌肽、地衣杆菌素；多粘菌素(B) (Neosporin, Otosporin)、制霉菌素(Nystan, Tri-Adcortyl)、糖肽、α-防御素、β-防御素1、鲎肽素、细菌乳链菌肽、α-红细胞溶解素、roimmunolysins、孔蛋白(OmpA、PhoE、 NmpC, OmpF, Phosphoporin, LamB porin)、BcI-XL ； α -红细胞溶解素、气溶素、大肠杆菌素、丙甲菌素、抗菌肽蛙皮素、天蚕抗菌肽；两亲性β片状肽(短杆菌肽、防御素和细胞溶解素)、α-螺旋肽(丙甲菌素、肺炎[链]球菌溶血素、抗菌肽蛙皮素和天蚕抗菌肽)、 ranalexin ( 一种抗菌肽)、brevinin ( 一种抗菌肽)和 PR39。利用本发明的药物，选择药物的浓度使得应用该处理溶液，引起LECs细胞的生存能力小于约10%，更优选小于约5%，更进一步优选接近O。而对其它眼部细胞的理想生存能力，如RPECs和CEDCs，优选大于约70%，进一步优选约90%，更进一步优选接近100%。在这种情况下，包含药物的处理溶液，也可与其它药物合并应用，可选择性诱导 LECs较其它眼部细胞发生相当大比率的脱落和/或死亡。如实施例中所示，可在冲洗、洗涤或其它搅动的方法使脱落和/或坏死细胞清除前后，观察细胞面积，证明其脱落和/或死亡。上述的本发明药物(下文称为主药(primary agent)单独应用或与下述另外的药物和/或其它药物或化学品合并应用，可直接或间接选择性诱导LECs脱落和/或死亡。例如，本发明的眼部处理溶液和方法除主药外，还包括一种渗透胁迫剂，其中的溶液可诱导晶状体上皮细胞较角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞发生相当大的比率细胞脱落和/或死亡，以阻止后囊膜浑浊。渗透胁迫剂是能够诱导LECs中渗透冲击的药物。改变细胞内和细胞外正常离子平衡的细胞条件都可以引起LECs渗透冲击。例如，渗透活性溶质细胞外浓度的改变和各种影响涉及细胞容积控制的特定离子转运系统活性的各种刺激物质(例如，激素、生长因子和其它外部刺激物质、细胞膜电位和细胞质第二信使)，都可以诱导渗透冲击。大量的跨细胞离子流可以冲击细胞体积的动态平衡。将细胞暴露于低渗溶液或低渗摩尔渗透压浓度的溶液可以引起低渗胁迫。相反，细胞暴露于高渗溶液或具有高渗摩尔渗透压浓度的溶液可引起高渗胁迫。细胞内渗透活性溶质和有机溶质浓度的升高或降低也可冲击细胞体积的调节，激活与RVD或RVI响应有关的的膜转运过程。当主药使LECs对渗透冲击变得敏感(例如通过抑制一种离子转运机制)和当渗透胁迫剂本身可诱导细胞脱落和/或死亡时，应用或引入一种渗透胁迫剂是合适的。例如， 如果离子转运机制干扰剂抑制一种必需离子转运机制，如钠-钾泵协同转运，LECs就不能保护自己抵抗外部的渗透胁迫或冲击，因而提高其对其它渗透胁迫剂引起的细胞外渗透压的敏感性。LECs未对渗透胁迫或冲击做出响应，将会通过激活死亡信号程序，引发细胞死亡。但是，需理解的是，主药也可以是渗透胁迫剂，如主药可以同时干扰LECs离子转运机制并诱导渗透冲击。特别是，渗透胁迫剂具有高渗或低渗摩尔渗透压浓度。低渗溶液含有较常见于正常生理条件的较低浓度溶质；高渗溶液含有较常见于正常生理条件的较高浓度溶质。换句话说，渗透胁迫剂导致了细胞外高压或低压。任何生理可容忍的电解质和渗透剂，任何对渗透张力有贡献的溶质，都适合诱导渗透胁迫或冲击。渗透剂的实例包括盐(例如NaCl)，包括(i)阳离子与相应的阴离子形成的无机盐，所述阳离子包括钠、钾、锂、铷、铍、镁、 钙、锶、钡、铝、锌、锡、银、金、铁、汞，相应的阴离子包括氯、溴、碘、氢氧根、硼酸根、偏硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硝酸根、氟离子、硫酸根、单磷酸根、二磷酸根、磷酸根、硫氰酸根和异硫氰酸根。(ii)上述同样阳离子与相应的阴离子形成的有机盐，相应的阴离子例如醋酸根、藻酸根、苯甲酸根、丁酸根、辛酸根、己酸根、枸橼酸根、癸磺酸根、癸基硫酸根、十二烷基硫酸根、二乙基巴比妥酸根、二甲二硫氨基甲酸根、连二亚硫酸根、十二烷基磺酸根 (dodecansulfonate)、乙基磺酸根、氟乙酸根、氟磷酸根，、富马酸根、六氟磷酸根、己磺酸根 (hexansulfonate)、碘醋酸根、L-乳酸根、D-乳酸根、D，L-乳酸根、马来酸根、丙二酸根、 mesolaxate、肉豆蔻酸根、油酸根、草酸根、棕榈酸根、丙酸根、水杨酸根、酒石酸根和三氟乙酸根；氨基酸(如牛磺酸、甘氨酸和丙氨酸)；糖(如甘露醇、肌醇、甜菜碱、甘油磷酰胆碱、甜菜碱、尿素、蔗糖和葡萄糖)；及其它任何有机和无机渗透剂。值得注意的是，当渗透剂是氯化钠时，如上所述，氯可以被碘、溴、硝酸根、硫氰酸根、氟、硫酸根、羟乙基磺根、葡糖酸根和其它可接受的基团取代；同样，钠也可以被钾、锶、 铷、锂、钫和其它可以接受的取代物代替。优选的渗透剂为氯化钠、氯化钾、溴化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、氢氧化钠、碘化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硝酸钠、氟化钠、硫酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、乳酸钾、碳酸氢钾、溴化钾、氢氧化钾、碘化钾、硝酸钾、硫酸钾、氯化锶、氯化铷和氯化锂。渗透胁迫剂和主药在治疗PCO时可以单独应用，同时应用或先后顺序应用。处理溶液pH优选5到11，这取决于使用的药物和药物浓度。在一个优选的实施方案中，处理溶液包括约士200mM NaCl，进一步优选彡200mM NaCl，pH优选范围约8 10，进一步优选为7. 