专利名称：一种生物蛋白海绵及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医学临床手术后和肌体创伤用生物蛋白海绵及其制造方法；特别涉及一种用于人体和动物体新鲜创面的止血，促进细胞生长增殖能力，以及血管和器官组织修复的生物蛋白海绵及其制备方法。
背景技术：
在医学领域中，创伤修复和临床手术后肌体的生长和再生是一个相关联的病理生理过程，众所周知临床手术后及其他创伤修复中，它包括肌体一系列生化、生理和形态的变化。通常情况从凝血开始到炎症反应、细胞浸润、新血管生成以及细胞外基质产生等不同阶段，各不同阶段都是相互依存的一种有序变化过程，这些不同的修复过程是一个唇齿相依、 密不可分的整体。由于人体组织内的细胞都浸润在细胞间质液中，细胞间质就像一个储藏室，是细胞赖以生存的前提。细胞间质是由细胞产生的不具有细胞形态和结构的物质，它包括纤维、基质和流体物质(组织液、淋巴液、血浆等)，细胞间质对细胞起着支持、保护、连结和营养作用，参与构成细胞生存的微环境(microenvironment)。细胞间质是肌体细胞所生活的液态环境，其细胞间质液中含有细胞在新陈代谢时所需要的全部生存条件；同样的， 细胞间质液也会接受细胞的代谢产物，或未被利用的物质。因此肌体受伤时，常常出现肌体皮肤和器官缺损创面，特别是不可避免破坏了细胞间质，在其细胞不可能恢复的情况下， 在肌体上显现出转移皮瓣和移植皮片坏死、溃烂、感染等等状况的发生，一般临床上为了降低这种现象的发生的几率，通常采用注射抗生素或外部采用外敷中药、西药等抗感染处理方法，但创伤面肌体组织细胞的存活率极低，造成修复周期长，产生皮肤疤痕，肌肉缺损、组织细胞坏死等问题，并相继造成伤口的愈合周期长、肌体内营养成分消耗大、恢复慢等不良情况发生，甚至发生再手术率高等特点。为了缩短伤口愈合时间及减少再手术率这一技术难题，长时间以来，国内外医学界在该领域进行了不断地探索和研究，自八十年代以来有关利用生长因子对肌体创伤和医疗手术后肌体组织修复作用进行了大量地研究和临床应用， 使人们对现代创伤修复的理念发生了根本的改变。抛开了传统的单一的解决伤口的某一方面的问题，一是肌体组织修复的内涵已从单纯的体表愈合发展到细胞组织的修复过程； 二是通过人工干预创面的自然愈合过程可以通过生长因子得到某种程度的“促进”或“恢复”组织细胞成活的效果。生长因子生物活性极不稳定，对生理环境敏感，易被蛋白酶降解，在体内半衰期极短；经长期研究中发现生长因子与胶原蛋白相互依存的生物理论。人体组织内的细胞都浸润在细胞间质液中，细胞和液体之间不断地进行着物质交换，吸取氧分和养料，排出二氧化碳等废物，为了不使创伤面细胞本身被产生的废物所破坏，充分让细胞间质液不断地更新。我们研发了利用新鲜哺乳动物结缔组织或皮的细胞间质较多这一优势，因为动物的结缔组织(connective tissue)或皮是由细胞和大量细胞间质构成的，细胞间质包括基质、细丝状的纤维和不断循环更新的组织液；另外由于制作生物蛋白海绵的原料是以新鲜动物的结缔组织或皮为原料制备的，在临床应用过程中势必存在人畜共患病原微生物交叉感染的可能，为避免这类潜在危险的发生，除加强对原料的筛选和控制外，在制备过程中进行二次病毒灭活的过程，即采用向溶液中加入有机溶剂/去污剂(Solvent/ Detergent)的办法灭活脂包膜病毒，即S/D灭活病毒。