专利名称：米氏凯伦藻提取物、制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋微藻一米氏凯伦藻提取物、制备方法及在制备抑制肿瘤血管生成活性药物中的应用。
背景技术：
随着人类社会发展，环境污染加剧，肿瘤尤其是恶性肿瘤一癌症，已经成为人类死亡的第一位或第二位原因，从1996年以来全球每年新确诊的肿瘤病人均在1000万以上，约有700万人死于癌症。目前癌症病人呈总体增加及“年轻化”趋势，同时随着全球老龄化社会的到来以及肿瘤发病率的上升，临床上对疗效好、毒副反应小的抗肿瘤药物的需求量激增。肿瘤不管是良性还是恶性，本质上都表现为细胞的异常增殖，在恶性肿瘤中表现为对邻近正常组织的侵犯及经血管、淋巴管和体腔转移到身体其它部位，即肿瘤转移。肿瘤转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，是临床上绝大多数患者的致死因素。因此肿瘤转移对于癌症治疗是一种严峻挑战。文献1阐述了 Folkman提出的“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管”的概念(文献 L Folkman J. Angiogenesis in psoriasis therapeutic implications. J Invest Dermatol 1972，59 (1) :40.)，并指出可以通过抑制肿瘤血管生成抑制肿瘤的生长和转移。肿瘤的血管生成能力被认为是肿瘤侵袭性的标志，丰富的血管网不仅为肿瘤细胞提供充足的氧气、营养成分和肿瘤生长因子等，而且也是肿瘤转移的通道。文献2阐述了肿瘤血管生成的分子机制(文献1. Patrick A, Sylvie L, Fr'ederic LL, Andreas B. Molecular mechanisms of tumor vascularization. Critical Reviews in Oncology/Hema to logy 2005; 54: 53 - 61.)。血管生成需要血管内皮细胞的迁移、增殖和形成管状结构。肿瘤细胞能够产生大量的生长因子，包括VEGF、FGF、 TGF等。这些生长因子能够通过一系列的信号传导促进血管内皮细胞的迁移、增殖和形成管状结构，最终形成新的血管。可见，血管内皮细胞的迁移、增殖和形成管状结构是形成新生血管的必要条件。米氏凯伦藻属于裸甲藻目，凯伦藻属，为世界广布种，常见于温带和热带浅海水域，是一种典型的鱼毒性赤潮藻。2000年，Hasen将米氏凯伦藻从裸甲藻独立出来，建立 Karenia属，定名为^fermia iii otoi，中文译名为米氏凯伦藻。目前关于它的报道主要集中于产生毒素及所造成的赤潮危害，迄今为止还未见关于从米氏凯伦藻中提取肿瘤血管生成抑制剂的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种氏凯伦藻提取物、 制备方法及在制备抑制肿瘤血管生成活性药物中的应用。本发明的技术解决方案是
一种米氏凯伦藻提取物，其特征在于是用溶剂提取法对米氏凯伦藻进行提取，减压浓缩、冷冻干燥后所得的产物。一种上述米氏凯伦藻提取物的制备方法，其特征在于称取米氏凯伦藻藻粉，放入提取器中，加入体积与藻粉质量比为纩30ml/g的70%乙醇浸泡，加热回流提取，提取温度为达至沸腾温度，提取次数为广3次，每次提取时间为1. (Γ3. Oh ；收集合并冷却后的提取液， 减压浓缩，冷冻干燥得米氏凯伦藻醇提取物。一种上述米氏凯伦藻提取物的制备方法，其特征在于称取米氏凯伦藻藻粉，放入提取器中，加入体积与藻粉质量比为纩30mL/g的纯水浸泡，加热回流提取，提取温度为达至沸腾温度，提取次数为广3次，每次提取时间为1. (Γ3. Oh ；收集合并冷却后的提取液，减压浓缩，冷冻干燥得米氏凯伦藻水提取物。取制备的米氏凯伦藻水提取物，加入体积与米氏凯伦藻水提取物质量比为纩15ml/g的纯水溶解，再向其中加入质量分数为3%的三氯乙酸，再加入体积分数为6(Γ80% 浓度为95%以上的乙醇，收集沉淀得米氏凯伦藻多糖。一种上述米氏凯伦藻提取物在制备抑制肿瘤血管生成活性药物中的应用。本发明是以来源广泛、价格低廉的海洋赤潮微藻一米氏凯伦藻为原料，利用溶剂提取法对其进行提取，并可经三氯乙酸除蛋白，80%乙醇沉淀获得多糖。所得到的米氏凯伦藻提取物及其纯化的多糖经过肿瘤细胞培养液诱导的CV304细胞实验证明，具有显著的抑制其增殖和迁移活性，且无毒副作用、安全性高、成本廉价，可广泛应用于制备抑制肿瘤血管生成的药品、保健食品及食品添加剂中。本发明操作简单，所用溶剂均为普通化学试剂， 易重复，适于大规模生产。
