专利名称：：一种天然植物提取物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种从青钱柳叶片中分离纯化的植物提取物制备方法及其应用，该植物提取物具有a-葡萄糖苷酶抑制活性，可以用于糖尿病和降血糖药物和食品的开发。技术背景a-葡萄糖苷酶抑制剂是能够影响碳水化合物吸收的物质，主要降糖机制为能抑制小肠刷状缘上各种a-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为麦芽糖进而分解为葡萄糖的速度和蔗糖分解为葡萄糖的速度减慢，其中对葡萄糖苷酶的抑制作用最强。据报道，20世纪70年代中期，国外在降血糖的研究中发现了(x-葡萄糖苷酶抑制剂。研究证实，a-葡萄糖苷酶抑制剂可以防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症，同时可以提高糖耐量，还可预防和治疗肥胖症和高三酰甘油血症，用于治疗因碳水化合物代谢紊乱而引起的疾病。a-葡萄糖苷酶抑制剂的代表药物有阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖。此类降糖药的特点主要是降低餐后血糖而对降低空腹血糖无作用、安全和不增加胰岛素的分泌，且在禁食状态下服用该类药不会降低血糖，主要用于单用磺脲类或双胍类餐后血糖控制不理想的患者，或单独用于较轻的餐后血糖高者。对低体重、营养不良、患消耗性疾病、消化营养不良、肝肾功能损害、缺铁性贫血、对孕妇、哺乳期妇女及18岁以下儿童均不宜应用本药。许多学者在筛选生物提取物中a-葡萄糖苷酶抑制剂方面进行了大量的研究工作。近年来，从中草药中筛选a-葡萄糖苷酶抑制剂的研究获得重视，学者们发现了许多天然的a-葡萄糖苷酶抑制剂，按其结构可大致分为黄酮类、生物碱类、皂苷类。青钱柳系胡桃科青钱柳属植物，在我国南方各省分布广泛，常生长在山地湿润的森林中。其形态为落叶乔木，高可达25米。因其树果翅圆形如钱，色青而柳下垂。青钱柳叶的主要化学成分是糖类、氨基酸、维生素、有机酸、黄酮、三萜、内脂、香豆精、皂甙、e-谷甾醇、咖啡因、青钱柳甙、甜茶树甙，具有强身健体，增强免疫的功能，降血脂、降血糖、降血压，减肥等作用。
发明内容本发明的目的在于提供一种从青钱柳叶片中分离纯化的天然植物提取物的制备方法。通过添加这种天然提取物获得其对酶促反应的影响，发现所述提取物对a-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用。根据这一特性，可将这种天然提取物应用于降血糖产品的开发。目前，临床应用中使用到的a-葡萄糖苷酶抑制剂药物主要有阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等几种，另外从天然植物中筛选获得a-葡萄糖苷酶抑制剂也越来越多，许多天然的a-葡萄糖苷酶抑制剂，按其结构可大致分为黄酮类、生物碱类、皂苷类。本发明涉及的是一种来源于青钱柳叶片的天然植物提取物以及该提取物的a-葡萄糖苷酶活性抑制试验，以提供一种新的(x-葡萄糖苷酶抑制剂的用药方法与途径。本发明还涉及该提取物应用于降血糖药物和功能食品的开发。本发明所述的天然植物提取物的制备方法是将该叶片粉碎成碎末，加入醇进行提取，离心后取上清液，在旋转蒸发仪中蒸发得到提取物干粉。本发明更具体地是取烘干的叶片粉碎，按l:20g/ml加50X乙醇，抽提3小时，离心取上清，同法再抽提两次，合并上清液，在旋转蒸发仪中蒸发得到提取物干粉。本发明还提供该提取物的a-葡萄糖苷酶活性抑制实验及相关数据，具体如下1.在a-葡萄糖苷酶催化pNPG的实验体系中加入不同质量的该植物提取物，a-葡萄糖苷酶催化活性随着提取物质量的提高而降低。并以阿卡波糖对a-葡萄糖苷酶的抑制作为对比实验。2.针对不同浓度的底物pNPG，进行该提取物对a-葡萄糖苷酶进行抑制动力学实验。3.不同植物提取物的量对a-葡萄糖苷酶的活性抑制实验。本发明与现有技术相比，具有制备方法简单，成本低，天然植物来源广，植物提取物的药用价值高，应用范围广，可应用于降血糖药物和功能食品的开发等特点。图1是青钱柳提取物对硝基苯酚标准曲线图。图2a是青钱柳提取物对a-葡萄糖苷酶半抑制量测实验曲线图。图2b是阿卡波糖对a-葡萄糖苷酶半抑制量测实验曲线图。图3是青钱柳提取物对a-葡萄糖苷酶抑制动力学实验曲线图。具体实施方式实施例1:到固体抽提物。