通过病毒灭活验证，以伪狂犬病毒 (Pseudorabies virus PRV)，7jC泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus VSV)作为指示病毒，证明S/D灭活病毒的可行性，同时添加蔗糖溶液、甘氨酸为保护剂，具有不使生物蛋白变性和不影响胶原蛋白的回收率等特点；并采用CM阳离子色谱纯化工序，纯化掉多余的聚山梨酯80、磷酸三丁酯，即聚山梨酯80残留量小于lOOug/ml，磷酸三丁酯残留量小于 lOug/ml，残留量符合《中国药典》2010版第三部规定的要求；同时采用加热灭活病毒工艺代替传统的钴60辐射灭菌方法，实现临床应用上安全可靠，这是本行业制备工艺方法的一种新突破，也为未来行业的发展方向奠定了基础；试验中我们还发现传统的透析工序制备周期长，一般在48小时以上，为了更好地保护生物蛋白活性，缩短制备周期，用超滤工艺替代了透析工序，不仅降低了生产成本，缩短制备周期40小时以上，而且极大地提高了生物蛋白的活性；上述本发明的技术方案的形成，这对于利用生化理论应用到临床医疗具有重要的功能性意义。综上所述，在各种理论性的结论日臻成熟的今天，相继出现了多种应用生物敷料， 替代传统的对肌体创伤和皮肤修复的治疗方法。虽然各种生物提取物与生长因子结合物用途相近，但由于制作工艺和制备方法的千差万别，并且生长因子的存活时间不同，所突破的医疗领域和效果大相径庭，具体区别在于使用功能和临床应用效果上。促进伤口愈合和组织再生、使创伤面得以完好修复，一直以来是医学界广泛重视的研究课题。在这种情况之下，我们另辟蹊径经过科学的论证和严谨的科学方法加工提取出与人体和动物体相似的细胞间质，并添加一定比例的生长因子，制作成无菌性生物蛋白海绵。其与创伤面接触时，生长因子可缓释伤口处，而且生物活性得以最大限度的延长，并能充分补充损失的细胞间质、 激活细胞，通过对细胞的黏附作用，可提高细胞的成活率，并诱导细胞分化及细胞上受体的表达，并参与构成细胞生存的微环境。特别对于特殊体质的人群，如疤痕体质、具有严重疾病综合症和内脏手术后的修复等等；尤其现在医学整容领域的发展，对其手术后的皮肤组织修复的完好率要求极高的情况下，其要求皮肤组织恢复和再生能力的程度越来越高。因此，对医疗手术后皮肤组织修复能力的辅助医疗措施的完备，是高科技快速发展和人们对生活水平质量要求越来越高的今天，所亟待解决的问题。根据中国发明专利公开说明书CN1M8339A《促进脊髓组织损伤愈合的海绵材料其制备方法及应用》中披露的成纤维细胞生长因子(FGF)分为酸性和碱性两种，两者的相关性为50%，其活性相差很大，碱性比酸性的活性高100倍以上；两者的组织分布也不尽相同； 另外，碱性成纤维细胞生长因子是一种趋化因子；但碱性成纤维细胞生长因子必须依赖于局部投药载体，否则很难发挥其有效作用。又根据中国发明专利公开说明书CN1511592A《一种含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建方法》中披露一种无抗原性、强度高、柔韧性和耐酶性好、对肌体无毒害、含有表皮生长因子(EGF)的皮肤组织工程支架的构建方法。并根据临床使用表明表皮生长因子具有诱导细胞分裂，加速创伤面修复的特性。公开了通过引入肝素，促使表皮生长因子与胶原形成缓解系统，逐渐释放出表皮生长因子，在创伤愈合前保持表皮生长因子持续作用于创面组织细胞。从上述公开的现有技术中可以明显看出，现在普遍使用制备方法生产的产品，只能单一的运用其中某一性能的特点，虽然也体现生长因子的部分特点，但对最大限度的应用生长因子的生物活性，及在缓释生长因子、激活组织细胞的修复能力上及临床应用过程中的安全性等，都没有实质上的突破和应用；因此在临床应用过程中，存在使用上单一、综合应用受限制等问题。