6。处理溶液的pH可以通过改变主药或渗透胁迫剂的浓度或引入可以改变PH的其它化学药物加以调整。可以用任何增加或减少氢氧根离子浓度的酸和碱调整pH。一定浓度范围内的主药、渗透胁迫剂和调整pH的药物组成的处理溶液都可发挥作用。依据本发明，选择合适的药物浓度，使得干扰广谱细胞细胞机制的药物能选择性干扰 LECs离子转运机制，引起LECs脱落和/或死亡。处理溶液的应用可引起较大百分数的LECs 发生脱落和/或死亡，而其它眼部细胞仅较小百分数受损。在药物浓度范围的一个端点，处理溶液的效率降低，结果需要更长时间杀死LECs。在另一个端点，药物有杀死其它眼部细胞的倾向。应选择主药，渗透胁迫剂和调整PH药物的合适浓度，使得可以通过选择性的诱导LECs脱落和/或死亡阻止PC0，而对其它眼部细胞和组织无明显损害。优选的是，应选择药物浓度，使得一旦应用该处理溶液，LECs细胞生存能力小于约10%，进一步优选少于约 5 %，更进一步优选接近0，而其它眼部细胞，如RPECs和CEDCs的生存能力高于约70 %，进一步优选高于约90%，更进一步优选接近100%。活性成分的浓度依赖于其药理活性，但一般优选低于1500 μ Μ,进一步优选低于1000 μ Μ,更进一步优选低于500 μ Μ。上述的药物和其使用浓度是相关联的。例如，高pH处理溶液在低水平等渗溶摩时就可杀死LECs。某种药物的合适浓度将在下面实施例中提供。而且，可以改变浓度以适应主流白内障手术技术的特定需要和病人需要。本发明的处理溶液可以在白内障手术前，手术中和手术后应用以阻止PC0。打开晶状体前囊，摘除白内障。将人工晶状体植入后囊。除此之外，晶状体和晶状体内容物可以被可注射的人工晶状体取代(又称为晶状体再填充技术)。在植入晶状体囊袋前(例如通过注射或植入)，可以用本发明的处理溶液对人工晶状体和晶状体材料进行预处理。采用真空技术或其它手术技术可以去除残余的LECs，或也可不去除。晶状体乳化术、激光或其它技术也可以用来去除晶状体内容物。在该过程前、进行中、或进行后任何时间都可以在局部应用或引入本发明的处理溶液。然后洗涤眼部区域以去除残余的细胞。如上所述，处理溶液可以包括主药、渗透胁迫剂和任何调节溶液pH的化学物质。 除此之外，可以按顺序或同时应用或引入单独包含主药、渗透胁迫剂和/或调节PH的化学物质的溶液以阻止PC0。如上述描述，主药也可以是渗透胁迫剂。可以通过注射器滴器、超声乳化用探针或其它任何适合或方便的使用方法应用处理溶液。本发明的另外一个优点是，处理溶液可以诱导细胞相对快速的体积变化(例如， 晶状体上皮细胞收缩、脱落和/或死亡)以使本发明的处理方法可以很容易整合到白内障手术中。晶状体上皮细胞在应用本发明的溶液或药物约30min后发生脱落，几小时后细胞死亡。优选的是，应用约15min后细胞体积改变和/或脱落，但这依赖于选择的药物及其浓度。本发明的处理溶液和方法是否已诱导LECs细胞较其它眼部细胞发生相当大比率的脱落和/或死亡，这种处理是否具有选择性，可以在处理后通过细胞生存能力的比较评价或其它可接受的测定效率的方法加以确定。尤其是，该处理溶液和方法应阻止PCO而对已述的其它眼部细胞仅引起最小限度的生理损害。优选的是，应选择药物和药物浓度，使得一旦应用后，LECs细胞生存能力低于约10%，而其它眼部细胞如RPECs和CEDCs的生存能力大于约70%。应了解，处理溶液可以包括其它药物、化学物质、蛋白质和/或物质，也可包括多于一种主药和渗透胁迫剂。可以加入其它化学物质或生理成分以改善处理溶液的性质，如生理耐受性、粘度和储存性能。
当采用再填充技术时，在白内障手术前，可用该处理溶液涂布人工晶状体和/或人工晶状体材料或与人工晶状体材料混合。处理溶液可以包装在试剂盒中或其它包装中， 或以整体溶液贮存，或如上所述以单独的溶液贮存以备后用。例如，一个试剂盒或包装可以包括含有离子转运机制干扰剂的溶液，该溶液与含有渗透胁迫剂的溶液分开包装。另外，处理溶液可以包装在含有可用于超声乳化液体的试剂盒或包装中，或包装在用于注入可注射人工晶状体前去除晶状体内容物的试剂盒中。
实施例比较实施例1如下所描述，将生长于96孔平底板的LECs、CEDCs和RPECs融合单层细胞暴露于不同浓度的NaCl (—种渗透剂)溶液中，在每孔中分别加入200μ1浓度为137mM、170mM、 340mM、680mM、1360mM和2000mM NaCl溶液(按如下描述配制)，溶液pH为8. 0 士0. 4。各浓度NaCl溶液对应的最终摩尔渗透压浓度分别从约285到4000m0sm/L。在加入高渗NaCl 后约5到10分钟内，一些LECs开始收缩，变圆(round up)，失去与单细胞层的黏附作用，并呈现剂量依赖性。在CEDCs和RPECs中未见如此明显效应。随高渗NaCl的浓度升高，LEC、CEDC和RPEC的细胞生存能力见图1 (LECs以浅灰菱形表示，RPECs为暗灰正方形，CEDCs为黑色菱形)。每点代表2次实验的均值。在约1380mM NaCl高渗胁迫下，约40%的LECs存活，而多于80%的CEDCs和RPECs存活，这证明了细胞间的不同的渗透耐受性。培养人晶状体上皮细胞，人角膜内皮细胞和人视网膜色素上皮细胞的原代细胞和第一传代细胞，上述细胞(LECs、CEDCs和RPECs)是用细胞分离和酶消化标准技术从尸身的眼睛中分离获得的，方法见^ibersax ED, Grindstaff RD and Defoe DM Exp Eye Res.2000Mar ；70(3) :381-90 ；Wagner LM, Saleh SM, Boyle DJ, and Takemoto DJ. MoI Vis. 2002Mar 14 ；8 :59-66 ；Cammarata PR, Schafer G, Chen Sff, Guo Z, and Reeves RE.