大血藤提取物的应用及其提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药提取及应用领域，特别涉及抑制骨吸收并促进骨形成的大血藤提 取物。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症是危害人类健康的主要疾病之一，寻找切实有效的抗骨质疏松药物已 成为当今医药领域的重大课题。中药以其资源丰富、价格便宜、毒副作用小等诸多优势在防 治骨质疏松症方面具有较大的潜力与优势。随着中药现代化的发展，中药治疗骨质疏松可 望深入到细胞分子水平并从中筛选出高效、稳定、低毒的中药单体或复方组分，充分发挥中 药防治骨质疏松症的优势。
[0003] 破骨细胞负责骨吸收，成骨细胞负责骨形成，当这两种功能细胞作用失衡就会导 致骨质疏松。根据破骨细胞、成骨细胞在骨组织中的作用，研宄药物对其分化成熟及功能的 影响，找到抑制骨吸收、促进骨形成的化合物是开发治疗骨质疏松药物的重要手段之一。
[0004] 大血藤为木通科植物大血藤 Sargeflioi/iara Ctoeaia (Oliv. )Rehd. et Wils.的 干燥藤茎。味苦，性平，归大肠、肝经。具有清热解毒，活血，祛风止痛的作用。用于跌打肿 痛，风湿痹痛等。中药防治骨质疏松症多从补益肝肾、强筋壮骨、益气养血、活血化瘀入手。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供具有抑制骨吸收并促进骨形成作用的大血藤提取物。本发明 提供的大血藤提取物为大血藤醇提物和水煎物。
[0006] 本发明是这样实现的： 大血藤提取物用于抑制骨吸收和促进骨形成的应用。
[0007] 所述的大血藤提取物的提取方法，包括以下步骤：（1)取干燥的大血藤，粉碎备 用；（2)将粉碎的大血藤用乙醇回流提取，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得 醇提物；或将粉碎的大血藤用水煎，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得水煎物。
[0008] 所述的乙醇为60-80%的乙醇溶液。
[0009] 所述的回流提取次数为2-4次，时间为l_4h。
[0010] 所述的水煎次数为2-4次，时间为l-3h。
[0011] 以大血藤为天然药物资源，通过多种溶剂提取法和分离方法，并在提取、分离过程 中紧密结合得到的提取物对骨吸收和骨形成的作用的活性实验，最终得到具有显著抑制骨 吸收和促进骨形成作用的大血藤提取物。
[0012] 本发明的有益效果：大血藤主产中国湖北、四川、江西、河南、江苏等地，资源丰富。 大血藤含有鞣质类、糖苷类、环多酚类、三萜皂苷类、木质素类、黄酮类等多种成分，具有抗 辐射、耐缺氧、抗菌、镇静、抗炎、抗病毒、抗癌等药理作用。中药防治骨质疏松症多从补益肝 肾、强筋壮骨、益气养血、活血化瘀入手，作为一种强壮补血药，大血藤常与其它中药配伍使 用治疗风湿筋骨疼痛、跌打损伤等。目前尚没有明确大血藤中具有抗骨质疏松症的有效成 分及作用机理。
[0013] 抑制骨吸收和促进骨形成是治疗骨质疏松症的有效途径，本发明通过醇提和水 煎，得到抑制骨吸收并促进骨形成的大血藤提取物，提取方法简单，并且作用显著，易于开 发。
【附图说明】
[0014] 图1为实施例3的大血藤提取物对TRAP酶活力的影响，与空白组比，*K0. 05， 01 ; 图2为实施例3的大血藤提取物对TRAP染色阳性细胞数量的影响，与空白组比， 木户〈0. 05, 01 ; 图3为实施例3的各组破骨细胞TRAP染色（100 X ); 图4为实施例3的大血藤提取物对破骨细胞骨吸收陷窝数量积的影响，与空白组比， 05, 01 ; 图5为实施例3的大血藤提取物对破骨细胞骨吸收陷窝面积的影响，与空白组比， 木户〈0. 05, 01 ; 图6为实施例3的各组破骨细胞骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色（100Χ )。
【具体实施方式】
[0015] 1材料及仪器 1. 1材料 大血藤，购自四平市百草堂中药饮片有限公司，批号：20130401。
[0016] I·2 仪器 RE-52AA型旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；LGJ-12型冷冻干燥机，购自北京松 源华兴科技发展有限公司。
