专利名称：桑色素-7-硫酸酯钠抑制prl-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于一种桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用。
背景技术：
ISHTifflSIBI-3 (phosphatase of regenerating liver-3, PRL-3) 子蛋白酪氨酸磷酸酶，新近发现其与肿瘤转移密切相关。目前PRL-3与肿瘤转移的关系已经十分明确。PRL-3基因最初被发现在人结直肠黏膜上皮细胞和结直肠原发癌细胞中低表达，而在淋巴结、肺和肝等转移灶中持续高表达， 提示PRL-3基因与结直肠癌的转移密切相关，其后众多研究还表明PRL-3高表达与人胃癌、 食管癌、鼻咽癌、SKNAS成神经细胞瘤、乳腺癌和黑色素瘤转移有关，且raL-3高表达的癌症患者预后情况远差于PRL-3低表达患者。另外体内和体外实验也表明高表达PRL-3与肿瘤转移生物学行为相关。同时国内外对PRL-3相互作用蛋白和PRL-3在肿瘤转移中的信号转导途径已进行了较深入的研究。Peng L等通过酵母双杂交系统发现PRL-3能与整合素结合并通过ERK1/2 和MMP-2信号途径促进结肠癌的侵袭转移能力，Ming J等研究报道PRL-3能通过上调ERK 磷酸化水平并激活Mio-A/C活性促进肺癌细胞的血管生成和转移能力；Wang L报道姜黄素能通过抑制Src磷酸化而下调PRL-3的表达，从而抑制黑色素瘤细胞的转移相关能力。因此&叫Q等提出PRL-3在筛选抗肿瘤转移药物方面是一个具有吸引力的分子靶点，其抑制剂研究具有巨大的临床应用价值。韩国学者Ahn JH通过化学合成方法得到多种罗丹宁衍生物，发现2个具有一定抑制作用的PRL-3抑制剂。Moon MK从红藤仔草中分离得到的2-甲基-1，3，6-三羟基-8，9 蒽醌对PRL-3酶也具有较好的抑制作用，IC50为1. 3 μ g/ml。我们对桑色素进行结构改造， 分离得到了水溶性的桑色素-7-硫酸酯钠，对PRL-3酶具有很好的抑制作用，IC5tl值达到 0. 94 μ mol/L,并抑制肿瘤细胞体外侵袭和运动能力。经检索发现，目前暂无桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及抑制肿瘤细胞体外转移相关能力的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用，本发明应用基因工程技术得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，通过PRL-3 酶抑制剂筛选模型，筛选得到一种半合成的桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3酶活性的具有明显的抑制作用，IC50值为0.94 μ mol/L，抑制效果大大强于其母体桑色素，也优于国外研究报道的其它化合物或天然产物，同时Transwell小室法测定结果表明桑色素_7_硫酸酯钠也能抑制肿瘤细胞的体外侵袭和运动能力，Western blot和荧光定量PCR结果显示桑色素-7-硫酸酯钠能特异性抑制PRL-3蛋白和mRNA表达，而不抑制PRL-3同家族成员PRL-I 和PRL-2蛋白和mRNA的表达。为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是通过基因工程技术得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，通过测定PRL-3酶水解底物DiFMUP中磷酸基团生成DiFMU的荧光强度，计算桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3酶活性的抑制作用，并采用半数效量概率单位法计算其IC50值，然后通过Transwell小室法测定桑色素_7_硫酸酯钠抑制肿瘤细胞的体外转移能力，Western blot和荧光定量PCR分析桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3表达的影响，可应用于制备PRL-3酶抑制剂的阳性对照试剂或化合物，以及在药物中，作为其中一个组分或前体用于制备抗肿瘤转移药物。
