隐孔菌提取物在体内和体外抑制流感病毒的制作方法
【专利摘要】隐孔菌提取物在体内和体外抑制甲型流感病毒，本发明涉及隐孔菌提取物在制备流感病毒抑制剂中的应用，隐孔菌在体外有效的抑制流感病毒A/Beijing/7/2009(BJ09)H1N1感染MDCK细胞；应用小鼠模型研究发现提取物可降低病毒感染后肺组织中病毒滴度，保护小鼠免于流感病毒的致死剂量的感染。
【专利说明】隐孔菌提取物在体内和体外抑制流感病毒
【技术领域】
[0001]本发明涉及隐孔菌提取物在制备流感病毒抑制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]流感病毒是分节段的单负链RNA病毒，属于正粘病毒科，是传染性、急性发热性呼吸道疾病-流行性感冒的病原体。人流感病毒根据其核蛋白的抗原性，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型流感病毒多次引起季节性大流行(1918H1N1，1957H2N2，1968H3N2以及2009H1N1)，在1918~1919年的大流行中，全世界至少有2000万~4000万人死于流感。
[0003]目前已应用于临床的抗流感药物包括流感病毒基质蛋白M2离子通道抑制剂金刚烷胺和金刚烷乙胺及神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和扎那米韦。M2抑制剂通过抑制M2形成的离子通道的活性而阻止病毒基因组向细胞质内的释放，然而目前流行的所有的甲型流感病毒，包括2009年的甲流HlNl以及季节性流感病毒H3N2，均对M2离子通道抑制剂有抗性。神经氨酸酶抑制剂，如奥司他韦，与病毒的神经氨酸酶结合并抑制其活性，从而抑制新组装的病毒颗粒从细胞中释放；但是近年来，奥司他韦抗性的季节性甲型流感病毒(Hl)开始出现，流感病毒的奥司他韦抗性与其神经氨酸酶的单个氨基酸突变(H274Y)有关。2008年，CDC报告称，大多数季节性HlNl分离株对奥司他韦耐受，虽然2009年大流行HlNl多对神经氨酸酶抑制剂敏感，但H274Y突变可能出现在大流行的HlNl病毒株中，并导致奥司他韦耐药，有可能引起一个重大的健康问题，因此有必要开发新的抗流感病毒药物。
[0004]隐孔菌(Cryptoporus volvatus (Peck) Shear)是一种生于松林树干上的野生大型真菌，也有记载生于衰老的冷杉、云杉的树干或枯立木上，该菌为腐生真菌，在野外有较广泛的分布，我国的黑龙江、吉林、福建、浙江、广东、广西、云南、海南岛等省都有生长。在传统中医药中多用于治疗气管炎和哮喘，有舒筋活络，祛风除湿的功效。隐孔菌其野生子实体的药用价值在《滇南本草》、《秦岭巴山天然志》、《新华本草纲要》和《中国药用孢子植物》中都有记载。对于隐孔菌的理化成分进行分析显示其含有多种生理活性物质，比如多糖、多肽、挥发油及隐孔酸等。据报道隐孔菌的提取物具有抗肿瘤、抗炎以及免疫调节功能。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种对抗流感病毒的天然产物来源。
[0006]隐孔菌提取物在体外有效的抑制流感病毒A/Beijing/7/2009 (BJ09) HlNl感染MDCK细胞；应用小鼠模型研究发现提取物可降低病毒感染后肺组织中病毒滴度，保护小鼠免于流感病毒的致死剂量的感染。这些研究结果表明，隐孔菌子实体的提取物有望开发成新的抗流感病毒的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0007] 图1为间接免疫荧光测定隐孔菌水提取物抑制流感病毒HlNl在MDCK细胞内复制的结果。[0008]MDCK细胞感染流感病毒HlNl (Μ0Ι = 0.1)，培养液中含有指定浓度的隐孔菌提取物，24小时后进行间接免疫荧光，检测病毒在细胞内的复制。
