专利名称：一种天然植物提取物的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物提取技术领域，具体为一种天然植物提取物的制备方法及用途。
背景技术：
黄酮类化合物是一类广泛存在于植物界的重要的生物活性物质，现代医学研究表 明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗病毒、抗肿瘤、抑菌、保护心脑血管、 调节免疫等方面的作用，是目前天然活性成分研究的热点，具有很好的开发应用价值。植物多酚类化合物是一类广泛存在于天然植物、水果蔬菜等中的次生代谢产物， 是一类天然的强还原性物质，在抗氧化和自由基清除方面具有比常用抗氧化剂更强的作 用，植物酚酸类还具有多方面的生物活性，尤其在预防心脑血管、抗癌以及抗衰老方面发挥 着十分重要的作用。附生美丁花(Medinilla arboricola)为野牡丹科酸脚杆属植物，属多年生小灌 木，喜高温多湿和半阴环境，不耐寒，分布于热带及亚热带地区，生于低海拔至中海拔地区 林中、荫处、水旁岩石上或攀援于树上。据文献报道，野牡丹科植物不少种类都具有清热解 毒、收敛止血的功效，可治久咳、消化不良、月经过多、外伤出血、跌打肿痛等症。近年来，国 内外的科学研究也发现，野牡丹科酸脚杆属植物中的化学成分为鞣质、黄酮、氨基酸及萜类 等成分。它们在生物活性上具有护肝、降血糖、降血压、抗氧化、抗菌消炎等方面的作用，且 部分已应用于临床。关于附生美丁花总黄酮及总酚酸的制备方法及其用途，经文献检索，尚 未见研究报道。近年来从中草药中提取黄酮及酚酸类化合物的方法多采用超声提取法、回流提取 法及冷浸提取法，这些方法往往具有溶剂用量大、提取时间长、操作麻烦、工作效率较低等 缺点。而分离富集总黄酮及总酚酸类多采用提取液浓缩后用乙酸乙酯及正丁醇反复萃取、 再结合大孔树脂或硅胶柱色谱富集纯化。以上操作存在操作步骤及洗脱步骤多，有机溶剂 用量大，收率低，生产成本较高的缺点，尤其是提取纯化过程中的加热浓缩环节较多，容易 造成有效成分破坏或流失，总黄酮的提取率及转移率不高，且常要用到乙酸乙酯、正丁醇、 氯仿、甲醇等有毒有害溶剂，对环境造成污染，同时提取物中常存在重金属含量超标现象。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种天然植物提取 物的制备方法的技术方案，具体为从附生美丁花中提取制备总黄酮及总酚酸的方法，其制 备工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，提取物收率及 功效成分的含量高。所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤
1)原料处理将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉，过20 40目筛；
2)提取将药材装入渗漉筒中，用溶剂浸泡4 8小时后，用40% 80%的含水乙醇 做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为Ikg则含水乙醇用量为6 16升，按流速为10 20mL · HIirT1的速度收集渗漉液；
3)减压浓缩将渗漉液在水浴温度60V 90°C，真空度0. 090 0. 095 Mpa，待浓缩 液进液流速为200 350 mL · miiT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到每毫升浓 缩液含0. 5 1. 0克原药材的浓缩液；
4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为1 15 20 ；先用H2O洗脱，再依次用10% 80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱， 洗脱流速为10 25 mL ^mirT1,分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20% 60%含 水乙醇各部位的洗脱液，
5)减压浓缩及干燥将合并的洗脱液在50°C 70°C，真空度0.090 0. 095 Mpa，待浓 缩液进液流速为200 350 mL · miiT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩 液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过60 100目分样筛，即得附生美丁花 提取物干粉。所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤2)中浸泡时间为5 7小时，用50% 70%的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为Ikg则含水乙醇用量 为8 12升，流速为12 18 mL · mirT1，优选15 17 mL · mirT1。所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤3)中水浴温度70°C 80°C，真空度 0. 092 Mpa，进液流速为 230 320 mL · mirT1，优选 250 300 mL · mirT1 ；每 毫升浓缩液含0. 6 0.8克原药材；