[0017] 2醇提物的制备 取大血藤，粉碎，用乙醇回流提取，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得醇提 物。
[0018] 3水煎物的制备 取大血藤，粉碎，用水煎，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得水煎物。
[0019] 优选的，步骤2中所述的乙醇为60-80%的乙醇溶液。
[0020] 优选的，步骤2中所述的回流提取次数为2-4次，时间为l_4h。
[0021] 优选的，步骤3中所述的水煎次数为2-4次，时间为l_3h。
[0022] 本发明的实施例1 :取大血藤100 g，用75%乙醇1000 mL回流提取3次，时间分 别为3 h、2 h、l h，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得到醇提物。取醇提物200 mg溶到ImL DMSO中，制成200 mg · ml/1的储备液，梯度稀释到20 mg · mL 4和2 mg · mL - 备用。
[0023] 本发明的实施例2 :取大血藤100 g，用水1000 mL煎3次，时间分别为2. 5 h、2 h、 I. 5 h，过滤，合并提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后，得到水煎物。取水煎物200 mg溶到ImL DMSO中，制成200 mg · ml/1的储备液，梯度稀释到20 mg · mL -和2 mg · mL -备用。
[0024] 本发明的实施例3 :大血藤提取物对破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。
[0025] (1)骨髓细胞的分离和诱导培养：将出生48 h内的乳兔断颈处死，75%酒精浸泡 消毒，在无菌操作台中剥离后肢股骨和胫骨，置于冷的PBS中，用无菌纱布剥除软组织后， 将骨干置于含a -MEM全培养基（含10%胎牛血清，青霉素100 IU/mL，链霉素100 mg/mL) 无菌培养皿内，然后用灭菌的手术剪刀将骨干纵向剪开，轻刮出骨内的细胞直至骨内表面 变白，剪碎骨干合并含细胞培养基于具塞玻璃管中经漩涡震荡I min左右，过200目细胞 筛后配成所需细胞悬液，按照1~2 X IO6个/孔的密度接种于24孔培养板（0. 5 mL/孔）内， 置于5% C02、37°C、饱和湿度条件下培养。24 h左右用PBS洗掉未贴壁细胞，加入含10_8 mol·!/1的la，25-(0H)2VitD3的培养基进行诱导，并计为第一天，然后每3天更换一次含 10_ 8 mol · L-1的 I a，25-(0H) 2VitD3的全培养基。
[0026] (2)大血藤提取物对骨髓细胞向破骨细胞分化的影响： ① TRAP活力测定：按照上述方法分离培养细胞，24 h左右更换含KT8 mol · Γ1的 la，25_(0H)2VitD3和各剂量药物的全培养基，然后每3天更换一次上述的培养基。分为 空白对照组（DMS0，1 yL.mL-1)、醇提物低剂量组（EL，2 mg.L-1)、醇提物中剂量组（EM，20 mg · Γ1)、醇提物高剂量组（EH，200 mg · Γ1)、水提物低剂量组（WL，2 mg · Γ1)、水提物中剂 量组（丽，20 mg· L-1)、水提物高剂量组（WH，200 mg· L-1)给药，每组设4个复孔，药物干预 到第8天进行TRAP酶活力测定，先用0. 2% TritonX-IOO裂解，然后按照抗酒石酸酸性磷酸 酶（StrACP)测试盒(南京建成）说明书进行，于酶标仪上检测530 nm处吸光值（^)，记录数 据，根据说明书上的计算公式换算成金氏单位（U/L)。
[0027] 结果如图1所示，各组TRAP酶活力值都小于空白组，且与空白组相比，大血藤醇提 物和水提物中剂量组（20 mg · Γ1)具有显著性差异（K0. 05);大血藤醇提物和水提物高剂 量组（200 mg吨―1)组具有极显著性差异（K0. 01)，表明20~200 mg吨―1的大血藤提取物能 显著性抑制破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶活力。
[0028] ②TR