专利名称：一种筛选中药单体的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及筛选中药单体的方法，具体涉及一种应用线粒体指标技术筛选中药单体的方法，尤其是筛选抗肝细胞氧化损伤的中药单体的方法
背景技术：
研究揭示了肝细胞氧化损伤是肝纤维化等疾病的病理基础，在这一过程中细胞内的能量中心，线粒体功能发生改变，并由此介导细胞凋亡进程。已知线粒体是真核细胞的重要细胞器，不仅是动物细胞的能量中心，生成ATP的主要地点，而且在细胞凋亡中还承担着主开关的角色。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH，NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化磷酸化产生ATP。线粒体呼吸链主要由四种复合物构成，其中是复合物 I和复合物III是细胞内活性氧(reactive oxygen species)主要来源。在细胞受到凋亡信号作用下，线粒体作为细胞凋亡的主开关角色，细胞内活性氧自由基(reactive oxygenspecies)ROS的水平上升，线粒体发生膨胀，继线粒体内外膜之间非特异的通透转运孔道开放，造成线粒体膜通透性(mitochondria permeability transition Pore, MPTP)的增力口，使线粒体膜电位(Mitochondrion membrane potential, MMP)降低并且同时伴随ATP水平的下降，由于线粒体外膜破裂，促使位于线粒体膜间隙的细胞色素C(Cytochix)me C)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)、Ca2+以及膜间隙中的其他商户因子被释放至细胞质，它们将形成凋亡复合体激活凋亡蛋白家庭的主要成员天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase),最初被激活的是起始者Caspase9分子,最终激活执行者Caspase3而诱导细胞凋亡。活性氧(reactive oxygen species, R0S)主要来源于线粒体,是在呼吸链氧化磷酸化过程中产生ATP，产生的氧代谢副产物R0S。呼吸链产生的低水平ROS对细胞的生命活动是必须的，比如线粒体到细胞核的信号传导。当细胞受到某种刺激，细胞内活性氧水平会升高，导致线粒体膜的渗透性改变且释放细胞色素c而引起细胞凋亡，因此可以通过活性氧检测技术检测细胞氧化损伤的情况。DCFH-DA是目前最常用、最灵敏的细胞内活生氧检测探针。DCFH-DA能进穿过细胞膜进入细胞，被酯酶水解成DCFH，DCFH本身没有荧光，如果细胞内活性氧水平高，与能DCFH反应生成有荧光的DCF。线粒体活性氧技术能很有效检测出药物对肝细胞凋亡的保护作用。线粒体膜电位(mitochondria membrane potential)正常是线粒体形使功能基本保障，当细胞受到凋亡信号刺激后，细胞内活性氧水平升高，导致线粒体膜结构改变，线粒体膨胀，线粒体膜通透孔开放导致膜间隙内细胞色素C，凋亡诱导因子等释放到细胞质诱导细胞凋亡。因而可以通过线粒体膜电位检测技术来判断细胞是否处于早期凋亡阶段。一般用罗丹明(Rhodamine 123)、Di306、JC-I等阳离子荧光染料检测。线粒体膜电位检测技术能检测细胞是否处于细胞凋亡早期阶段。ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。ATP水平的改变，会影响许多细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死或处于一些毒性状态下，ATP水平会下降，而高葡萄糖刺激等对于一些细胞可以上调细胞内ATP水平。通常ATP水平的下降表明线粒体的功能受损或下降，在细胞凋亡时ATP水平的下降通常和线粒体的膜电位下降同时发生。线粒体ATP检测技术能反应线粒体功能是否受损。细胞色素C存在于线粒体膜间隙，是电子传递链必不可少的组成成分。细胞色素C作为凋亡起始因子，也是线粒体凋亡途径中必不可少的分子。当细胞接受凋亡信号刺激，线粒体膜通透发性改变，细胞色素C从线粒体膜内隙释放到细胞中，与另一个凋亡因子Apaf-I结合,激活Caspase家族,诱导细胞凋亡。 肝细胞的氧化损伤的发生是肝纤维化的早期的病理过程。肝纤维化是肝脏内纤维结缔组织增生导致的慢性疾病，表现为肝脏细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡而导致过度沉积。在肝纤维化的病理过程中，肝星形细胞的激活，是其显著的特征，而肝细胞的氧化损伤和凋亡往往是肝纤维化发生的始动因素，首先是有肝细胞的损伤，继而引发肝星状细胞的激活。有研究表明急性肝损期或肝纤维化的早期肝细胞凋亡可阻抑肝纤维化的发生，但在HSC激活后的纤维化进展期，肝细胞的凋亡作用将引起肝细胞的持续损伤，HSC的大量激活、增生，进而促进使肝纤维化的进一步发展。