所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4)中色谱柱的径高比为1 16 18，先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙 醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为12 20 mL ^irT1,优选 15 18 mL · mirT ；合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液。所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4)中先用H2O洗脱，再 依次用15%含水乙醇、25%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、75%含水乙醇进行梯度洗 脱，最后用70%丙酮洗脱，合并25%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脱 液。所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤5)中真空浓缩温 度60°C 65°C，真空度为0. 092 Mpa，进液流速为230 320 mL · mirT1，优选250 300 mL · mirT1。所述的一种天然植物提取物在制备防治抗氧化、抑菌制剂中的应用。上述一种天然植物提取物的制备方法具有下述有益效果
1)本发明首次对附生美丁花采用含水溶剂进行渗漉法提取、真空薄膜闪蒸浓缩，结合 大孔树脂吸附来分离富集黄酮及多酚类活性成分，得到了含有大量总黄酮及总酚酸等活性 成分的附生美丁花提取物。该提取方法具有溶剂用量少、提取效率高，不加热，有利于热敏 性成分不被破坏的特点，该浓缩技术具有浓缩液受热时间极短、浓缩速度快、效率高，操作 简单、使用方便、节能环保等优点。2)采用该方法能最大限度地将功效成分提取富集完全，且除杂完全，得到了含有 大量总黄酮及总酚酸等活性成分的附生美丁花提取物。经测定该提取物干粉的收率达到 18. 7% 35.4%。经紫外法测定，总黄酮的含量达到11. 5% 18. 6%，总酚酸的含量达到21.3 % 32.6%，提高了功效成分的提取率。3)本发明提供的附生美丁花提取物的制备方法，其工艺简单、操作方便、设备投资 少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，其提取物收率及功效成分的含量高。4)通过微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定附生美丁花提取物中重金属的 含量，发现采用该方法制备的附生美丁花提取物中重金属含量很低，完全符合《药用植物及 其制剂进出口绿色行业标准》的标准。5)经初步活性试验表明，附生美丁花提取物具有一定的抗氧化及抑菌活性，同时 还具有一定的降血压、降血糖等辅助作用，可用作食品防腐剂、食品抗氧剂及食品添加剂， 因此具有很好的开发应用前景。
具体实施例方式现结合本发明的实施例，对本发明作进一步说明。实施例1
1)原料处理将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉，过20目筛；
2)提取将药材装入渗漉筒中，用溶剂浸泡5小时后，用60%的含水乙醇做溶剂进行渗 滤提取，若原料重量为Ikg则含水乙醇用量为10升，按流速为12 mL · HiirT1的速度收集渗 漉液；
3)减压浓缩将渗漉液在水浴温度60°C，真空度为0. 095 Mpa,待浓缩液进液流速为 220 mL · HiirT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，每毫升浓缩液含0. 5克原药材；
4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过DiaionHP-20大孔吸附树脂分离富集，色谱柱 的径高比为1 :15。先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60% 含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为20 mL · mirT1，分 别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部 位的洗脱液；
5)减压浓缩及干燥将合并的洗脱液在60°C，真空度0.095 Mpa，待浓缩液进液流速为 300 mL-min-1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液继续真空浓缩、干燥成 粉，然后用研钵研成粉，通过80目分样筛，即得附生美丁花提取物干粉。实施例2
步骤1)中附生美丁花粉碎成粗粉，过40目筛；步骤2)中浸泡时间为6小时，用50% 的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为Ikg则含水乙醇用量为12升，流速为15 mL .mirT1 ；步骤3)中水浴温度70°C，真空度0. 090Mpa，进液流速为200 mL ·π η-1，每毫升 浓缩液含0. 6克原药材；步骤4)中色谱柱的径高比为1 :16，先用H2O洗脱，再依次用10% 含水乙醇、25%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、75%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用 70%丙酮洗脱，合并25%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部位的洗脱液；步骤5) 中真空浓缩温度65°C，真空度为0. 090 Mpa，进液流速为200 mL · mirT1 ；其它同实施例1。实施例3