图1是未添加肿瘤细胞培养液的正常ECV304细胞培养Oh迁移情况图。图2是未添加肿瘤细胞培养液的正常ECV304细胞培养24h迁移情况图。图3是添加肿瘤细胞培养液的ECV304细胞培养24h迁移情况图。图4是本发明实施例2终浓度为100 μ g/mL的米氏凯伦藻水提取物对肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞ECV304迁移抑制作用效果图。图5是本发明实施例2终浓度为200 μ g/mL米氏凯伦藻水提取物对肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞ECV304迁移抑制作用效果图。图6是本发明实施例3终浓度为50 μ g/mL米氏凯伦藻多糖对肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞ECV304迁移抑制作用效果图。图7是本发明实施例3终浓度为100 μ g/mL米氏凯伦藻多糖对肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞ECV304迁移抑制作用效果图。
具体实施例方式参照文献(Anti-angiogenic activities of chitooligosaccharides,Haige Wu, Ziang Yao, Xuefang Bai, Yuguang Du, Bingcheng Lin,Carbohydrate Polymers, Volume 73，Issue 1，4 July 2008, Pages 105-110)，人脐静脉内皮细胞的培养条件为在完全培养基RPMI1640培养液中添加10%小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素；37°C，通入(X)2体积含量为5%的空气培养。
用人结肠癌细胞、肝癌细胞、卵巢癌、乳腺癌细胞等培养液作为诱导因子；人结肠癌细胞、肝癌细胞、卵巢癌、乳腺癌细胞的培养条件为在完全培养基RPMI1640培养液中添加10%小牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素；37°C，通入(X)2体积含量为5%的空气培养。实施例1
称取5g米氏凯伦藻藻粉，浸于70%乙醇-水(ν: ν) 100 ml中，采用索氏提取器提取2 次，每次2小时。再经旋转蒸发器进行浓缩，得到醇提取物，冷冻干燥得粉末状物，即米氏凯伦藻醇提取物。实验及结果
取适量实施例1所制备的样品，加蒸馏水，定容，配成浓度为100mg/ml和200mg/ml的溶液备用。将人脐静脉内皮细胞按1-2 X IO6个/mL密度接种于96孔板中，培养l(T24h后加入所配制的实施例1样品溶液，同时用肿瘤细胞培养液为诱导因子，继续培养24h后加入 5mg/ml MTT试剂20 μ L和200 μ L DMSO, 3h后用酶标仪检测药物对细胞增殖的抑制作用。 实验结果表明，实施例1所制备的米氏凯伦藻醇提取物在100和200μ g/ml的浓度范围内可以抑制肿瘤细胞培养液对脐静脉内皮细胞的增殖，抑制率分别为40.洲和38%，见表1。表1米氏凯伦藻醇提物对肿瘤细胞培养液诱导的ECV304生长的影响
权利要求
1.一种米氏凯伦藻提取物，其特征在于是用溶剂提取法对米氏凯伦藻进行提取，减压浓缩、冷冻干燥后所得的产物。
2.一种如权利要求1所述米氏凯伦藻提取物的制备方法，其特征在于称取米氏凯伦藻藻粉，放入提取器中，加入体积与藻粉质量比为纩30ml/g的70%乙醇浸泡，加热回流提取，提取温度为达至沸腾温度，提取次数为广3次，每次提取时间为1. (Γ3. Oh ；收集合并冷却后的提取液，减压浓缩，冷冻干燥得米氏凯伦藻醇提取物。
3.—种如权利要求1所述米氏凯伦藻提取物的制备方法，其特征在于称取米氏凯伦藻藻粉，放入提取器中，加入体积与藻粉质量比为纩30mL/g的纯水浸泡，加热回流提取，提取温度为达至沸腾温度，提取次数为广3次，每次提取时间为1. (Γ3. Oh ；收集合并冷却后的提取液，减压浓缩，冷冻干燥得米氏凯伦藻水提取物。
4.根据权利要求3所述米氏凯伦藻提取物的制备方法，其特征在于取制备的米氏凯伦藻水提取物，加入体积与米氏凯伦藻水提取物质量比为圹15ml/g的纯水溶解，再向其中加入质量分数为3%的三氯乙酸，再加入体积分数为6(Γ80%浓度为95%以上的乙醇，收集沉淀得米氏凯伦藻多糖。
5.一种如权利要求1所述米氏凯伦藻提取物在制备抑制肿瘤血管生成活性药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种米氏凯伦藻提取物、制备方法及用途，是以来源广泛、价格低廉的海洋赤潮微藻—米氏凯伦藻为原料，利用溶剂提取法对其进行提取，并可经三氯乙酸除蛋白，80%乙醇沉淀获得多糖。所得到的米氏凯伦藻提取物及其纯化的多糖经过肿瘤细胞培养液诱导的ECV304细胞实验证明，具有显著的抑制其增殖和迁移活性，且无毒副作用、安全性高、成本廉价，可广泛应用于制备抑制肿瘤血管生成的药品、保健食品及食品添加剂中。本发明操作简单，所用溶剂均为普通化学试剂，易重复，适于大规模生产。
文档编号A61K36/02GK102210721SQ20111014155
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月30日 优先权日2011年5月30日
发明者叶敏慧, 吴迪, 李伟, 李倩, 谭成玉, 赵莹 申请人:大连海洋大学