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提供一种根据人体和动物体内细胞和细胞生长环境相适应的特点，利用细胞间质作为生长因子、凝血因子的缓释载体，并通过冷冻干燥技术，使其形成冻干海绵状，以缓释的给药方式作用于肌体创面，创造细胞生长分裂的微环境，细胞在其表面及孔隙间均可以良好生长；通过与组织接触对其新鲜伤口有止血、创造细胞生长分裂的微环境、加速组织修复，使细胞间质与生长因子发生协同生物功效，产生修复神经纤维、促进新毛细血管生成的作用，从而达到促进组织创伤的主动修复和功能恢复，缩短创伤面愈合时间、减少或减轻瘢痕形成和色素沉着等，补充细胞间质、激活细胞组织的修复能力，提高临床手术后伤口愈合质量的生物蛋白海绵。本发明的另一个目的在于提供一种生物蛋白海绵的制备方法，该方法改变了传统的制备过程，采用S/D病毒灭活并添加保护剂，避免人畜共患病毒交叉感染几率；CM阳离子色谱纯化过程，提高生物蛋白纯度，促进生物蛋白海绵止血及组织愈合效果，降低临床副反应；采用超滤工序替代透析工序，缩短了制备周期，保护生物蛋白活性，降低了生产成本； 用加热灭活病毒代替钴60辐射灭菌方法，避免了放射线对产品带来的危害，同时保护了生物蛋白的活性，实现产品在临床应用上安全可靠的一种生物蛋白海绵的制备方法。为了实现上述本发明的目的，本发明一种生物蛋白海绵，它包括细胞间质、生长因子、凝血因子，其特点在于以细胞间质为基质，均勻的添加一定比例的生长因子、凝血因子， 通过冷冻干燥技术制备成海绵状。所述细胞间质由胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖组成。所述胶原蛋白由I型和III型胶原蛋白为主的19种其他型胶原蛋白组成。所述生长因子分为碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经生长因子、结缔组织生长因子、肽类生长因子、转化生长因子、血小板源生长因子。所述凝血因子分为凝血酶因子、纤维蛋白原因子、XIII因子。所述生物蛋白海绵每平方厘米生长因子、凝血因子的含量为30 300IU。本发明生物蛋白海绵制备方法，采用如下工艺流程以新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料脱脂工序——粉碎工序——酶解工序——S/D病毒灭活工序——一次盐析沉淀工序——离心分离工序——二次盐析工序—— CM阳离子交换色谱纯化工序——超滤工序——配制工序一过滤除菌工序一分装工序—— 冻干工序——切割工序——内包装工序——二次灭活病毒工序——检验工序——成品包装工序——入库；包括以下步骤步骤1、选取原料和脱脂处理取新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料，进行脱脂处理；其工艺如下将新鲜哺乳动物的结缔组织或皮放入不锈钢桶中，按原料与10 35%
6碳酸钠溶液1 1 10的比例，浸泡5 60min，定时搅拌；浸泡后捞出，先用水反复冲洗数次，再用纯化水反复冲洗5 10次；浙净水分，用不锈钢刀具刮净原料上的油脂或毛囊等杂质；步骤2、粉碎工序先用切丝机将原料切成条状，然后倒入绞肉机中粉碎，倒入不锈钢桶中，加入75%乙醇溶液浸泡5 60min捞出，用纯化水反复冲洗5 10次，再用注射用水反复冲洗2 5次，浙干；步骤3、酶解工序按Ikg 5-30kg的比例加入注射用水混勻，倒入胶体磨中勻浆；勻浆液转入酶解罐中，缓慢滴加盐酸溶液，调一定PH值；按Ikg原料加入1 IOg胃蛋白酶，酶解温度控制在10°C 35°C之间，搅拌勻浆液PH值为2. 0 4. 0时终止，此时酶解液成粘稠、均勻的胶状流体；步骤4、S/D病毒灭活工序S卩脂胞膜病毒灭活，酶解液与注射用水按1 1 10 的比例进行稀释、混勻，用孔径为40 μ m的滤芯进行粗滤，再用孔径为1. 0 μ m滤芯进行精滤至病毒灭活罐中，加入保护剂，达到终浓度为0. 5 1. 5%，在连续搅拌的状态下，缓慢加入 S/D病毒灭活液，即聚山梨酯80的浓度为1 %，磷酸三丁酯的浓度为0. 3%，搅拌均勻，采用