由于线粒体是细胞内的能量中枢和过氧化损伤的靶点，同时也是介导的细胞内源凋亡途径的关键细胞器。因此通过线粒体技术平台筛选对肝细胞氧化损伤有预防、治疗作用的中药单体，将有助于寻找抗肝纤维化的药物成分。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选中药单体的方法，具体涉及一种应用线粒体指标技术筛选中药单体的方法。诸多中药对肝细胞的氧化损伤具有一定的保护作用，为了筛选中药原料中对肝细胞氧化损伤具有保护作用的单体成分，本发明方法，应用线粒体指标技术，检测筛选中药原料中的抗细胞氧化损伤的单体成分，进一步制成治疗脂肪肝、病毒性肝疾病、肝纤维化等肝疾病的保护药物。本发明涉及的中药原料包括丹参或冬虫夏草等。本发明中，从中药原料丹参中提取的单体包括丹酚酸B(SalB)、原儿茶醛、丹参素钠等；本发明中，从中药原料冬虫夏草中提取出的单体包括虫草多糖、虫草素、虫草酸
坐寸o本发明另一个目的是提供脂肪肝、病毒性肝疾病、肝纤维化等肝疾病保护药物。具体而言，本发明的筛选中药单体的方法，其特征在于，采用细胞增殖检测、线粒体活性氧生成检测、线粒体膜电位检测、线粒体能量物质ATP和线粒体细胞色素C检测方法，筛选中药原料中的抗细胞氧化损伤的单体成分。本发明方法，其包括如下步骤I)过氧化氢处理肝细胞来源的细胞系建立氧化损伤细胞模型；2)用MTT比色法检测中药单体对所述细胞活率的影响；3)用MTT比色法检测中药单体对氧化损伤模型组细胞活率的影响；4)用荧光探针、荧光酶标法和流式细胞法检测中药单体处理后氧化损伤模型细胞内线粒体活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的生成；5)用荧光探针、荧光酶标法和流式细胞法检测中药单体处理后氧化损伤模型细胞线粒体膜电位(mitochondria membrane potential, MMP)的变化；6)用虫荧光素酶法检测中药单体处理后模型细胞线粒体ATP的含量；7)用免疫荧光法和Western blot法分别检测线粒体内外中药单体处理后氧化损伤模型细胞细胞色素C(Cytochrome C)的释放。本发明方法中，肝细胞来源的细胞系采用H7702细胞； 本发明方法中，用MTT比色法检测中药单体对H7702细胞活率的影响；本发明以线粒体功能检测为技术核心，观察丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素钠、虫草多糖、虫草素、虫草酸等中药单体对H2O2引起的H7702细胞氧化损伤后线粒体功能的改变，分别以荧光探针、荧光酶标法和流式细胞法检测了细胞线粒体跨膜电位，结果显示，丹酚酸B、虫草多糖、原儿茶醛作用后，氧化损伤的H7702细胞跨膜电位稳定；虫草素、虫草酸、丹参素钠作用后未显示有明显作用；荧光探针、荧光酶标法检测了细胞线粒体ROS的产生，结果显示，丹酚酸B、虫草多糖、原儿茶醛、丹参素钠能有效清除R0S，而虫草素、虫草酸作用后对ROS的生成没有明显作用；免疫荧光等技术检测显示，丹酚酸B、虫草多糖能减少CytoC从线粒体中漏出到胞质中，而其它单体未显示有这一作用；结果还显示，丹酚酸B、虫草多糖显示能增加线粒体的ATP生成；实验结果证实，本发明采用的线粒体功能检测技术能有效地筛选对肝细胞氧化损伤具有保护作用的中药单体成分。所述的中药单体可用于制备防治和治疗脂肪肝、病毒性肝疾病、肝纤维化等肝疾病的药物。
图I为线粒体技术检测丹酚酸B对H7702细胞的保护作用，其中，A是用MTT比色法检测丹酚酸B对正常细胞活率的影响；B是用MTT比色法检测丹酚酸B对过氧化氢诱导H7702细胞损伤的保护作用；C、D、E检测丹酚酸B对细胞内ROS的影响其中C为荧光显微镜观察荧光探针的强度，D为荧光酶标仪测量结果，E为流式细胞法检测；F、G检测丹酚酸B对线粒体膜电位的影响其中F为用荧光显微镜观察荧光强度，G为荧光酶标仪测量荧光强度；H为检测丹酚酸B对细胞内ATP的影响；I为免疫荧光法检测丹酚酸B对细胞色素C的影响；J为Western blot检测线粒体内外的CytoC比较。图2为线粒体技术检测虫草多糖对H7702细胞的保护作用，其中，A是用MTT比色法检测虫草多糖对细胞活率的影响；B是用MTT比色法检测虫草多糖对过氧化氢诱导H7702细胞损伤的保护作用；C荧光显微镜观察荧光强度，检测虫草多糖对细胞内ROS的影响；D荧光酶标仪测量荧光强度检测ROS ；E用荧光显微镜观察检测虫草多糖对细胞内MMP的影响； F用荧光酶标仪测量MMP的变化；
G用线粒体ATP检测技术检测虫草多糖对细胞内ATP的影响；H免疫荧光法检测虫草多糖对细胞色素C的影响。图3为线粒体技术检测虫草素对H7702细胞的保护作用，其中，A是用MTT比色法检测虫草素对细胞活率的影响；B是用MTT比色法检测虫草素对过氧化氢诱导H7702细胞损伤的保护作用；C荧光显微镜观察荧光强度，检测虫草素对细胞内ROS的影响；D荧光酶标仪测量荧光强度检测ROS ；E用荧光显微镜观察检测虫草素对细胞内MMP的影响；