[0009]图2为隐孔菌水提取物降低HlNl感染细胞上清中的病毒滴度。
[0010]MDCK细胞感染流感病毒HlNl (Μ0Ι = 0.1)，培养液中含有指定浓度的隐孔菌提取物，24小时后收集上清测定病毒滴度。
[0011]图3为用MTT实验确定隐孔菌水提取物对MDCK细胞的毒性。MDCK细胞与不同浓度的隐孔菌水提取物或生理盐水对照孵育48小时，然后MTT检测细胞存活率。以生理盐水对照中细胞存活率为100%。
[0012]图4为隐孔菌乙醇提取物抑制流感病毒HlNl在MDCK细胞内复制。
[0013]MDCK细胞感染流感病毒HlNl (Μ0Ι = 0.1)，培养液中含有指定浓度的隐孔菌提取物，24小时后进行间接免疫荧光，检测病毒在细胞内的复制。
[0014]图5为隐孔菌乙醇提取物降低HlNl感染细胞上清中的病毒滴度。
[0015]MDCK细胞感染流感病毒HlNl (Μ0Ι = 0.1)，培养液中含有指定浓度的隐孔菌提取物，24小时后收集上清测定病毒滴度。
[0016]图6为用MTT实验确定隐孔菌乙醇提取物对MDCK细胞的毒性。MDCK细胞与不同浓度的隐孔菌乙醇提取物或DMSO对照孵育48小时，然后MTT检测细胞存活率。以DMSO对照中细胞存活率为100%。
[0017]图7为隐孔菌提取物减轻流感病毒HlNl毒株感染小鼠引起的体重降低。
[0018]图8为隐孔菌提取物提高流感病毒HlNl毒株感染小鼠的存活率。
[0019]图9为隐孔菌提取物降低流感病毒HlNl毒株感染小鼠肺脏内的病毒滴度。
【具体实施方式】
[0020]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0021]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0022]下述实施例中的隐孔菌(Cryptoporusvolvatus (Peck) Shear) (KohmeiKADOWAK1.Behavioral observation of two fungivorous beetles (Coleoptera:Tenebrionidae)on wood-decayingbracket fungus Cryptoporus volvatusens_.Entomological Science (2010) 13,159-161)米自中国云南，公众可从野外米集，也可从中国医学科学院药用植物研究所获得，以重复本申请实验。
[0023]下述实施实例中的流感病毒A/Beijing/7/2009 (BJ09)在符合国家生物安全的有关规定的情况下，可从中国医学科药用植物研究所获得，以重复本申请实验。
[0024]实验方法
[0025]1、流感病毒繁殖及病毒滴度测定
[0026]流感病毒A/Beijing/7/2009 (BJ09)于2009年12月分离自疑似流感症状的年轻人，用MDCK细胞繁殖，标准噬斑实验确定其滴度。
[0027]流感病毒空斑实验步骤如下:
[0028]1.准备MDCK六孔板:在其长至90%时铺板，一瓶75cm2MDCK细胞大约可铺3个六孔板，一定要注意摇匀，使细胞平铺且均匀，不会出现空隙。[0029]2.预热:将4%琼脂置于70°C水浴锅融化，完全融化后，置于37°C水浴锅温育。
[0030]3.稀释病毒:将病毒用含有1%双抗的DMEM(不含血清)10倍倍比稀释，稀释倍数视病毒特性自行判断。需注意的是，各个稀释度之间一定要更换枪头，避免由于吹打混匀时枪头上粘带病毒导致稀释不准确。
[0031]4.洗板:用PBS缓冲液洗板，每孔2_3ml，洗两次(注意切勿使细胞干燥)后,用枪头吸净残余液体，每孔加入400-600 μ I病毒液(更换枪头)，轻摇混匀，使病毒液体均匀覆盖。做好标记后置于C02培养箱37°C孵育lh。