步骤1)中附生美丁花粉碎成粗粉，过40目筛；步骤2)中浸泡时间为7小时，用70% 的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为Ikg则含水乙醇用量为11升，流速为18 mL IirT1 ；步骤3)中水浴温度80°C，真空度0. 092Mpa，进液流速为250 mL ·π η-1，每毫升浓缩液含0.8克原药材；步骤4)中色谱柱的径高比为1 17，先用H2O洗脱，再依次用10%含 水乙醇、30%含水乙醇、50%含水乙醇、60%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70% 丙酮洗脱，合并30%含水乙醇、50%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脱液；步骤5)中真 空浓缩温度70°C，进液流速为250 mL · HiirT1 ；其它同实施例1。实施例4
步骤3)中浸泡时间为6小时，用65%的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为 Ikg则含水乙醇用量为8升，流速为16 HiLmirT1 ；步骤3)中水浴温度90°C，进液流速为300 mL · min-Ι，每毫升浓缩液含0. 9克原药材；步骤4)中色谱柱的径高比为1 :18 ；步骤5)中 进液流速为300mL · miiT1 ；其它同实施例1。实施例5
步骤2)中进液流速为17mL ^irT1 ；步骤3)中进液流速为350 mL ·π η-1，每毫升浓缩 液含1. 0克原药材；步骤5)中进液流速为280mL · mirT1 ；其它同实施例1。上述步骤中用H2O及10%含水乙醇洗脱是为了除掉水溶性杂质，最后都用70%丙 酮洗脱除掉全部杂质，使大孔吸附树脂再生，可反复使用。以下通过相应的试验对通过本发明制备的提取物进行总黄酮、总酚酸及重金属元 素的含量测定。1)附生美丁花提取物中总黄酮的含量测定
测定条件UV-2102PCS紫外可见分光光度计(上海龙尼柯仪器有限公司)；芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所提供)，芦丁的最大吸收波长510 nm。标准曲线的绘制准确称取干燥恒重的芦丁对照品15. 2 mg,加60%乙醇溶解并 定容置100 mL的量瓶中，摇勻得浓度为0. 152 mg · mL—1的对照品溶液。分别取上述芦丁 标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，用60%乙醇补充至5 mL，各加入 0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇勻，放置5 min后再各加入10%硝酸铝溶液0. 4 mL，摇勻。5 min后再加入4 mL的1 mol · L—1氢氧化钠溶液，混勻，用60%乙醇稀释至刻度。10 min后 于510 nm处测吸光度，试剂为空白参比，以芦丁质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标 准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得芦丁含量与吸光度之间的回归方程A =11. 750 C +0. 367，R2=O. 9987。样品的含量测定精密称定干燥的附生美丁花提取物干粉(实施例1)适量，用60% 乙醇溶解并定容至25 mL的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL容量瓶中，添加 60%乙醇溶液使总量约为5 mL，按照上述绘制标准曲线的方法，依次加入亚硝酸钠溶液、硝 酸铝溶液和氢氧化钠溶液，混勻，用60%乙醇稀释至10 mL刻度。静置15 min后测定吸光 值。重复3次测定，根据回归方程换算出样品中总黄酮的含量，计算出附生美丁花提取物中 总黄酮的平均含量为11. 5% 18.6%。以实施例2-5进行同样的试验，也能达到本发明所述的有益效果。2)附生美丁花提取物中总酚酸的含量测定
测定条件UV-2102PCS紫外可见分光光度计(上海龙尼柯仪器有限公司)；没食子酸对 照品(中国药品生物制品检定所提供)，没食子酸的最大吸收波长765 nm。标准曲线的绘制准确称取干燥恒重的没食子酸对照品16. 61 mg，用蒸馏水溶解 并定容于100 mL量瓶中，制成浓度为0. 1661 mg · mL—1的对照品溶液。分别吸取对照品溶液 0,1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0 mL(相当于含没食子酸分别为 0,0. 1661,0. 3220,0. 4980、 0. 6640,0. 8300,0. 9960 mg)置于10 mL容量瓶中，加蒸馏水补充定容至5 mL，再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，补充5%无水Na2CO3溶液定容至10 mL，放置暗处2 h，于765 nm 处测定吸光度，试剂为空白参比。以没食子酸质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标 绘制标准曲线，用最小二乘法进行线性回归，得没食子酸的回归方程Y=45. 792Χ+0. 32209， R2=O. 9972。样品的含量测定精密称定干燥的附生美丁花提取物干粉(实施例1)适量，用蒸 馏水溶解并定容至25 mL的容量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL容量瓶中，加蒸馏 水补充定容至5 mL，再加入0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，补充5%无水Na2CO3溶液定容 至10 mL，静置15 min后于765 nm处测定吸光值。重复3次测定，根据回归方程换算出样 品中总酚酸的含量，计算出附生美丁花提取物中总酚酸的平均含量为21. 3 % 32. 6%。以实施例2-5进行同样的试验，也能达到本发明所述的有益效果。3)附生美丁花提取物中重金属元素的含量测定