F用荧光酶标仪测量MMP的变化；G免疫荧光法检测虫草素对细胞色素C的影响。图4为线粒体技术检测虫草酸对H7702细胞的保护作用，其中，A是用MTT比色法检测虫草酸对细胞活率的影响；B是用MTT比色法检测虫草酸对过氧化氢诱导H7702细胞损伤的保护作用；C荧光显微镜观察荧光强度，检测虫草酸对细胞内ROS的影响；D荧光酶标仪测量荧光强度检测ROS ；E用荧光显微镜观察检测细胞内MMP的变化；F用荧光酶标仪测量MMP的变化；G免疫荧光法检测细胞色素C的分布。图5为线粒体技术检测丹参素钠对H7702细胞的保护作用，其中，A是用MTT比色法检测丹参素钠对细胞活率的影响；B是用MTT比色法检测丹参素钠对过氧化氢诱导H7702细胞损伤的保护作用；C荧光显微镜观察荧光强度，检测细胞内ROS的产生；D荧光酶标仪测量荧光强度检测ROS ；E用荧光显微镜观察检测细胞内MMP的变化；F用荧光酶标仪测量MMP的变化；G免疫荧光法检测细胞色素C的分布。图6为线粒体技术检测原儿茶醛对H7702细胞的保护作用，其中，A是用MTT比色法检测原儿茶醛对细胞活率的影响；B是用MTT比色法检测原儿茶醛对过氧化氢诱导H7702细胞损伤的保护作用；C荧光显微镜观察荧光强度，检测细胞内ROS的产生；D荧光酶标仪测量荧光强度检测ROS ；E用荧光显微镜观察检测细胞内MMP的变化；F用荧光酶标仪测量MMP的变化；G免疫荧光法检测细胞色素C的分布。
具体实施例方式实施例I(一 )细胞氧化损伤模型的建立和中药单体作用的分组I.主要试剂
高糖培养基(DMEM)购自invitrogen公司，小牛血清购自上海实生公司。丹酹酸
B、丹参素钠、原儿茶醛、虫草多糖、虫草素、虫草酸等中药单体由上海中医药大学提供。2.实验步骤取对数生长期的H7702细胞，制成单细胞悬液，以5 X IO4个/ml的细胞密度接种于96孔培养板，200iil培养液37°C、5% C02培养箱中培养12h。加入H2O2使其终浓度为400 u M,继续培养2h，建立氧化损伤模型。实验分组对照组，氧化损伤组，药物处理组，氧化损伤+药物处理组。对照组为正常培养H7702细胞；损伤组为经H2O2作用的氧化损伤模型细胞；药物处理组为正常培养细胞加入各中药单体成分的组别正常培养细胞加入药物作用2h ;氧化损伤+药物处理组正常培养细胞加入药物作用2h后，加入H2O2使其终浓度为400 u M并继续培养2h。 各中药单体作用的终浓度根据文献和预实验设计为丹酚酸B 50 U MUOO PM,200 u M ;虫草多糖 300 u M、400 u M、500 u M、600 u M、800 u M, 1000 u M ;丹参素、钠原儿茶醛、虫草酸、虫草素均分别为 i2iiM、4iiM、8iiM、16iiM、32iiM、64iiM、128iiM、200iiM。据 “MTT比色法检测中药单体对H7702细胞活率的影响”的结果，选择对细胞增殖没有影响作用的药物浓度继续其后的实验。(二)MTT比色法检测中药单体对H7702细胞活率的影响I.主要试剂噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide, MTT),购自 amresco公司，二甲基亚砜(DMS0),购自merck公司，高糖培养基(DMEM)购自invitrogen公司。2.实验步骤取对数生长期的H7702细胞，制成单细胞悬液，以5X IO4个/ml的细胞密度接种于96孔培养板，200 u I培养液37°C、5% C02培养箱中培养12h。分为对照组和药物处理组，药物处理各组药物终浓度如上所诉，每组6个复孔；加入药物培养2h，用MTT法检测细胞增殖率，即弃去细胞培养上清，用培养基洗一次，每孔加入20ulMTT(5mg/ml)溶液，放回培养箱内继续培养4h，吸弃上清后，加150 u I DMSO溶解沉淀，振荡IOmin后，酶标仪上检测492nm处测定OD值。(三)MTT比色法检测中药单体对氧化损伤H7702细胞活率的影响I.主要试剂同上述。2 实验步骤取对数生长期的H7702细胞，制成单细胞悬液，以5X IO4个/ml的细胞密度接种于96孔培养板，200 u I培养液37°C、5% C02培养箱中培养12h。分为对照组、氧化损伤组、氧化损伤+药物处理，每组6个复孔；根据“MTT比色法检测中药单体对H7702细胞增殖的影响”的结果，选择对细胞增殖没有影响作用药物作用浓度丹酚酸B50 u MU00 u M、200 u M ；虫草多糖300 u M、400 u M、500 u M、600 u M ;丹参素、钠原儿茶醛别为2 y M、4 y M、8 u M ;虫草素、虫草酸均分别为2iiM、4iiM、8iiM、16iiM。药物作用2h后，损伤组和氧化损伤+药物处理均以H2O2处理2h，MTT法检测细胞活率。(四)荧光探针、荧光酶标法和流式细胞法检测中药单体对ROS的生成的影响主要试剂H2DCFDA (R0S检测试剂)购自invitrogen公司，高糖培养基(DMEM)购自 invitrogen 公司。