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002 Feb ；43 (2) :425-33 ；Rakic JM, Galand A, and Vrensen G F.Exp Eye Res. 2000Nov ；71 (5) :489_94。LECs 和 CEDCs 培养在 Eagle 氏极限必需培养基(MEM)中，RPECs培养在补充有2mM谷氨酰胺；25mmol/L H印es，pH7. 4 ； 10U/mL青霉素；10yg/mL链霉素和15%热灭活胎牛血清(FCS)的Ham' s FlO培养基中。原代培养的LECs、CEDCs和RPECs在96孔平底板中按IO4/孔进行传代培养，直到它们达到90-100% 融合。细胞在加湿空气中含5% CO2的培养箱中于37°C生长至融合。细胞在分析前保持融合状态过夜。NaCl高渗溶液制备方法为将58. 44克NaCl (NaCl由SigmaChemical co提供， Dorset，英国)加入到500ml dH20中，得到2M NaCl贮备液，用蒸馏水(dH20)稀释2M NaCl 贮备液得到目的浓度的NaCl渗透溶液。例如，要制备170mM NaCl高渗溶液，用dH20按 1 10. 1稀释2M NaCl贮备液即可；要制备340mM NaCl高渗溶液，用dH20按1 4. 56稀释2M NaCl贮备液即可。利用冰点渗透压仪通过凝固点降低法测定溶液的最终(重量)摩尔渗透压浓度(m0sm/kg/H20)。高渗溶液处理后，处理细胞经过充分洗涤，在评价其生存能力前用新鲜的培养基培养12小时。暴露后12- 小时内用MTT法评价细胞在指定高渗胁迫水平下的生存能力。
MTT法是评价线粒体功能的方法，按Mosmann描述操作[Mosmann，T. J Immuno 1 Methods. 1983Dec 16 ；65 (1-2) :55-63]。将 3-0，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，SigmaChemical Co.提供)按5mg/ml溶于磷酸盐平衡液(PBS)中，过 0. 22μπι 1Ηρ0ι·Θ滤膜除菌。将MTT贮备液按1 10加入到培养基中，细胞在该培养基中孵育3至4小时。当加入MTT时，活细胞中线粒体脱氢酶切断四氮环，生成暗蓝色的甲月替 (formazan)反应产物，甲臜在细胞内堆积。MTT反应的培养物不进行进一步处理在明视野显微镜下观察。如某孔细胞完全被反应产物填充(在细胞未贴壁的情况下)或含有自多灶发散的甲臢晶体(在贴壁或延展细胞的情况下)，则该孔细胞被评分为MTT-阳性。用DMSO 溶解MTT反应的培养物，在自动酶标仪上读数，以测量细胞生存能力。特定浓度下测定每孔活细胞数目(MTT阳性)，以总细胞百分数表示(如图1所示)。实施例2实验前，用Hank' s平衡盐溶液(HBSS)洗涤融合的LECs单层细胞三次，以去除 FCS0如实施例1，在96孔培养板中制备LECs。将LECs暴露于200 μ 1/孔的处理液中约5 至10分钟，所述处理液包括浓度递增( 1；35福， 170mM， 340mM， 680mM， 1360mM 和 2000mM的NaCl)的NaCl ( 一种渗透剂)，含或不含30 μ M的呋噻米(一种协同转运干扰剂，一种离子转运机制干扰剂)。处理溶液的PH为8.0士0.4。处理后，处理细胞经过充分洗涤，培养在新鲜的培养基中。如实施例1所描述，处理后12-Μ小时内，用MTT法测定 LECs的生存能力。处理后，如比较实施例1中所观察到的，细胞收缩和脱落现象同样发生于呋噻米存在的情况下，只是这种变化更加显著。图2表明，在无呋噻米存在的情况下(以菱形表示)，用1380mM NaCl快速高渗冲击后，约40%的LECs得以生存。但，用呋噻米抑制协同转运机制后(用圆圈表示)，LECs对渗透压的耐受性显著性降低，用340mMNaCl快速高渗冲击后，几乎没有细胞生存。结果表明，LECs的生存能力从无呋噻米存在的情况下可以耐受 2000mM NaCl渗透冲击变为有呋噻米存在的情况下仅能耐受170mM NaCl渗透冲击。每点代表三次实验的均值士标准偏差(SD)。30. 3mM呋噻米贮备液的配制方法如下先将20mg呋噻米溶解于100 μ 1 DMSO中，确认溶解完全后，将其加入到1. 9ml目的浓度的高渗NaCl中。要得到30 μ M的呋噻米，将5 μ 1呋噻米贮备液加入到5ml目的浓度的 NaCl溶液中(按比较实施例1中描述制备)。比较实施例3该实施例证明了 pH对LECs渗透存活的效应。如比较实施例1中所描述，制备融合的LECs单层细胞。对照组细胞暴露于包含生理浓度的135mM NaCl, pH为7. 4士0. 3的溶液中。其它组细胞暴露于200 μ 1/孔的包含浓度递增( 170mM和 340mM)的，不同 pH(8. 0士0. 4,8. 4士0. 5,8. 9士0. 8 禾口 10. 6士0. 5)的 NaCl 溶液中 10 分钟。通过在选定的IOml高渗NaCl溶液(如实施例1中描述制备)中直接加入0，1，3 或5 μ 1 5Ν NaOH贮备液，调整ρΗ，用专业的pH计测定相应的最终pH。不加NaOH的IOml NaCl溶液最终pH读数为约8. 0 士0. 4。加入1 μ 1 5Ν NaOH的IOml NaCl溶液最终pH读数为约8. 4士0. 5。加入3 μ 1 5Ν NaOH的IOml NaCl溶液最终pH读数为约8. 9 士0. 8。加入 5 μ 1 5Ν NaOH 的 IOml NaCl 溶液最终 pH 读数为约 10. 