病毒灭活6h即可；步骤5、盐析离心工序溶液加入1 20倍(W/W)注射用水，混勻，按1 1 5的比例加入饱和氯化钠溶液，搅勻，用连续流离心机10000 17000rpm离心分离沉淀；取沉淀物加入1 20倍(W/W)注射用水，搅勻，使沉淀溶解完全，进行二次盐析，再进行离心分离， 收集沉淀物；其沉淀物与10 25倍注射水溶解，转入CM阳离子色谱纯化工序；步骤6、CM阳离子交换色谱纯化工序将装有CM阳离子交换树脂的色谱柱 (10 X 100CM,华美公司)进行平衡，上样速度为3. 0 6. Oml/min,然后用pH = 4. O、浓度为 0. 3 0. 6mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集细胞间质洗脱液。步骤7、超滤工序将收集的细胞间质洗脱液用优选孔径为IOkD还可使用20kD、 30kD的超滤器超滤(Millipore)，进行浓缩脱盐处理，收集截留液。步骤8、配制工序以截留液的生物蛋白含量与生长因子、凝血因子以一定比例进行配制，PH值为4. 5 7. 5;步骤9、过滤除菌工序将配制好的溶液依次用孔径为0. 45 μ m和0. 22 μ m滤芯 (PALL)过滤，分装；步骤10、冻干工序通过低温冷冻干燥将加有生长因子、凝血因子溶液中的水分去除，采用_20°C -45°C进行冷冻1 釙，抽真空干燥，20°C 40°C恒温1 釙；步骤11、二次灭活病毒工序将冻干后的产品进行加热灭活病毒，温度为60 100°C、时间为 0. 5 144h ；以下工序都在洁净区中进行分装工序、切割工序、内包装工序、检验工序、成品包装工序、入库。所述S/D病毒灭活工序加入蔗糖溶液、甘氨酸作为保护剂。所述二次灭活病毒工序优选温度为60°C、80°C、10(TC ；优选时间为144h、72h、 0. 5h0与现有技术相比，本发明的有益效果是1、本发明的生物蛋白海绵，是一种无菌干性生物蛋白海绵，具有强大的吸收伤口创面渗液能力，具有对创面充分引流的性能，且体积小重量轻，吸收液体后不膨胀等特点， 不会给创面增加负担；2、本发明生物蛋白海绵的成分与人体或动物体的细胞间质相似，生长因子、凝血因子均勻地分布在细胞间质中，以其为基质或载体，可以在一定病理条件下，缓慢释放出来，生长因子、凝血因子的生物活性得以延长；3、本发明具有促使细胞生长增殖能力，以及血管和器官组织修复功能，同时提供给创面营养成分；4、本发明主要成分有I型和III型胶原为主的19种其他型胶原、糖蛋白、蛋白多糖，而胶原是细胞间质的主要成分，且它结合其他间质蛋白起到了物理支架的作用，并对细胞起到黏附作用，可提高细胞的成活率，不断补充病理条件下创面的细胞间质和营养，避免创面的养分流失，保护新生组织细胞和主动修复创面细胞的功能；5、本发明用超滤工序替代透析工序，缩短制备生产周期40h以上，降低生产成本， 而且采用透析工序使生物蛋白的活性降低了，为了更好地保护生物蛋白活性，缩短制备周期，用超滤工序替代了透析工序，避免由于透析工序时间长而引起的生物蛋白变性问题，极大地提高了生物蛋白的存活率；6、本发明采用在二次盐析后CM阳离子色谱纯化工序，使生物蛋白纯度由80 85%提高到95 98%，促进了生物蛋白海绵在临床应用上的止血及肌体组织愈合效果，并降低了临床的的副作用；7、本发明生物蛋白海绵的原料来源为动物的皮或结缔组织，存在人畜共患病毒交叉感染的可能性，在工艺中增加了二步灭活病毒过程。