2.实验步骤2. I荧光探针检测ROS取对数生长期的H7702细胞，以8X IO5个/ml的细胞密度接种于放有圆形玻片的24孔培养板，分组为对照组、氧化损伤组、氧化损伤+药物处理组(药物浓度同“三”)，每组3个复孔，500iil培养液，3 7°C、5% C02培养箱中培养12h后，氧化损伤+药物处理组分别加入各药物继续培养2h后，氧化损伤组、氧化损伤+药物处理组加入H2O2继续培养2h，检测细胞内R0S。将24孔板内培养液弃去，用无血清DMEM洗细胞三次，加入500 U I工作液浓度为IOmM的H2DCFDA, 37°C细胞培养箱内孵育20min。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，于荧光显微镜下进行观察并拍照。2. 2荧光酶标法检测ROS取对数生长期的H7702细胞，以5X IO4个/ml的细胞密度接种于96孔培养板，每组6个复孔，200 u I培养液，37°C>5% C02培养箱中培养12h后，分别加入各药物处理同上，荧光酶标法检测细胞内R0S。即将96孔板内培养液弃去，用无血清DMEM洗细胞两次，加入一定量工作液浓度的H2DCFDA, 37°C细胞培养箱内孵育20min，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。以488nm激发波长，525nm发射波长，于荧光酶标仪检测ROS值。2. 3流式细胞法检测ROS取对数生长期的H7702细胞，以2X IO6个/ml的细胞密度接种于6孔培养板，Iml培养液，37°C、5% C02培养箱中培养12小时后，分组与处理同上，。将6孔板内培养液弃去，用无血清DMEM洗细胞两次，加入一定量工作液浓度的H2DCFDA, 37°C细胞培养箱内孵育20分钟，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次。以488nm激发波长，525nm发射波长，流式细胞仪检测ROS值。(五)荧光酶标法和流式细胞法检测中药单体对MMP的变化的影响I.主要试剂JC-1 (MMP检测试剂)购自碧云天生物公司，高糖培养基(DMEM)购自invitrogen 公司。2.实验步骤2. I荧光探针检测MMP取对数生长期的H7702细胞，以8X IO5个/ml的细胞密度接种于放有圆形玻片的24孔培养板，每组3个复孔，500 ill培养液，37°C、5% C02培养箱中培养12h，加入各药物培养2h，相关组别以400uM H2O2处理2小时，检测细胞内MMP。即将24孔板内培养液弃去，用无血清DMEM洗细胞三次，加入250 ill工作液浓度的JC-I和250 有血培养基，37°C细胞培养箱内孵育20min。用JC-I染色缓冲液洗涤细胞三次，于荧光显微镜下进行观察并拍照。2. 2荧光酶标法检测MMP取对数生长期的H7702细胞，以5X104个/ml的细胞密度接种于96孔培养板，每组6个复孔，200 ill培养液，37°C、5% C02培养箱中培养12小时后，分别加入各药物，继续培养2h后，相关组别以H2O2处理2小时，荧光酶标法检测细胞内MMP。即将96孔板内培养液弃去，用有血清培养基洗细胞两次，加入一定量工作液浓度的JC-1，37°C细胞培养箱内孵育20min，用JC-I染色缓冲液洗涤细胞三次。JC-I单体最大激发波长为514nm，最在发射波长为529nm。JC-I聚合体最大激发波长为585nm,最大发射波长为590nm,于突光酶标仪检测MMP值。(六)虫荧光素酶法检测中药单体对线粒体ATP生成的影响I.主要试剂ATP检测试剂、ATP检测试剂稀释液、ATP标准溶液(0. 5mM)、ATP检测裂解液(ATP检测试剂盒)购自碧云天生物有限公司。2.实验步骤取对数生长期的H7702细胞，以8X105个/ml的细胞密度接种于的24孔培养板，每组4个复孔，500 ill培养液，37 °C、5 % C02培养箱中培养12h后，分组和处理同上，将24孔内培养基弃去，用PBS洗两次，加入50 ill ATP裂解液，离心后得到待测样品。取100 ill ATP检测工作液于检测管内，待3-5min后,加入50 U I待测样品,用发光光度计Iuminometer测定样品的RLU值(根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度)。(七)免疫荧光法和Western blot法检测中药单体对线粒体CytoC释放的影响I.主要试剂:4*%多聚甲醒,0. 1%阜式(Saponin) :0. Ig Saponin 溶于 IOOml 三蒸水,0. 05% Saponin :0. 05g Saponin溶于IOOml三蒸水,I 10山羊血清:1ml山羊血清原液,9ml 0. 05% Saponin, I % BSA :0. Ig BSA 溶于 IOml 0. 