6 士0. 5。如实施例1所描述，细胞处理后12-Mh，用MTT法测定细胞生存能力。用溶液处理后，细胞生存能力如图3所描述。如图所示，灰色棒代表暴露于135mM NaCl生理盐水的 LECs对照组；黑棒和白棒分别代表暴露于pH升高的170mM NaCl和340mM NaCl中的LECs。 如图所示，随着PH和NaCl浓度升高，LECs对高渗胁迫的敏感性增加。在pH约10. 6士0. 5 时，超过75%的LECs破裂，并在5min内死亡。在pH 8. 9士0. 8时，可有效使LECs从其基质脱落，但破裂并不明显。比较实施例4该实施例证明了细胞外pH对RPECs渗透生存的影响。如实施例1中所描述制备融合的单层RPECs。细胞暴露于200 μ 1/孔的溶液中lOmin，所述溶液包括浓度递增的 NaCl(137mM，170mM，340mM，680mM，1360mM 和 2000mM)不同 pH 值(8. 4 士 0. 5 禾Π 10.6士0· 5) 的NaCl溶液。NaCl溶液按实施例1中描述的方法制备。溶液的pH按实施例3描述的方法加入1 μ 1禾口 5 μ 1 5Ν NaOH加以调节。按实施例1描述的方法，处理后12_24h用MTT法测定细胞的生存能力。应用溶液处理RPECs后，生存能力如图4所示(pH 8. 4士0.5以菱形标出；pH 10. 6士0.5以圆圈标出)。每点代表三次实验的均值士标准偏差。如图所示，当PH升高时，RPECs暴露于高渗 NaCl时，生存水平急剧降低。实施例5按实施例1描述的方法制备融合的LECs和RPECs。细胞暴露于200 μ 1/孔的溶液中约lOmin，所述溶液包括(i)彡200mM高渗NaCl ； (ii)浓度递增的(10 μ M，30 μ M，60 μ M， 90 μ M禾口 120 μ Μ)协同转运干扰剂-呋噻米，和(iii)3yl 5N NaOH。按实施例2中所述方法制备含有呋噻米的处理溶液，用彡200mM的高渗NaCl溶液 (如实施例1中所述制备)稀释呋噻米贮备液。例如，要得到含60 μ M呋噻米的高渗NaCl 溶液，将10 μ 1呋噻米贮备液加入到5ml高渗NaCl溶液中，用3 μ 1 5Ν NaOH调节溶液的 pH。按实施例1描述的方法，细胞处理后12_24h用MTT法测定处理细胞的生存能力。 LECs(圆圈)和RPECs(菱形)的生存能力如图5所示，每点代表6次HLECs实验或4次 HRPECs实验的均值士标准偏差(s. e. m)。如图所示，IOmM的呋噻米时，超过50%的LECs细胞发生收缩，脱落或死亡。30μ M到120μ M的呋噻米时，约90%的LECs被去除或杀死。另一方面，30 μ M到90 μ M的呋噻米时，很少RPECs被去除或杀死。因此，例如，在该pH下，在约200 μ M的高渗NaCl中，约15 μ M到约100 μ M的呋噻米为有效浓度，该浓度对RPECs无明显损伤。实施例6按实施例1所描述，制备LECs、CEDCs和RPECs融合单层细胞。将细胞暴露于 200 μ 1/孔的处理溶液中约lOmin，所述处理溶液包括(i)彡200mM的高渗NaCl，(ii)浓度递增的(14 μ M，28 μ M，56 μ M，112 μ M禾口 224 μ M)协同转运干扰剂-布美他尼。和(iii)3y 1 5N NaOH0按如下方法制备含有布美他尼的处理溶液，先制备1.4M的布美他尼贮备液，用 Iml高渗NaCl溶液(按实施例1中描述制备)稀释1 μ 1 1. 4Μ的布美他尼溶液，得到14mM 的布美他尼第二贮备液。用NaCl溶液稀释14mM的布美他尼贮备液得到最终目的浓度的布美他尼，浓度分别约为O μ M(对照)，14 μ MJ8 μ M，56 μ M，112 μ M禾口 224μΜ,Μ 3μ 1 5ΝNaOH调节溶液的pH。按实施例1描述的方法，细胞处理后12_24h用MTT法测定处理细胞的生存能力。 LECs (圆圈)、RPECs (菱形)和CEDCs (正方形)的生存能力如图6所示，每点分别代表6 次HLECs实验或3次HRPECs和CEDCs实验的均值士标准偏差(s. e. m)。如图所示，观μ Μ、 112 μ M和2 μ M的布美他尼时，在相差显微镜下观察到几乎所有的LECs细胞都发生收缩， 脱落或死亡，洗涤后几乎无细胞存留，几乎100%的细胞显示MTT阴性响应。另一方面，在同一浓度下，小于约20%的RPECs和30%的CEDCs被杀死或去除。因此，对这些特定的处理溶液而言，观μ Μ，112 μ M和2 μ M是布美他尼合适的治疗浓度。实施例7按实施例1描述，制备LECs融合的单层细胞，但培养在玻璃盖玻片而不是96孔平底细胞培养板。充分洗涤LECs以去除血清。在深:35mm的培养皿中配制IOml含有彡200mM NaCl、90 μ M呋塞米和3 μ 1 5Ν NaOH 的处理溶液。将盖玻片转移至含有该处理溶液的培养皿中，在处理溶液中保持5到lOmin。然后倾倒出处理溶液，用抽出/灌入探针，以新鲜的HBSS溶液在微压下充分冲洗盖玻片和脱落的LECs。立即用倒置相差显微镜检查和拍照，然后将LECs在新鲜培养基中保持7天，以检查是否有残余细胞生存。图7描述了用倒置相差显微镜拍摄的LECs照片和在处理过程中的渗透反应。照片7A显示，在Omin时，融合的LECs覆盖了整个区域，照片7B显示，处理后5m时，LECs变圆，并与其基质分离。照片7C显示，处理IOmin后和洗涤后，细胞被冲走后基本是清晰的基质。实施例8为在与体内相近的环境下评价该治疗方法的有效性，采用了一种晶状体器官培养 PCO 模型[模型最初由 Liu 等建立(Liu CS, WormstoneIM, Duncan G, Marcantonio JM, Webb SF, Davies, PD. InvestOphthalmol Vis Sci. 1996 Apr ；37 (5) :906-14)]。