具体实施例方式实施例11.人PRL-3蛋白的表达、纯化与酶动力学分析根据Genebank公布的NM_03261 编码序列，应用生物学信息软件设计PRL-3特异性上下游引物，以人卵巢癌细胞总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，将回收纯化的PRL-3cDNA片段和pCold II质粒用限制性内切酶 BamHI和HindIII双酶切，将线性化的载体与目的片段按1 3的摩尔比混合，用T4DNA连接酶于16°C连接过夜，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细菌，随机挑选Amp抗性菌落扩增后碱裂解法小量提取质粒，酶切鉴定重组质粒pColdII-His-PRL-3，将鉴定无误的重组质粒pCold II-His-PRL-3转化人ArcticExpress E. coli后，以含Amp的LB培养液、37°C 220rpm振荡培养至0D600值达到约0. 4 0. 5，15°C保存30min，加入终浓度为0. 5mmol/L的IPTG进行诱导，15°C培养Mh，离心收菌，细菌裂解液裂解，取上清液进行 SDS-PAGE电泳和Western Blot以分析目的蛋白，在证实目的蛋白表达后，对上清液进行针对His-tag的M-NTA亲和纯化回收，然后进行酶活性分析，结果表明纯化的PRL-3蛋白具有磷酸酶活性。2.桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3酶活性的影响参照EnzChek Phosphatase Assay Kit(E12020)说明书进行。加入 8ymol/L DiFMUP (缓冲体系20mmol/L Tris-HCl, PH 8. 0,5mmol/L DTT,0. 01% Triton X-100 和 2mmol/LEDTA2Na) 100 μ 1 作为酶反应底物于96孔酶标板中，再加入不同浓度的桑色素-7-硫酸酯钠2 μ 1至终浓度为0. 625，1. 25， 2. 5，5，10和20 μ mol/L,再加入4. 0 μ gPRL-3酶100 μ 1，充分混勻，室温避光反应5min,用 0. 5mo VLNa3VO4抑制剂2 μ 1终止反应。Varioskan Flash扫描式多功能读数仪测定每孔中PRL-3酶水解底物DiFMUP中磷酸基团生成DiFMU的荧光强度(激发波长和发射波长分别为358nm和455nm)。结果显示桑色素_7_硫酸酯钠能明显抑制PRL-3酶活性，IC50值为 0. 94ymol/L。3.桑色素-7-硫酸酯钠对高转移卵巢癌细胞H0-8910PM细胞运动能力的影响 Transwell小室PVPF膜下表面涂纤粘蛋白Fibronectin 5 μ g，上室加含BSA的无血清培养基0. 5ml，下室加入0. 6ml含1 % BSA的RPMI-1640培养基，然后加入1 X IO5个细胞于上室中，再分别加入不同浓度桑色素-7-硫酸酯钠1 μ 1，使其终浓度分别为10、20和 4(^11101/1，对照组加入等量的？85。37°C>5% CO2温箱内孵育6h。^Transwell小室取出， 滤膜用甲醇固定，苏木精染色，水洗，伊红染色，水洗，用PBS浸湿的棉签擦去滤膜内表面的细胞；用封片胶将滤膜封于载玻片上，于400 X显微镜下计数穿过PVPF滤膜的细胞数。每膜计数上下左右中5个随机不同视野，每组平行设3个滤膜。
运动抑制率淨二 (1_给药组穿膜细鮮均数)xl_ J；对照组穿膜细胞平均数结果显示用终浓度10、20和40 μ mol/L的桑色素_7_硫酸酯钠处理H0-8910PM细胞他后，细胞体外运动能力明显降低，其抑制率分别是08.5 士 6.9)%、(37.8 士 8.3)%和 (55. 9 士 7. 0) %。4.桑色素-7-硫酸酯钠对高转移卵巢癌细胞H0-8910PM细胞侵袭能力的影响 Transwell小室PVPF膜上表面涂5 μ g Matrigel，下表面涂纤粘蛋白Fibronectin 5 μ g, 干燥过夜。其余步骤参照运动实验进行。结果显示用终浓度10、20和40 μ mol/L的桑色素-7-硫酸酯钠处理H0-8910PM细胞Mi后，明显抑制H0-8910PM细胞侵袭人工基底膜成分 Matrigel 的能力，其抑制率分别是(19. 0士3. 9)%、(33. 5士8. 1) %和 1 士8. 9)%。5. Western Blot分析桑色素_7_硫酸酯钠对高转移卵巢癌细胞H0-8910PM细胞中 PRL-I，PRL-2和PRL-3蛋白表达影响取对数生长期的H0-89IOPM细胞，稀释成每毫升1 X IO6 个，接种于50mm的培养皿中培养，每皿5mL。待细胞贴壁后，分别以0.