05% Saponin, Cytochrome C (CST 公司)，FITC标记抗兔IgG(Sigma)，抗荧光衰减封片剂(北京普利莱公司)；HRP标记的抗鼠的IgG、HRP标记的抗兔的IgG(Santa Cruz公司)，线粒体蛋白提取试剂盒(碧云天公司)。2.实验步骤2. I免疫荧光法检测中CytoC取对数生长期的H7702细胞，以8X IO5个/ml的细胞密度接种于放有圆形玻片的24孔培养板，每组3个复孔，500 u I培养液，37°C>5% C02培养箱中培养12h后，分组和处理同上，检测细胞内CytoC。取出玻片用PBS洗三次，每次5min，用4%多聚甲醛固定lOmin。用PBS洗三次/5min，用0. 1% saponin通透在冰上通透lh，在用I :10山羊血清封闭0. 5h，anti-Cytochrome (I :50) 4°C孵育过夜。PBS 洗 3 次，每次 5min, FITC 标记抗兔 IgG (I :100稀释)lh，PBS洗3次/5min，hochest33258染核20min，用抗荧光衰减剂封片，在荧光显微镜下进行观察并拍照。2. 2ffestern blot法检测线粒体内外的CytoC对数生长期的H7702细胞，胰蛋白酶将细胞消化成单细胞悬浮液并接种于培养皿37°C、5% C02培养箱中培养24h，分别加入50uM，100uM，200uM丹酚酸B继续培养2h，加入400uM H2O2继续培养2h。0. OlM PBS吹打细胞，收集至10ml EP管，离心，PBS洗涤细胞2次。用线粒体蛋白提取试剂盒分别提取细胞质蛋白和线粒体蛋白。经SDS-PAGE电泳后，采用半干转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶(TBS/0. I % Tween 20溶解)封闭2h，与anti-Cytochrome (I :200)在室温下孵育 2h,用 TBS/0. I % Tween 20 洗三遍,每次 5min。再室温孵育二抗2h，TBS/0. 1% Tween 20洗3次，每次5min。用ECL化学发光检测试剂盒检测。检测结果表明(I)MTT比色法检测显示50iiM、100iiM、200iiM丹酚酸B作用2h后对H7702的活率均没有影响(如图IA所示)；图IB显示，与对照组相比，400 ii M H2O2处理细胞2h后，细胞活率明显降低(P<0. 05)，而丹酚酸B能明显抑制这种过氧化氢对细胞的毒性作用，并且这种抑制程度与丹酚酸B浓度大小呈正相关。实验结果用四次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。p < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。图IC显示400iiM H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，细胞内荧光明显增强，而在H2O2损伤之前用200 u M丹酚酸B预处理2小时后，荧光强度显著下降。图ID显示与对照组相比，用50 PM，IOOii M，200 ii M丹酚酸B预处理2小时后，细胞内的荧光强度(RFU)明显下降，显与丹酚酸B的浓度呈正相关。图IE显示在400 u M H2O2处理L-02细胞2小时条件下，细胞内ROS会显著增多，从对照组0.41%上升至22. 96%。而在H2O2损伤之前用(50、100,200 PM)预处理后，ROS 的量从损伤组 22. 96% 降至 Ij 14. 06 %、10. 70 %、3. 28%。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。p < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。
用线粒体膜电位检测虫草素对细胞内MMP的影响，图IF显示400 ii M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，绿色荧光明显增强，红色荧光减弱。而在H2O2损伤之前用丹酚酸B预处理，绿色荧光减弱，红色荧光增强。图IG显示在400 u M H2O2处理L-02细胞2h条件下，JC-I单体与JC-I聚合体比例会显著增多。从对照组0.656上升至0.838。而在H2O2损伤之前用50 u M，100 u M，200 u M丹酚酸B预处理2h后，JC-I单体与JC-I聚合体比例从损伤组 0. 838 降到 0. 75,0. 662,0. 65。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。用线粒体ATP检测技术检测丹酚酸B对细胞内ATP的影响，图IH显示400 ii M过氧化氢处理2h后，细胞内ATP浓度从I. 956 ii M到0. 136 y M，但用50 u M、100 y M、200 y M丹酚酸B预处理H7702细胞2h后，细胞内ATP水平有明显回升，最高达到I. 