从捐献人(年龄从19到89岁)的眼睛中分离人晶状体，然后将其粘附到一个定制的不锈钢架上。在手术显微镜下，采用连续环形撕囊术将晶状体的前囊100(直径大约6mm)小心打开，然后用 HBSS (hank’ s缓冲溶液)液压挤出(hydroexpress)晶状体核，并小心去除剩余的晶状体纤维。而后囊200和赤道囊300保留，做为包膜(口袋)保存在塑料培养皿中(深35mm的培养皿)并覆盖补充有10%到15% FCS的^igle氏极限必需培养基(MEM)。器官培养模型中的LECs需要4-5天，以从手术创伤中恢复。建立了两组器官培养PCO模型。第一组建立了 10个晶状体作为对照，保存在器官培养基中，不作处理。这些晶状体在约4至7天后，在前囊100和后囊200发展成单层或多层增殖的LECs。第二组12只晶状体，经过4至5天的培养，也具有增殖的LECs单细胞层，在引入处理溶液前要充分洗涤以去除血清。在35mm的培养皿中配制IOml含(i)彡200mM NaCl, (ii)约90 μ M呋塞米，或约观μ M布美他尼，或约112 μ M布美他尼，和(iii)3y 1 5N NaOH 的处理溶液。如其它实施例中所描述方法配制溶液。然后将器官培养物转移至含有处理溶液的培养皿中，并在该处理溶液中保持5至lOmin。用镊子将器官培养物转移至另一培养皿
18中。用抽出/灌入探针，以新鲜的HBSS溶液在微压下充分冲洗PCO器官培养物中的囊以及脱落的LEC。立即检查，然后将器官培养物保存在培养基中，用新鲜培养基培养7天检查是否有残余细胞存活。用倒置相差显微镜检查该处理方法对PCO器官培养物模型中LECs的效应。在处理后0、5、10min禾Π 12h后用T-Max 400fiIm(Kodak)拍照。如图8所示，处理5至IOmin内， 所有的LECs变圆，并失去与单细胞层和晶状体囊的粘附。相差显微照片8A描述了在低放大倍数(视野为ImmxO. 75mm)下，在解剖6至7天后对前囊100和后囊200进行ECCE假手术后，但在溶液处理前LECs的增殖情况。相差显微照片8B描述了在高放大倍数下(视野为3. 4mmxl. 5mm)，LECs被处理5min后，开始变圆，从晶状体囊脱落。相差显微照片8C描述了在高放大倍数下，LECs被处理IOmin后，绝大多数处理细胞从单细胞层上脱落。相差显微照片8D描述了在低放大倍数下，LECs被处理IOmin后，经过洗涤后晶状体囊无LECs存在。实施例9在本实施例中，评价了该处理方法对原代RPECs的效应。为评价该处理方法是否对其它眼部细胞有任何副作用，在6孔平底培养板中，在Ham' s FlO培养基中(补充以2mM 谷氨酰胺，25mmol/L Hepes,pH 7. 4，10U/mL青霉素，10 μ g/mL链霉素和15%热灭活胎牛血清(FCS))培养原代RPECs，至它们达到90%到100%的融合。培养物保持在培养箱中，箱内通有含5% CO2的潮湿空气，温度为37°C，培养物分析前保持融合状态过夜。在引入处理溶液前充分洗涤RPECs培养物。如前面实施例所描述，在深35mm培养皿中配制20ml含有(i) ^ 200mM NaCl, (ii)约90 μ M呋噻米，或约观μ M布美他尼，或约 112μΜ布美他尼，和( )6μ15Ν NaOH的处理溶液。在6孔培养板中的3孔中，每孔加入 5ml处理溶液到融合的RPECs中。约IOmin后，完全去除溶液，用抽出/灌入探针，以新鲜的 HBSS溶液在微压下充分冲洗处理的RPECs。在快速检查完后，将原代RPECs保存于培养基中，用新鲜的培养基培养7天检验是否有残存的细胞生存。用倒置相差显微镜检验该处理溶液对原代RPECs的作用。处理后0、5、10和1 时用T-Max 400fiIm(Kodak)拍照。RPECs暴露于该处理溶液IOmin并未受到显著影响。图 9描绘了该处理溶液对该细胞作用的典型实例。图9A描绘的是Omin的状况，图9B描绘的是处理后5min时的状况，图9C描绘的时处理后IOmin的状况。图8D描绘的时RPECs被处理后经过洗涤的情况。实施例10为评价该处理方法是否对其它眼部细胞具有任何副作用，按实施例1中所描述制备LECs、CEDCs和RPECs的融合单细胞层。将这些细胞暴露于200 μ 1/孔的处理溶液中约 IOmin,所述溶液包括彡200mM NaCl，90 μ M呋噻米和3 μ 1 5Ν NaOH。根据实施例1描述处理后12_24h用MTT法测定处理细胞的生存能力。图10描绘了处理后LECs、RPECs和CEDCs细胞生存状况，每点代表4次实验的均值士 s. e. m.。如图所示，处理后lOmin，通过测定细胞生存能力，处理溶液诱导LECs较CEDCs和RPECs发生相当大比率的脱落和/或死亡。特别是，超过70%的CEDCs和80%的RPECs在处理后仍得以存活。这可以与小于10%的LECs存活的情况做出比较。实施例11检验该处理方法对器官培养角膜植片(button)的作用以确定该处理方法是否会对近似体内环境中的眼部周围组织造成损害。选择角膜是因为其敏感性和直接暴露于该处理的危险性。用HBSS洗涤角膜器官培养物，上皮细胞侧向上放置在定制的不锈钢架上， 然后将其保存在无菌培养皿中，培养皿中盛有MEM培养基，仅覆盖底部，这提供了潮湿的小室，以防止上皮细胞干燥。角膜内皮的凹面充满补充有10-15% FCS的MEM培养基，在含5% C02，37°C的培养箱中培养。器官培养物分成对照组和处理组。先用HBSS洗涤培养物3次，其内皮面或暴露于生理NaCl溶液(137mM，293 士 9m0sm/L)中，或暴露于处理溶液中，持续lOmin。