第一步采用加入S/D病毒灭活的方法，并在病毒灭活过程中加入以糖(蔗糖)和氨基酸(甘氨酸、组氨酸)为主的保护剂，克服传统的不进行S/D病毒灭活或病毒灭活中不加保护剂的不足，避免了交叉感染病毒的发生并保护了细胞间质的活性；第二步采用加热灭活病毒代替钴60辐射方法，避免了放射线对产品带来的危害，同时保护了生物蛋白的活性；实现产品在临床应用上安全可靠性；8、本发明所加入的灭活剂在后续盐析、色谱纯化等蛋白纯化过程中被去除，聚山梨酯80的残留量小于lOOug/L，磷酸三丁酯的残留量小于lOug/L，残留量符合《中国药典》 2010版第三部规定的要求，保证了生物蛋白海绵的临床使用要求。
具体实施例方式本发明一种生物蛋白海绵，它包括细胞间质、生长因子、凝血因子，其特点在于以细胞间质为基质，均勻的添加一定比例的生长因子、凝血因子，通过冷冻干燥技术制备成海绵状。所述细胞间质由胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖组成。所述胶原蛋白由I型和III型胶原蛋白为主的19种其他型胶原蛋白组成。所述生长因子分为碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经生长因子、结缔组织生长因子、肽类生长因子、转化生长因子、血小板源生长因子。所述凝血因子分为凝血酶因子、纤维蛋白原因子、XIII因子。所述生物蛋白海绵每平方厘米生长因子、凝血因子的含量为30 300IU。
本发明生物蛋白海绵制备方法，采用如下工艺流程以新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料脱脂工序——粉碎工序——酶解工序——S/D病毒灭活工序——一次盐析沉淀工序——离心分离工序——二次盐析工序—— CM阳离子交换色谱纯化工序——超滤工序——配制工序一过滤除菌工序一分装工序—— 冻干工序——切割工序——内包装工序——二次灭活病毒工序——检验工序——成品包装工序——入库包括以下步骤步骤1、选取原料和脱脂处理取新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料，进行脱脂处理；其工艺如下将新鲜哺乳动物的结缔组织或皮放入不锈钢桶中，按原料与10 35% 碳酸钠溶液1 1 10的比例，浸泡5 60min，定时搅拌；浸泡后捞出，先用水反复冲洗数次，再用纯化水反复冲洗5 10次；浙净水分，用不锈钢刀具刮净原料上的油脂或毛囊等杂质；步骤2、粉碎工序先用切丝机将原料切成条状，然后倒入绞肉机中粉碎，倒入不锈钢桶中，加入75%乙醇溶液浸泡5 60min捞出，用纯化水反复冲洗5 10次，再用注射用水反复冲洗2 5次，浙干；步骤3、酶解工序按Ikg 5-30kg的比例加入注射用水混勻，倒入胶体磨中勻浆；勻浆液转入酶解罐中，缓慢滴加盐酸溶液，调一定PH值；按Ikg原料加入1 IOg胃蛋白酶，酶解温度控制在10°C 35°C之间，搅拌勻浆液PH值为2. 0 4. 0时终止，此时酶解液成粘稠、均勻的胶状流体；步骤4、S/D病毒灭活工序S卩脂胞膜病毒灭活，酶解液与注射用水按1 1 10 的比例进行稀释、混勻，用孔径为40 μ m的滤芯进行粗滤，再用孔径为1. 0 μ m滤芯进行精滤至病毒灭活罐中，加入保护剂，达到终浓度为0. 5 1. 5%，在连续搅拌的状态下，缓慢加入 S/D病毒灭活液，即聚山梨酯80的浓度为1 %，磷酸三丁酯的浓度为0. 3%，搅拌均勻，采用