76 y M，且与剂量多少呈正相关。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。免疫荧光法检测丹酚酸B对细胞色素C的影响，显示用400 ii M H2O2处理H7702细胞2h后,cytochrome C迷散分布于细胞中,但先用丹酹酸B处理后在损伤,cytochromeC释放量减少。Western blot结果显示H2O2处理后线粒体内的CytoC明显减少而胞质中增多，丹酚酸B作用后则可以减少CytoC从线粒体中漏出。(2) MTT比色法检测虫草多糖对H7702细胞的毒性，图2A显示与对照相比，300 u M，400 ii M，500 ii M，600 ii M虫草多糖作用2h后对H7702细胞活率没有影响，而800 y M，1000 u M对细胞有一定抑制作用，图2B显示，与对照组相比，虫草多糖对过氧化氢诱导细胞损伤有一定的保护作用。实验结果用四次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。p < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。用活性氧检测显示，400 M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，细胞内荧光明显增强，而在H2O2损伤之前用400 PM虫草多糖预处理2h后，荧光强度显著下降(图2C)。图2D显示与对照组相比，用400 u M，500 u M，600 u M虫草多糖预处理2h后，细胞内的荧光强度(RFU)明显下降，显与虫草多糖的浓度呈正相关。
实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。p < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。用线粒体膜电位检测E显示400 u M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，绿色荧光明显增强，红色荧光减弱。而在H2O2损伤之前用虫草多糖预处理，绿色荧光减弱，红色荧光增强。图2F显示在400 u M H2O2处理H7702细胞2h条件下，JC-I单体与JC-I聚合体比例会显著增多，与对照组相比。而在H2O2损伤之前用400uM，500uM，600uM虫草多糖预处理2h后，JC-I单体与JC-I聚合体比例有所下降。实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。p < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。检测虫草素对细胞内ATP的影响，图2G显示400iiM过氧化氢处理2h后，细胞内ATP浓度明显下降，但用400 ii M、500 ii M、600 ii M虫草多糖预处理L-02细胞2h后，细胞内ATP水平有所回升，且与虫草多糖剂量多少呈正相关。 实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。p < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。免疫荧光法检测虫草多糖对细胞色素C的影响，图2H显示用400 ii M H2O2处理L-02细胞2h后,cytochrome C迷散分布于细胞中，先用虫草多糖处理后,cytochrome C释放量没有下降。(3)MTT比色法检测虫草素对H7702细胞活率影响，以及对400 U M过氧化氢损伤H7702细胞2h的保护作用，图3A显示，与对照相比，2 y M，4 y M，8 y M，16 y M，32 y M虫草素作用24h后对H7702细胞活率无影响，而64 u M，128 u M，200 u M会降低细胞活率，图3B显示，与对照组相比，不同浓度虫草素对过氧化氢诱导的损伤有一定的保护作用。实验结果用四次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验比较差异。p < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。图3C显示400iiM H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，细胞内荧光明显增强，在H2O2损伤之前用8 ii M，16 ii M，32 ii M虫草素预处理24h后，荧光强度没有变化，图3D显示与对照组相比，用411|1，811|1，1611|1，3211|1虫草素预处理211后，细胞内的荧光强度(RFU)没有明显下降。P > 0. 05不具有统计学差异(所有数据采用SPSS软件进行分析)。因此虫草素对氧化损伤后细胞内ROS的清除没有明显的作用。