更具体的是取烘干的叶片200克，用粉碎机打碎，按l:20g/ml加50X乙醇室温搅拌抽提3小时，8000rpm室温离心15分钟，取上清。同法再抽提两次，合并上清液，在旋转蒸发仪中蒸发得到固体抽提物。实施案2:a-葡萄糖苷酶活性半抑制浓度的测定1.制作对硝基苯酚标准曲线a-葡萄糖苷酶活力的测定以无色的对硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物，经a-葡萄糖苷酶水解a-l，4-葡萄糖苷键后释放出对硝基苯酚(pNP)，在碱性条件下后者是黄色的，最后通过监测400nm下的pNP产生量作为a-l，4-葡萄糖苷酶活性大小的判定标准。按下表分别取不同体积的对硝基苯酚1Ommol/L，用50mmol/L磷酸缓冲液(pH6.8)稀释成一系列浓度。然后在分光光度仪上测定400nm处的光密度，以PNP浓度为横坐标，光密度为纵坐标作曲线，见附图1所示。表一标准曲线做法<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.ci-葡萄糖苷酶活力测定a-葡萄糖苷酶活力的测定以无色的对硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物，经a-葡萄糖苷酶水解a-l，4-葡萄糖苷键后释放出对硝基苯酚(pNP)，最后通过监测400nm下的pNP产生量作为a-l，4-葡萄糖苷酶活性大小的判定标准。试剂(1)缓冲液含lmg/ml牛白蛋白的50mMpH6.8K2HP04-KH2P04;(2)1.50mol/L对硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷(pNPG)溶液90.2mgpNPG溶于200ml0.05mol/L缓冲液(pH6.8)中；酶活力二(AXn)/(VXt)式中V-酶液量(ml);n—酶液稀释倍数；t一反应时间(min)。3.a-葡萄糖苷酶活性半抑制浓度的测定测IC50时，先将不同浓度提取物与酶在37'C保温10分钟，然后加入测活体系，测活方法如上所述。实验结果表明，青钱柳叶片提取物对a-葡萄糖苷酶活性具有明显的抑制作用，见附图2所示，其对a-葡萄糖苷酶活性的半抑制浓度为30.2pg/ml，低于阿卡波糖对a-葡萄糖苷酶活性的半抑制浓度(100.33pg/ml)，可见青钱柳叶片提取物对a-葡萄糖苷酶活性的抑制要强于阿卡波糖。表二提取物与阿卡波糖对a-葡萄糖苷酶活性抑制实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3提取物对a-葡萄糖苷酶的抑制动力学实验将7.5pl0.04mg/mla-葡萄糖苷酶与5pl植物提取物混合37'C保温20分钟后，加入不同浓度反应底物体系中，测定其活性随时间变化情况。其中分别含1.5mmoLpNPG20^1、40(^1、80^1、160^1、320pl、400^1、500^1。总体系600pl，不足量以0.05mol/L磷酸缓冲液补足。结果表明，将该提取物处理过的a-葡萄糖苷酶加入到不同浓度催化底物pNPG中，a-葡萄糖苷酶的活性都明显地被抑制了，见附图3所示。权利要求1、一种天然植物提取物的制备方法，该方法是将青钱柳叶片粉碎成碎末，加入醇进行提取，离心后取上清液，在旋转蒸发仪中蒸发得到提取物干粉。2、根据权利要求1所述的天然植物提取物的制备方法，其特征在于取烘干的青钱柳叶片粉碎，按l:20g/ml加50X乙醇，抽提3小时，离心取上清，同法再抽提两次，合并上清液，在旋转蒸发仪中蒸发得到提取物干粉。全文摘要一种天然植物提取物的制备方法，它是将青钱柳叶片粉碎成碎末，加入醇进行提取，离心后取上清液，在旋转蒸发仪中蒸发得到提取物干粉；本发明更具体地是取烘干的青钱柳叶片粉碎，按1∶20g/ml加50％乙醇，抽提3小时，离心取上清，同法再抽提两次，合并上清液，在旋转蒸发仪中蒸发得到提取物干粉；本发明涉及一种从青钱柳叶片中分离纯化的天然植物提取物及其应用；通过添加这种天然提取物获得其对酶促反应的影响，发现所述提取物对α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用；根据这一特性，可将这种天然提取物应用于降血糖产品的开发。文档编号A61P3/10GK101244118SQ20081006116公开日2008年8月20日申请日期2008年3月13日优先权日2008年3月13日发明者周海梦,孟凡国,胡卫江,邱爱东申请人:浙江清华长三角研究院;嘉兴博泰生物科技发展有限公司