[0032]5.准备配置覆盖液:在孵育终止前5-10分钟，在预热的双抗DMEM中加入TPCK-TRYPSIN,混匀，然后将双抗DMEM与琼脂按照3: I比例混合，吹吸混匀，覆盖液中TPCK-TRYPSIN 终浓度为 2-5 μ g/ml。
[0033]6.琼脂覆盖:孵育终止后,将细胞板中病毒液弃掉,每孔加入3ml覆盖液,置于4°C冰箱15-20分钟(放平)使之凝固，之后移入C02培养箱37°C培养，24h后开始观察空斑形成情况(12h观察一次)。
[0034]7.固定及染色:出斑后(一般在48-72小时出)，用I % ο结晶紫染色，首先于每个孔加入1ml福尔马林固定细胞，固定6小时左右，用自来水冲洗细胞孔，将胶甩出，然后于每孔加入300-400 μ I结晶紫溶液放置5分钟，用自来水冲掉残余染液，即可见空斑。
[0035]8.计数并计算病毒PFU:成功出斑后，各个稀释度之间空斑数量若相应成比例，则此结果可用。
[0036]计算方法:挑选出斑数为20-100个的孔进行空斑计数。计算方法:空斑数X病毒稀释倍数+接种体积(ml)。例如:孵育时每孔加入500 μ I病毒液，IO4稀释，孔中空斑个数为40个，则该病毒滴度为40X 104 + 0.5 = 8X 105PFU/ml。
[0037]2、间接免疫荧光
[0038]吸弃细胞培养液，用固定液4°C固定细胞10分钟；PBS洗两次，5%羊血清37°C封闭30分钟；吸弃上清，加抗流感病毒NP蛋白的一抗AA5H (Abeam, Hong Kong)，37°C孵育I小时或4°C孵育过夜；PBS洗3次，每次5分钟；加FITC标记的兔抗鼠二抗，37°C避光I小时；PBS洗3次，.每次5分钟；突光显微镜下观察病毒阳性孔。
[0039]3、隐孔菌提取物的制备
[0040]3.1.水提物制备:用蒸馏水浸泡隐孔菌干子实体，水与隐孔菌干子实体的重量比为6: 1，4°C浸泡2-4小时，匀浆器充分搅碎至60目，4°C浸提10小时，SOOOg离心30分钟，收集上清液，冻干，得到隐孔菌提取物保存于-20°C。用时用生理盐水溶解并用0.22 μ m滤膜过滤。过滤后溶液保存于_80°C备用。
[0041]3.2.醇提物的制备:隐孔菌粉碎,加入6-8倍的95%的乙醇，加热回流lh，过滤，药渣再加95%乙醇6倍热提I小时，滤过，滤液减压浓缩成浸膏，用时用生理盐水溶解并用
0.22 μ m滤膜过滤。过滤后溶液保存于-80°c备用。
[0042]4、MTT
[0043] 将细胞用培养液配成单个细胞悬液，接种到96孔板，37°C、5% CO2环境下培养24小时。用培养液稀释隐孔菌提取物，以等体积的生理盐水做溶剂对照。吸弃细胞培养液，加入含有提取物或生理盐水的培养液，370C ,5% C02环境下培养48小时，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20 μ 1，继续培养4小时，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μ I DMS0，37°C孵育10分钟，使结晶物充分融解。用酶标仪在550nm波长处测吸光度，以对照组细胞存活率为100%，计算实验组细胞存活率:
[0044]实验组细胞存活率=0D(实验组)/0D(对照组)X100%
[0045]5、隐孔菌提取物体外抑制流感病毒HlNl复制
[0046]MDCK细胞在96孔板中长成致密单层后接种流感病毒A/Bei jing/7/2009 (BJ09)(MOI = 0.1)，37°C孵育2小时，然后将细胞培养液换成含有不同浓度隐孔菌提取物及2mg/ml TPCK-treated胰酶，继续培养24小时，收集细胞上清测定病毒滴度，同时固定细胞做间接免疫荧光检测细胞内的病毒。
[0047]6、隐孔菌提取物在小鼠体内抑制流感病毒