线粒体膜电位检测，图3E显示400 u M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，绿色荧光明显增强，红色荧光减弱。在H2O2损伤之前用虫草素预处理，绿色荧光没出现减弱。图3F显示在400 u M H2O2处理H7702细胞2h条件下，JC-I单体与JC-I聚合体比例会显著增多，与对照组相比。在H2O2损伤之前用8 ii M，16 ii M，32 ii M虫草素预处理24h后，JC-I单体与JC-I聚合体比例没有变化。P > 0. 05不具有统计学差异(所有数据采用SPSS软件进行分析)。因此虫草素对氧化损伤后线粒体跨膜电位的变化没有明显的作用。免疫荧光法检测虫草素对细胞色素C的影响，图3H显示用400 u M H2O2处理L-02细胞2h后，cytochrome C迷散分布于细胞中，先用8 y M，16 y M，32 y M虫草素处理后，cytochrome C仍呈散迷状分布于细胞中。(4)MTT比色法检测图4A显示各浓度虫草酸对H7702细胞的活率均无影响，图4B显示，与对照组相比，4 ii M，8 ii M，16 ii M，32 ii M虫草酸对过氧化氢诱导的损伤有一定的保护作用。实验结果用四次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。ROS检测技术检测虫草酸对细胞内的ROS影响结果显示，400 U M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，细胞内荧光明显增强，在H2O2损伤之前用8 ii M，16 ii M，32 y M虫草酸预处理24h后，荧光强度没有变化。图3D显示与对照组相比，用4iiM，8iiM，16iiM，32iiM虫草酸预处理2h后，细胞内的荧光强度(RFU)没有明显下降。用线粒体膜电位检测虫草酸对细胞内MMP的影响，图4E显示400 U M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，绿色荧光明显增强，红色荧光减弱。 在H2O2损伤之前用虫草酸预处理，绿色荧光很强，红色荧光很弱，且大量细胞凋亡。图4F显示在400iiM H2O2处理H7702细胞2h条件下，JC-I单体与JC-I聚合体比例会显著增多，与对照组相比。在H2O2损伤之前用8 ii M，16 ii M，32 ii M虫草酸预处理24h后，JC-I单体与JC-I聚合体比例没有变化。免疫荧光法检测虫草酸对细胞色素C的影响，图4H显示用400 U M H2O2处理L_02细胞2h后，cytochrome C迷散分布于细胞中，先用8 y M，16 y M，32 y M虫草酸处理后，cytochrome C仍呈散迷状分布于细胞中。(5) MTT比色法检测丹参素钠对H7702细胞的毒性作用以及对400 U M过氧化氢损伤H7702细胞2h的保护作用，图5么显示，与对照相比，211|1，411|1，811|1，丹参素钠作用24h后对H7702细胞活率没有影响，而16 PM, 32 u M，64 u M, 128 u M，200 u M对细胞活率有抑制作用，图5B显示，与对照组相比，不同浓度丹参素钠对过氧化氢诱导H7702细胞的损伤有一定的保护作用。实验结果用四次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。p < 0. 05认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS软件进行分析。ROS的检测结果显示，400 M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，细胞内荧光明显增强，在H2O2损伤之前用2 ii M, 4 ii M丹参素钠预处理24h后,荧光强度有所下降,但在8 y M丹参素钠预处理后，细胞出现大量凋亡(如图5C所示)，图显示与对照组相比，用2 y M，411|/[,811|/[丹参素钠预处理2411后,细胞内的荧光强度(RFU)有所下降。丹参素钠对细胞内MMP的影响的检测，图5E显示400 u M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，绿色荧光明显增强，红色荧光减弱，在H2O2损伤之前用丹参素钠预处理后，绿色荧光没出现减弱，大量细胞出现凋亡掉落，图5F显示在400 u M H2O2处理H7702细胞2h条件下，JC-I单体与JC-I聚合体比例会显著增多，与对照组相比，在H2O2损伤之前用2 ii M，4uM,8uM丹参素钠预处理24h后，JC-I单体与JC-I聚合体比例没有变化。免疫荧光法检测丹参素钠对细胞色素C的影响，图5H显示用400 ii M H2O2处理L-02细胞2h后，cytochrome C迷散分布于细胞中，先用2 ii M, 4 ii M丹参素钠处理后，cytochrome C释放量有所下降。而8 ii M丹参素钠处理后，cytochrome C仍呈散迷状分布于细胞中。(6) MTT比色法检测原儿茶醛对H7702细胞的毒性作用以及对400 u M过氧化氢损伤H7702细胞2h的保护作用，图6么显示，与对照相比，211|1，411|1，811|1原儿茶醛作用24h后对H7702细胞活率没有影响，而16 PM, 32 uM, 4 u M，128 u M，200 u M细胞活率降低，图6B显示，与对照组相比，不同浓度原儿茶醛对过氧化氢诱导的损伤有没有明显的保护作用。