对处理组，在深35mm的培养皿中制备包含⑴彡200mM NaCl, (ii)约90 μ M呋塞米或约112μΜ布美他尼，和(iii)3yl 5N NaOH的处理溶液。将器官培养物转移至含有该溶液的培养皿中，并保持IOmin以上。然后用镊子将器官培养物转移至另外一个含有新鲜 HBSS的培养皿中，用抽出/灌入探针，以新鲜的HBSS溶液在微压下充分冲洗培养板角膜器官培养物，处理后保存在新鲜培养基中6小时。就对照组而言，以新鲜的HBSS代替上述的处理溶液，处理角膜器官培养物lOmin。为评价该处理方法对角膜内皮细胞的毒性，用倒置相差显微镜和荧光共聚焦显微镜检查角膜器官培养物植片。在共聚焦显微镜下，检验角膜内皮细胞的肌动蛋白丝的形态学，从而为细胞(是否)具有完整结构提供证据。处理前和处理后固定角膜器官培养物的内皮，并用FITC偶联的次毒蕈环肽染色。角膜内皮的共聚焦激光扫描照片证明未处理组(对照组)和处理组无显著性区别。处理组的上皮细胞层与未处理组保持一致的完整性。对照组和处理组中，角膜内皮细胞均保持均勻分布的单细胞层，其细胞保持六边形外观。处理溶液对角膜内皮细胞无明显损害。实施例12检测了含有双氢氯噻嗪(DHCT)( 一种源自噻嗪类和其相关利尿剂的协同转运干扰剂)和高渗NaCl的处理溶液对人LECs的原位效应。该处理是在附着于刚从人白内障手术中摘除的连续环形撕囊-晶状体囊(LECs-CCC)的LEC上进行的。LECs-CCCs来自白内障手术，并立即放入新鲜制备的补充有2mM谷氨酰胺， 25mmol/L Hepes (pH 7. 4)，无胎牛血清(FCS)的Engle氏极限必需培养基(MEM)中，并转移至实验室用于评价。用0.2%台盼蓝染色LECs-CCCs 5min鉴定存活的LECs，用含有超过 70% LECs存活的细胞片层评价处理的效应。处理溶液包括或170或200mM NaCl的蒸馏水溶液和200或300 μ M DHCT0第一步，将58. 44 克 NaCl (Sigma Chemical Co.，U. S 提供)加入到 500ml dH20 中，得到2M的高渗NaCl贮备液。通过用水稀释2M贮备液得到目的浓度的渗透NaCl溶液， 例如，要制备170mM的NaCl高渗溶液，用水按照1 10. 1稀释2M NaCl贮备液。要制备 200mMNaCl高渗溶液，用水按照1 9稀释2M NaCl贮备液。利用冰点渗透压仪通过凝固点降低法测定溶液的最终(重量)摩尔渗透压浓度。第二步，将25mg DHCT加入到Iml dH20中制备DHCT贮备液。最后一步，用170mM或200mM的高渗NaCl溶液稀释DHCT贮备液制备200或300 μ M 的DHCT处理溶液，并调节pH至士 7. 8。将LECs-CCCs暴露在一盛有处理溶液的小培养皿中5min，暴露5min后，用注射器吸去处理溶液，然后在培养皿中加入新鲜的PBS洗去处理溶液。洗涤LECs-CCCs三次。在显微镜下观察LECs的变化，洗涤后0、2和5min进行显微拍照。暴露于处理溶液后，人LECs开始收缩，细胞间逐渐形成大的间隙。收缩的细胞逐渐变圆并破裂。图11显示了包含200 μ M DHCT和彡200mM NaCl高渗处理溶液引起的LECs-CCCs 的变化，A为处理后0min，B为2到:3min，C为洗涤后的变化情况。在图IlA中，表明处理前晶状体细胞堆积紧密，与相邻细胞接触紧凑，类似完整的细胞片层。图IlA中的插图是较大放大倍数的图片。图IlB为处理后2到;3min拍摄的照片，显示收缩的细胞间有较大间隙， 图IlB中的的插图是较大放大倍数的图片。图IlC为冲洗去除处理溶液和脱落细胞后拍摄的照片，除了一些残存的细胞碎片，没有观察倒存活的细胞。图IlC中的插图为高放大倍数的图片。实施例13在两组新西兰大白兔上进行实验，检验如实施例12所描述的处理方法阻止PCO的体内效应。实验组包括16只兔眼，对照组包括4只兔眼。在对照组中进行白内障假手术。 对其它个体进行白内障治疗手术。在1小时内，3次局部应用10%的G去氧肾上腺素(Alcon Labs. ,Inc.，China)和的G环戊通(Bausch & Lomb Pharm. ,Inc.，USA)以对每只兔眼的瞳孔进行手术前散大。
用盐酸氯胺酮(5mg kg-1)和盐酸赛拉嗪Qmg kg-Ι)麻醉兔并放置在手术台上。每5min 用的盐酸地卡因(Dieaine)进行局部麻醉，进行两次。使用金属丝式眼睑张开器以保持眼睑张开。在颞侧缘形成一进入眼睛的3. 2mm巩膜隧道切口。用黏弹性物质保持前室，在晶状体前囊表面制造一直径4-5mm连续环行撕囊，以打开其囊袋。首先通过水分离术引入处理溶液，这确保处理溶液立刻到达整个前囊/LECs。这一过程使得(i)晶状体皮质与囊及晶状体上皮细胞得以分离，使得在手术后期去除晶状体皮质变得容易，(ii)LECs有足够时间暴露于处理溶液中(总共多于5min)。用晶状体乳化器(Universal II，Alcon Labs.，Inc.，China)去除晶状体，尽可能吸出剩余的皮层以暴露LECs。在晶状体囊袋中部分填充黏弹性材料以保持其形状，当应用处理溶液时，黏弹性材料不应覆盖LECs。使处理溶液散布在前囊袋的内表面(LECs附着的地方)，用一具有弯曲的针管的注射器连续充填前囊，注意不要溢出囊袋。当处理溶液充满囊袋后，保持5min即用注射器吸走。在个别情况下，植入了 IOLs。这种情况下，处理溶液布满囊袋整个内表面3到 5min后，用注射器小心吸走处理溶液。同时，将切口扩大到6. Omm，制备一 6. 5mm光学直径 (optic)的后房型眼晶状体(IOLs)(聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA)，并放入到囊袋中。因为这一操作一般需要外科医生约5min完成，LECs应该已经暴露在处理溶液中大约lOmin。然后在微压下充分冲洗囊袋，以清除脱落和死亡的LECs，并去除多余的处理溶液和黏弹性物质。用缝合或非缝合方法使伤口闭合。手术完毕后每只兔眼接受结膜下注射地塞米松(0. 25ml)和庆大霉素(0. 25ml)。 手术后，给兔使用硫酸阿托品眼药水和硫酸新霉素-硫酸多粘菌素-地塞米松眼药膏3 个星期，每天2次。