、10，20和40μπιο1/ L的桑色素-7-硫酸酯钠处理Η0-8910ΡΜ细胞Mh，收集细胞，PBS洗涤2次，加入预冷的细胞裂解液100 μ L，用细胞刮将细胞刮下，并转移至预冷的1. 5mL离心管中。置于碎冰上冰育 20min后，于4°C、12000Xg离心15min。BCA法测定上清液中蛋白含量。蛋白样品和上样缓冲液按3 1的比例混合，100°C水中煮沸5min使蛋白质变性。SDS-PAGE电泳后电转移至PVPF膜上，5%脱脂牛奶封闭后加入PRL-I或PRL-2或PRL-3于室温孵育池，用TBS缓冲液洗3次，每次lOmin，加入辣根过氧化合物酶标记抗体于室温孵育池，用TBS洗3次，每次 lOmin，加发光试剂显影、曝光。结果显示桑色素-7-硫酸酯钠能抑制PRL-3蛋白表达，而不抑制PRL-3同家族成员PRL-I和PRL-2蛋白表达。6.荧光定量PCR分析桑色素-7-硫酸酯钠对高转移卵巢癌细胞H0-8910PM细胞中PRL-l，PRL-2和PRL-3mRNA表达影响参照荧光定量实时PCR要求，设计引物。用0.、10， 20和40 μ mol/L的桑色素_7_硫酸酯钠处理H0-8910PM细胞Mh，提取H0-8910PM细胞总 RNA，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。按反转录试剂盒操作流程行反转录实验。配实时 PCR反应体系，Rotor-Gene 3000 Realtime PCR仪上进行PCR反应，采用比较阈值法对实时定量RT-PCR结果进行定量分析。结果显示桑色素-7-硫酸酯钠能抑制PRL-3mRNA表达，而不抑制PRL-3同家族成员PRL-I和PRL-2mRNA表达。桑色素-7-硫酸酯钠的性能抑制PRL-3酶活性，抑制肿瘤细胞体外侵袭和运动能力。桑色素-7-硫酸酯钠的用途用于抑制PRL-3酶活性的阳性对照试剂或化合物；用于制备预防肿瘤转移的药物。具体的使用形式1.可制成粉剂，用水或生理盐水溶解；2.可制成注射针剂，按注射针剂要求使用；
3.可制添加糖或甜味剂的饮料，制成口服液产品。用法1.可单一使用制成PRL-3酶抑制剂的阳性对照试剂。2.可作为抗肿瘤转移药物其中一个组分使用。3.可作为前体进行改造用于研发抗肿瘤转移药物。
权利要求
1.一种桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用，其特征是通过基因工程技术得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，通过测定PRL-3酶水解底物 DiFMUP中磷酸基团生成DiFMU的荧光强度，计算桑色素_7_硫酸酯钠对PRL-3酶活性的抑制作用，并采用半数效量概率单位法计算其IC50值，然后通过Transwell小室法测定桑色素-7-硫酸酯钠抑制肿瘤细胞的体外转移能力，Western blot和荧光定量PCR结果显示桑色素-7-硫酸酯钠能特异性抑制PRL-3蛋白和mRNA表达，而不抑制PRL-3同家族成员PRL-I 和PRL-2蛋白和mRNA的表达，可应用于制备PRL-3酶抑制剂的阳性对照试剂或化合物，以及在药物研发中，作为其中一个组分或前体用于制备抗肿瘤转移药物。
2.根据权利要求1所述的桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用，其特征是可制成粉剂；可制成注射针剂；可制添加糖或甜味剂的饮料。
全文摘要
一种桑色素-7-硫酸酯钠抑制PRL-3酶活性及在抗肿瘤转移药物中的应用，用基因工程技术得到具有酶活性的人PRL-3蛋白，筛选得到一种水溶性的桑色素-7-硫酸酯钠对PRL-3酶活性具有明显的抑制作用，抑制效果大大强于其母体桑色素，也优于其它化合物或天然产物，Transwell小室法测定结果表明该化合物能明显抑制肿瘤细胞的体外侵袭和运动能力，Western blot和荧光定量PCR结果显示该化合物能特异性抑制PRL-3蛋白和mRNA表达，而不抑制PRL-3同家族成员PRL-1和PRL-2蛋白和mRNA的表达。本发明提供的该化合物对PRL-3在肿瘤转移中的作用研究以及抗肿瘤转移药物的设计与研发具有很高的应用价值，可应用于制备PRL-3酶抑制剂的阳性对照试剂或化合物，以及在药物开发中作为其中一个组分或前体用于制备抗肿瘤转移药物。
文档编号A61P35/04GK102302482SQ20111018468
公开日2012年1月4日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者何太平, 刘 文, 梁念慈 申请人:广东医学院