[0048]6周龄BALB/c小鼠，分为5个组,每组8只，每次实验前用舒泰(Virbac S.A.,Carros, France ;20μ g/g体重)麻醉。两组通过滴鼻感染103 5pfu BJ09H1N1病毒，然后给予隐孔菌提取物，一组低剂量(16.5 μ g提取物/g体重)，一组高剂量(50 μ g提取物/g体重)，攻毒后连续给予提取物8天，每天2次，灌胃和肌肉注射各一半剂量；一组小鼠只给与高剂量(50 μ g提取物/g体重)的提取物，不攻毒；一组攻毒，但是给予等量的生理盐水；还有一组只给与等量的生理盐水。攻毒后4天，BJ09/生理盐水，BJ09/16.5μ g/g，或者BJ09/50 μ g/g组各取3只安乐处死，取肺检测病毒滴度。每天观察剩余的小鼠的临床症状，一直观察14天。期间小鼠体重下降到原来的75%以下时可判定为死亡并进行安乐死。
[0049]7、分离小鼠肺脏病毒
[0050]将小鼠用Zoletil安乐死，用酒精棉球擦拭腹部进行消毒，用消毒的剪刀、镊子打开胸腔，将整个肺脏取下放入2ml无菌离心管中。向离心管中加入PBS(含青、链霉素各10000单位/ml，pH7.2)，肺脏质量(g):PBS体积(ml)为1: 3，用组织研磨器充分研磨(频率:30次/s，5分钟)。将研磨液离心(8000r/min，8分钟)，上清中即含有肺脏病毒，取上清用于病毒的滴度测定。
[0051]8、数据分析
[0052]所有数据都是独立重复三次得到的平均值，用双尾T-test (成对)分析差异显著性，P ≤ 0.05 被认为差异显著，0.01 < P ≤ 0.05 (*), 0.001 < P ≤ 0.01 (**)。
[0053]实验结果
[0054]MDCK 细胞感染流感病毒 A/Bei jing/7/2009HlNl(BJ09/HlNl)后加入 lmg/ml 或3mg/ml的隐孔菌提取物，感染后24小时间接免疫荧光检测细胞内的病毒(图1)，同时收集细胞培养上清测定病毒滴度(图2)。结果显示隐孔菌提取物能够剂量依赖性的减少病毒对细胞的感染，并且抑制流感病毒的产量。lmg/ml的提取物能使病毒滴度下降为1/7，而3mg/ml的提取物则能使病毒下降为1/30。并且，隐孔菌的乙醇提取物能在25和100 μ g/ml浓度有效的抑制流感病毒HlNl在MDCK细胞中复制(图4，图5)。为了排除隐孔菌提取物对细胞非特异性的毒性对流感病毒复制的影响，我们用MTT实验检测了不同浓度提取物下MDCK细胞的存活率(图3和图6)。50mg/ml的水提取物作用于细胞48小时后，细胞状态与对照相比没有明显差异，当提取物浓度升高到400mg/ml时，细胞存活率下降到了小于10% (图3)。125mg/ml的隐孔菌乙醇提取物对MDCK细胞作用于48小时后，细胞状态与对照相比没有明显差异(图6)。因此，我们确定隐孔菌提取物可以在体外抑制流感病毒复制。
[0055]动物实验结果表明，隐孔菌提取物对正常小鼠无明显的毒副作用。高剂量药物能够显著降低因流感病毒感染导致的小鼠体重损失，并且有利于感染后体重的恢复。低剂量药物也有一定效果，但不如高剂量的突出(图7)。高、低剂量的药物均能减轻小鼠的临床症状，缓解体重损失，降低小鼠的死亡率(图8)。高剂量药物能使小鼠的死亡率降低60%。高、低剂量的药物均能显著降低病毒在小鼠脏器中的复制(图9)。
【权利要求】
1.隐孔菌提取物在制备抑制流感病毒在寄主细胞中复制的产品中的应用，所述隐孔菌提取物是隐孔菌子实体的水提取物或醇提物。
2.隐孔菌提取物在制备抑制流感病毒在寄主中复制的产品中的应用，所述隐孔菌提取物是隐孔菌子实体的水提取物或醇提物。
3.隐孔菌在制备流感病毒抑制剂中的应用。
4.隐孔囷在制备 抑制流感病毒在寄王细胞中复制的广品中的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK103908477SQ201410032743
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】曹丽, 斯建勇, 高丽, 刘金华, 孙怡朋 申请人:中国医学科学院药用植物研究所