实验结果用四次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P>0.05。所有数据采用SPSS软件进行分析。用活性氧检测技术检测原儿茶醛对细胞内ROS的影响结果显示，图5C显示400 u MH2O2处理细胞2h后，与对照组相比，细胞内荧光明显增强，在H2O2损伤之前用2 u M，4uM,8uM原儿茶醛预处理24h后，荧光强度有所下降，图显示与对照组相比，用2 u M，411|1，811|1原儿茶醛预处理2411后，细胞内的荧光强度(RFU)有所下降。用线粒体膜电位检测原儿茶醛对细胞内MMP的影响，图6E显示400 u M H2O2处理细胞2h后，与对照组相比，绿色荧光明显增强，红色荧光减弱，在H2O2损伤之前用原儿茶醛预处理，绿色荧光有所减弱，图6F显示在400 u M H2O2处理H7702细胞2h条件下，JC-I单体与JC-I聚合体比例会显著增多，与对照组相比，在H2O2损伤之前用2 ii M，4 ii M，8 ii M原儿茶醛预处理24h后，JC-I单体与JC-I聚合体有一定下降。免疫荧光法检测原儿茶醛对细胞色素C的影响，图6H显示用400 ii M H2O2处理L-02细胞2h后，cytochrome C迷散分布于细胞中，先用2 ii M, 4 ii M丹参素钠处理后， cytochrome C释放量有所下降,而8 ii M原儿茶醒处理后,cytochrome C仍呈散迷状分布于细胞中。
权利要求
1.一种筛选中药单体的方法，其特征在于，其包括采用细胞增殖检测、线粒体活性氧生成检测、线粒体膜电位检测、线粒体能量物质ATP和线粒体细胞色素C检测，筛选中药原料中的抗细胞氧化损伤的中药单体。
2.按权利要求I所述的筛选中药单体的方法，其特征在于，所述的中药原料选自丹参或冬虫夏草。
3.按权利要求I所述的筛选中药单体的方法，其特征在于，所述的抗细胞氧化损伤的中药单体为丹酚酸B、原儿茶醛或丹参素钠；或虫草多糖、虫草素或虫草酸。
4.按权利要求I所述的筛选中药单体的方法，其特征在于，其包括如下步骤 1)过氧化氢处理肝细胞来源的细胞系建立氧化损伤细胞模型； 2)用MTT比色法检测中药单体对细胞活率的影响； 3)用MTT比色法检测中药单体对氧化损伤模型组细胞活率的影响； 4)用荧光探针、荧光酶标法和流式细胞法检测中药单体处理后氧化损伤模型细胞内线粒体活性氧的生成； 5)用荧光探针、荧光酶标法和流式细胞法检测中药单体处理后氧化损伤模型细胞线粒体膜电位的变化； 6)用虫荧光素酶法检测中药单体处理后模型细胞线粒体ATP的含量； 7)用免疫荧光法和Westernblot法分别检测线粒体内外中药单体处理后氧化损伤模型细胞细胞色素C的释放。
5.按权利要求4的方法，其特征在于，所述步骤I)的肝细胞来源的细胞系为H7702细胞。
6.按权利要求4的方法，其特征在于，所述步骤2)中用MTT比色法检测中药单体对H7702细胞活率的影响。
7.按权利要求3所述方法筛选的中药单体在制备抗肝细胞氧化损伤药物中的用途。
8.按权利要求3所述方法筛选的中药单体在制备防、治肝疾病药物中的用途。
9.按权利要求8的用途，其特征在于，所述的肝疾病是脂肪肝、病毒性肝疾病或肝纤维化。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术领域，涉及筛选中药单体的方法，具体涉及一种用线粒体指标技术筛选中药中对肝细胞氧化损伤具有保护作用的单体成分的方法。本发明以线粒体功能检测为技术核心，采用细胞增殖检测、线粒体活性氧生成检测、线粒体膜电位检测、线粒体能量物质ATP检测和线粒体细胞色素C检测等方法，检测、筛选中药单体丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素钠，和虫草多糖、虫草素、虫草酸对H2O2引起的H7702细胞氧化损伤后线粒体功能的改变情况，实验结果证实，本发明方法能有效地筛选对肝细胞氧化损伤具有保护作用的中药单体成分。进一步，本发明提供所述中药单体在制备防、治脂肪肝、病毒性肝疾病、肝纤维化等肝疾病药物中的用途。
文档编号A61P1/16GK102735806SQ20111008860
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者刘云霞, 刘平, 刘成海, 刘雯, 左伋 申请人:上海中医药大学附属曙光医院, 复旦大学