动物评价3周和10周，据文献报道，在兔中，3周为证明阻止PCO的效果的最佳时间。在1天、1周、2周和3周时，用裂隙灯评价所有兔，并对眼部反应进行评分(见表1)。 手术后3周和10周，肌肉注射2ml盐酸氯胺酮与赛拉嗪O0mg/ml)ll 1混合物麻醉动物， 然后静脉注射2ml戊巴比妥钠杀死动物。摘取眼球(其中部分用福尔马林10%中性缓冲液固定Mh)，从前部到赤道沿冠状面切成两半，肉眼观察评价PCO发展状况。用装备在手术显微镜上(Leica/Wild MZS， Vashaw Scientific, Inc.)的数码相机从后部进行拍照。根据文献报道的方法对PCO的程度和严重性进行评分(见表1)。将晶状体囊固定，在显微镜下评分(Olumpus，Optical Co. Ltd.)，并用数码相机拍照。确定有无细胞，细胞类型和细胞生长的程度。结果表明，处理溶液的处理组在处理后3周和10周时，炎症反应和晶状体囊表面沉淀程度都最小，手术后3或10周内无中央PCO(CPCO)(在瞳孔区域范围内)和外周 PCO(PPCO)(瞳孔外6-6. 5mm大小)发生(见图12C和12D)。多数眼睛的确发生了一定程度的与残留晶状体皮质纤维有关的Soemmering环。图12C为从眼后角度拍摄的整体照片，显示了兔小切口白内障手术(无IOLs植入)3周后的兔眼，瞳孔区是清晰的。图12D为去除虹膜后的整体照片，在6mm中央区外，无 PPCO发生。图12E为图12C中显示的看似无晶状体上皮细胞残留的瞳孔区的相差显微照片。与处理组相对照的是，对照组眼睛发生显著的CPCO和PPC0。图12A是对照组兔眼睛白内障手术3周后(无IOLs植入)的整体照片(用Miyake-Apple技术从眼后拍摄)，在瞳孔区有明显来自PCO的纤维。图12B，表明在显微镜下，对照组眼中，色素上皮细胞和晶状体上皮细胞的混合细胞明显增殖，并覆盖了整个晶状体囊(见图12B)实施例14检验了含有308 μ M布美他尼(一种袢利尿剂类协同转运干扰剂)和170或200mM NaCl高渗水溶液的处理溶液在原位对LECs-CCCs的效应。从白内障手术中摘取LECs-CCCs 后立即应用，处理方法如实施例12。暴露于布美他尼-高渗NaCl处理溶液后，LECs发生收缩，并且细胞间出现间隙。 收缩的细胞并不变圆，而是在晶状体囊上以收缩状态被固定或滞留于其上。LECs并不脱落， 而是滞留于其上，收缩并死亡(见图13)。图13显示了 LECs被该处理方法诱导(A) Omin, (B) 5min和(C)冲洗后(15min)时的细胞变化。图13A显示了处理前为完整的晶状体上皮细胞片层，有一些因白内障手术导致的脱落LECs、红细胞和细胞碎片。插图为该图片放大倍数图片。图1 为处理后5min拍摄，显示了细胞发生收缩，细胞间产生大的间隙，插图为该图片放大倍数图片。图13C为冲洗去除处理溶液和任何脱落细胞15min后拍摄，该图显示如图1 所见相同的细胞收缩的外观，插图为该图片放大倍数图片。处理后细胞发生死亡，这可以通过台盼蓝排斥法评价加以证实。实施例15在两组新西兰大白兔上进行实验，检验如实施例14所描述的处理溶液(布美他尼和高渗NaCl溶液)体内阻止PCO的效能。处理组包括5只兔眼，对照组包括2两只兔眼，两组平行建立并评价。本实验采用和实施例13中相同的手术和评价程序。在接下来的3周内，实验表明，处理组兔眼无CPCO和PPCO发生(用Miyake-Apple 技术从眼后肉眼观察)(见图14)。与原位实验结果(见实施例14)相同，暴露于布美他尼-高渗NaCl溶液后，整个晶状体上皮细胞单层出现滞留，并呈现收缩的外观。这仅见于晶状体前囊(见图14B)。在后囊可见细胞不多。同样，尽管在晶状体前囊有如描述的收缩的LECs单层细胞，但无明显的细胞增殖。图14A是利用Miyake-Apple技术从眼后拍摄的图片，表明白内障手术(无IOLs 插入)3周后，处理组兔眼瞳孔清晰。图14B为处理后，晶状体囊瞳孔的相差显微照片，显示为两层囊，上层囊为附有一层收缩细胞的前囊，下层为无清晰细胞的后囊。插图为高放大倍数的图片，图14B的插图显示具有收缩外观的单层细胞，细胞无明显增殖。实施例16检测了含有200或300 μ M N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)( 一种激活或促进协同 KCl外排的转运干扰剂)的PBS溶液即处理溶液对LECs-CCCs的原位效应。如实施例12进行处理。LECs急性暴露于NEM处理溶液5min后，观察到几乎无变化，但一旦将处理的LECs 放入PBS洗涤液后，细胞发生收缩，细胞间形成大的间隙。如实施例12描述所见，收缩的细胞从LECs囊脱落。图 15 显示了 NEM 诱导 LECs-CCCs 在(A) Omin, (B) 2 至 3min, (C)洗涤后 2min 时的细胞变化。图15A显示了处理前完整晶状体上皮细胞片层，伴有因白内障手术引起的些许损伤，以及脱落LECs和细胞碎片。图15B为处理后2至;3min拍摄，表明细胞轻度收缩。一旦细胞被放回新鲜的PBS洗涤液，细胞明显收缩，细胞间形成明显间隙，这些细胞在实验结束时很容易脱落或被冲洗掉。