仪器与测定条件采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定附生美丁花提取物中 重金属元素的含量。Xleries型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)；MARS-5型微 波消解仪(美国CEM公司)，附RTP-300 Plus温控；MiIli-Q Academic超纯水处理器(美 国Millipore公司)。硝酸为优级纯，其他试剂均为分析纯。仪器工作参数如下表。ICP-MS工测定条件及工作参数
权利要求
1.一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)原料处理将干燥的附生美丁花粉碎成粗粉，过20 40目筛；2)提取将药材装入渗漉筒中，用溶剂浸泡4 8小时后，用40% 80%的含水乙醇 做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为Ikg则含水乙醇用量为6 16升，按流速为10 20 mL · HiirT1的速度收集渗漉液；3)减压浓缩将渗漉液在水浴温度60V 90°C，真空度0. 090 0. 095 Mpa，待浓缩 液进液流速为200 350 mL · miiT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到每毫升浓 缩液含0. 5 1. 0克原药材的浓缩液；4)大孔树脂纯化将得到的浓缩液通过大孔吸附树脂分离富集，色谱柱的径高比为1 15 20 ；先用H2O洗脱，再依次用10% 80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱， 洗脱流速为10 25 mL ^mirT1,分别收集3倍柱体积的各部位洗脱液，合并20% 60%含 水乙醇各部位的洗脱液；5)减压浓缩及干燥将合并的洗脱液在50°C 70°C，真空度0.090 0. 095 Mpa，待浓 缩液进液流速为200 350 mL · miiT1的条件下进行真空薄膜浓缩，回收乙醇，得到的浓缩 液继续真空浓缩、干燥成粉，然后用研钵研成粉，通过60 100目分样筛，即得附生美丁花 提取物干粉。
2.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤2)中浸泡 时间为5 7小时，用50% 70%的含水乙醇做溶剂进行渗滤提取，若原料重量为Ikg则含 水乙醇用量为8 12升，流速为12 18 mL · mirT1，优选15 17 mL · mirT1。
3.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤3)中水 浴温度70°C 80°C，真空度0. 092 Mpa，进液流速为230 320 mL 'mirT1,优选250 300 mL · mirT1 ；每毫升浓缩液含0. 6 0. 8克原药材。
4.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4)中色谱 柱的径高比为1 16 18，先用H2O洗脱，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙 醇、60%含水乙醇、80%含水乙醇进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，洗脱流速为12 20 mL · mirT1，优选15 18 mL · mirT ；合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部 位的洗脱液。
5.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤4)中先用 H2O洗脱，再依次用15%含水乙醇、25%含水乙醇、45%含水乙醇、55%含水乙醇、75%含水乙醇 进行梯度洗脱，最后用70%丙酮洗脱，合并25%含水乙醇、45%含水乙醇和55%含水乙醇各部 位的洗脱液。
6.如权利要求1所述的一种天然植物提取物的制备方法，其特征在于步骤5)中真空 浓缩温度60°C 65°C，真空度为0. 092 Mpa，进液流速为230 320 mL .mirT1,优选250 300 mL · mirT1。
7.如权利要求1所述的一种天然植物提取物在制备防治抗氧化、抑菌制剂中的应用。
全文摘要
一种天然植物提取物的制备方法及用途，属于植物提取技术领域。包括以下步骤将附生美丁花原料经粉碎过筛后，采用渗漉提取、真空薄膜浓缩、大孔树脂吸附富集等方法制得附生美丁花提取物。所得的的附生美丁花提取物中含有11.5％～18.6％总黄酮，21.3％～32.6％的总酚酸，该提取物具有很强的抑菌及抗氧化作用，同时还具有一定的降血压、降血糖辅助作用，可用作食品防腐剂、食品抗氧剂及食品添加剂，该提取物的制备工艺简单、操作方便、设备投资少、溶剂用量小，无环境污染，生产成本低，其提取物收率及功效成分的含量高。
文档编号A61P9/12GK102106587SQ20111005833
公开日2011年6月29日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者刘剑波, 刘华亮, 吴叶平, 袁珂 申请人:浙江农林大学