实施例17在两组新西兰大白兔上进行实验，检验如实施例16所描述的处理溶液(NEM PBS 溶液)阻止PCO的体内效果。处理组包括6只兔眼，对照组包括2两只兔眼，两组平行建立并评价。采用与实施例13中相同的手术和评价程序。处理组兔眼用含有200或300 μ M NEM的PBS或170mM的甘露醇溶液处理，在接下来的3至10周内，处理组兔无CPCO或PPCO发生(眼后肉眼检查)(见表1和图15D)。处理组眼睛瞳孔区清晰。用显微镜检验，在晶状体囊袋无LECs存在(图15E)。但处理组眼睛发生虹膜后粘连并在处理早期出现严重的眼部炎症反应。与处理组眼睛结果形成对照的是，观察到对照组两只兔眼睛的瞳孔区有明显的源自PCO的纤维增生(无IOLs植入)。实施例18为防止严重前室(AC)反应，对应用于眼内的治疗程序进行了改进。在IOLs上涂布处理溶液，并植入到去除晶状体内容物的晶状体囊袋中，而不是将处理溶液直接引入到眼睛中，尤其是在IOLs的后部和赤道部涂布含有300 μ M NEM的PBS溶液即处理溶液。在无菌层流操作台干燥过夜，IOLs就可以应用了。这一操作显著降低了 AC反应。实施例19检测了含有10或ΙΟΟμΜ短杆菌肽(一种来自孔形成蛋白和肽(PFPs)类的物质)和PBS的处理溶液对人LECs的原位效应。按实施例12中描述应用本处理方法。将LECs-CCCs暴露于短杆菌肽-PBS溶液5min，在显微镜下监测LECs的变化。图 16为处理(A)Omin, (B) ^iin和(C)洗涤后拍摄的显微照片。暴露于处理溶液后，人LECs收缩，并且细胞间逐渐形成大的空隙，收缩的细胞慢慢变圆并破裂。图16A为应用处理溶液前拍摄的，表明晶状体细胞相互间连接紧密，并且类似完整的细胞片层。图16B表明，暴露于处理溶液后aiiin，细胞呈现出收缩外观，细胞间形成清晰的间隙。图16C表明，冲洗去除处理溶液和脱落细胞后，除一些残存的细胞碎片外， 没有存活的细胞。从上述教导来看，对本发明的很多改变和变异是可能的。例如，除上述详细讨论的外，也可采用其它离子转运机制干扰剂，例如如下物质可能也是适合的缬氨霉素、溴、茶碱和其它烷基化黄嘌呤、icosanoids、佛波酯(例如TPA)、保钾利尿剂(例如氨苯蝶啶、螺内酯和坎利酸钾)、花萼海绵诱癌素A、网田软海绵酸(OA)、普萘洛尔和其类似物、血管紧张素 II、酮康唑(CDC)、花生四烯酸、镧、三氟拉嗪、碘昔芬、2-aminisobutyric acid、17-β雌二醇、缓激肽、4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(ΡΙΡ2)、1，4，5_三磷酸肌醇(ΙΡ!3)、前列腺素(PGE2)、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶(S/T-Ppases)、蛋白激酶C (PKC)、蛋白激酶A (PKA)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)、SRC家族酪氨酸激酶(Sras)、 多不饱和脂肪酸、磷脂酶C(PLC)、磷酸酶(PP)、G-蛋白、铷、酮(Cu2勺、硝酸根(NO3-)、钡 (Ba；)、氯(Cl—)、钾(K+)、改变细胞内镁和氢(离子)浓度的物质，降低细胞内钠、氯和钾(离子)浓度的物质。值得重视的是，还有其它离子转运干扰剂。所以，需要理解是，在我们所附的权利要求范围内，除了这里以上描述的以外，本发明仍是可以实践的。我们要求的和希望通过专利证书所保护的内容见权利要求书。
权利要求
1.一种眼部处理溶液，PH为约7到10，包含氢氯噻嗪，其中所述溶液可诱导晶状体上皮细胞较角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞发生相当大比率的脱落，以阻止后囊膜混浊， 并且其中所述晶状体上皮细胞脱落前发生收缩。
2.权利要求1中所述的眼部处理溶液，进一步包含渗透剂。
3.权利要求2中所述的眼部处理溶液，其中的渗透剂包含无机盐。
4.权利要求2中所述的眼部处理溶液，其中的处理溶液具有高渗摩尔渗透压浓度，并且其中溶液中存在的氢氯噻嗪的浓度范围为约60 μ M到约500 μ Μ。
5.一种阻止后囊膜混浊的方法，所述方法包括将包含氢氯噻嗪和渗透胁迫剂的处理溶液应用于人工晶状体；并将所述的人工晶状体放入眼中，其中晶状体上皮细胞较角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞发生相当大比率的脱落以阻止后囊膜混浊。
6.权利要求5中所述的眼部处理溶液，其中溶液中存在的氢氯噻嗪的浓度小于约 1500 μ Μ。
7.权利要求5中所述的眼部处理溶液，其中溶液中存在的氢氯噻嗪的浓度小于约 1000 μ Mo
8.权利要求5中所述的眼部处理溶液，其中溶液中存在的氢氯噻嗪的浓度小于约 500 μ Mo
全文摘要
一种用来阻止后囊膜浑浊的处理溶液，在白内障术前、术中或术后应用于或引入晶状体囊袋中。该处理溶液也可在术前应用于人工晶状体。该处理溶液包含离子转运机制干扰剂，该干扰剂可单独使用或与渗透胁迫剂等其它处理剂联用来建立合适的pH，选择性诱导晶状体上皮细胞脱落和/或死亡，从而阻止后囊膜浑浊。虽然离子转运机制干扰剂能够干扰许多种细胞的细胞机制和细胞离子分布，但是其药物浓度还要进行选择，从而使处理溶液选择性干扰晶状体上皮细胞的细胞机制，而基本不损害其它眼部细胞。该处理溶液选择性诱导晶状体上皮细胞脱落和/或细胞死亡，而对其它眼部细胞和组织无损害，且无需冗长的术前处理。
文档编号A61K31/549GK102258461SQ201110037828
公开日2011年11月30日 申请日期2005年12月19日 优先权日2004年12月17日
发明者张金俊 申请人:张进军