病毒灭活6h即可；步骤5、盐析离心工序溶液加入1 20倍(W/W)注射用水，混勻，按1 1 5的比例加入饱和氯化钠溶液，搅勻，用连续流离心机10000 17000rpm离心分离沉淀；取沉淀物加入1 20倍(W/W)注射用水，搅勻，使沉淀溶解完全，进行二次盐析，再进行离心分离， 收集沉淀物；其沉淀物与10 25倍注射水溶解，转入CM阳离子色谱纯化工序；步骤6、CM阳离子交换色谱纯化工序将装有CM阳离子交换树脂的色谱柱 (10 X 100CM,华美公司)进行平衡，上样速度为3. 0 6. Oml/min,然后用pH = 4. O、浓度为 0. 3 0. 6mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集细胞间质洗脱液；步骤7、超滤工序将收集的细胞间质洗脱液用优选孔径为IOkD还可使用20kD、 30kD的超滤器超滤(Millipore)，进行浓缩脱盐处理，收集截留液。步骤8、配制工序以截留液的生物蛋白含量与生长因子、凝血因子以一定比例进行配制，PH值为4. 5 7. 5;步骤9、过滤除菌工序将配制好的溶液依次用孔径为0. 45 μ m和0. 22 μ m滤芯 (PALL)过滤，分装；步骤10、冻干工序通过低温冷冻干燥将加有生长因子、凝血因子溶液中的水分去除，采用_20°C -45°C进行冷冻1 釙，抽真空干燥，20°C 40°C恒温1 釙；
步骤11、二次灭活病毒工序将冻干后的产品进行加热灭活病毒，温度为60 100°C、时间为 0. 5 144h ；以下工序都在洁净区中进行分装工序、切割工序、内包装工序、检验工序、成品包装工序、入库。所述S/D病毒灭活工序加入蔗糖溶液、甘氨酸作为保护剂。所述二次灭活病毒工序优选温度为60°C、80°C、10(TC ；优选时间为144h、72h、 0. 5h0下面通过实施例进一步详细描述本发明的制备过程，但不以任何方式限制本发明的保护范围。实施例1步骤1、选取原料和脱脂处理取新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料，进行脱脂处理；其工艺如下将新鲜哺乳动物的结缔组织或皮放入不锈钢桶中，按原料与10%碳酸钠溶液1 1的比例，浸泡5min，定时搅拌；浸泡后捞出，先用水反复冲洗数次，再用纯化水反复冲洗5次；浙净水分，用不锈钢刀具刮净原料上的油脂或毛囊等杂质；步骤2、粉碎工序先用切丝机将原料切成条状，然后倒入绞肉机中粉碎，倒入不锈钢桶中，加入75%乙醇溶液浸泡5min捞出，用纯化水反复冲洗5次，再用注射用水反复冲洗2次，浙干；步骤3、酶解工序按Ikg 5kg的比例加入注射用水混勻，倒入胶体磨中勻浆；勻浆液转入酶解罐中，缓慢滴加盐酸溶液，调一定PH值；按Ikg原料加入Ig胃蛋白酶，酶解温度控制在10°C之间，搅拌勻浆液PH值为2. 0时终止，此时酶解液成粘稠、均勻的胶状流体；步骤4、S/D病毒灭活工序S卩脂胞膜病毒灭活，酶解液与注射用水按1 1的比例进行稀释、混勻，用孔径为40 μ m的滤芯进行粗滤，再用孔径为1. 0 μ m滤芯进行精滤至病毒灭活罐中，加入蔗糖溶液、甘氨酸作为保护剂，达到终浓度为0.5%，在连续搅拌的状态下， 缓慢加入S/D病毒灭活液，即聚山梨酯80的浓度为1%，磷酸三丁酯的浓度为0. 3%，搅拌均勻，采用M士 1 °C病毒灭活乩即可；步骤5、盐析离心工序溶液加入1倍(W/W)注射用水，混勻，按1 1的比例加入饱和氯化钠溶液，搅勻，用连续流离心机IOOOOrpm离心分离沉淀；取沉淀物加入1倍(W/W) 注射用水，搅勻，使沉淀溶解完全，进行二次盐析，再进行离心分离，收集沉淀物；其沉淀物与10倍注射水溶解，转入CM阳离子色谱纯化工序；步骤6、CM阳离子交换色谱纯化工序将装有CM阳离子交换树脂的色谱柱 (10X100CM,华美公司)进行平衡，上样速度为3. Oml/min,然后用PH = 4. O、浓度为 0. 3mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集细胞间质洗脱液；步骤7、超滤工序将收集的细胞间质洗脱液用孔径为IOkD的超滤器超滤 (Millipore)，进行浓缩脱盐处理，收集截留液；步骤8、配制工序以截留液的生物蛋白含量与生长因子、凝血因子以一定比例进行配制，PH值为4.5;步骤9、过滤除菌工序将配制好的溶液依次用孔径为为0. 45 μ m和0. 22 μ m滤芯 (PALL)过滤，分装；步骤10、冻干工序通过低温冷冻干燥将加有生长因子、凝血因子溶液中的水分
10去除，采用_20°C进行冷冻证，抽真空干燥，20°C恒温证；步骤11、二次灭活病毒工序将冻干后的产品进行内包装，然后加热灭活病毒，温度为100°C、时间为0. 5h ；以下工序都在洁净区中进行分装工序、切割工序、内包装工序、检验工序、成品包装工序、入库。实施例2步骤1、选取原料和脱脂处理取新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料，进行脱脂处理；其工艺如下将新鲜哺乳动物的结缔组织或皮放入不锈钢桶中，按原料与35%碳酸钠溶液1 10的比例，浸泡60min，定时搅拌；浸泡后捞出，先用水反复冲洗数次，再用纯化水反复冲洗10次；浙净水分，用不锈钢刀具刮净原料上的油脂或毛囊等杂质；步骤2、粉碎工序先用切丝机将原料切成条状，然后倒入绞肉机中粉碎，倒入不锈钢桶中，加入75%乙醇溶液浸泡60min捞出，用纯化水反复冲洗10次，再用注射用水反复冲洗5次，浙干；步骤3、酶解工序按Ikg 30kg的比例加入注射用水混勻，倒入胶体磨中勻浆； 勻浆液转入酶解罐中，缓慢滴加盐酸溶液，调一定PH值；按Ikg原料加入IOg胃蛋白酶，酶解温度控制在35°C之间，搅拌勻浆液PH值为4. 0时终止，此时酶解液成粘稠、均勻的胶状流体；步骤4、S/D病毒灭活工序S卩脂胞膜病毒灭活，酶解液与注射用水按1 10的比例进行稀释、混勻，用孔径为40 μ m的滤芯进行粗滤，再用孔径为1. 0 μ m滤芯进行精滤至病毒灭活罐中，加入蔗糖溶液、甘氨酸作为保护剂，达到终浓度为1. 5%，在连续搅拌的状态下，缓慢加入S/D病毒灭活液，即聚山梨酯80的浓度为1 %，磷酸三丁酯的浓度为0. 3%，搅拌均勻，采用病毒灭活Mi即可；步骤5、盐析离心工序溶液加入20倍(W/W)注射用水，混勻，按1 5的比例加入饱和氯化钠溶液，搅勻，用连续流离心机17000rpm离心分离沉淀；取沉淀物加入20倍(W/ W)注射用水，搅勻，使沉淀溶解完全，进行二次盐析，再进行离心分离，收集沉淀物；其沉淀物与25倍注射水溶解，转入CM阳离子色谱纯化工序；步骤6、CM阳离子交换色谱纯化工序将装有CM阳离子交换树脂的色谱柱 (10X100CM,华美公司)进行平衡，上样速度为6. Oml/min,然后用pH值为4. O、浓度为 0. 6mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集细胞间质洗脱液；步骤7、超滤工序将收集的细胞间质洗脱液用孔径为20kD的超滤器超滤 (Millipore)，进行浓缩脱盐处理，收集截留液；步骤8、配制工序以截留液的生物蛋白含量与生长因子、凝血因子以一定比例进行配制，PH值为7. 5 ；步骤9、过滤除菌工序将配制好的溶液依次用孔径为为0. 45 μ m和0. 22 μ m滤芯 (PALL)过滤，分装；步骤10、冻干工序通过低温冷冻干燥将加有生长因子、凝血因子溶液中的水分去除，采用_45°C进行冷冻lh，抽真空干燥，40°C恒温Ih ；步骤11、二次灭活病毒工序将冻干后的产品进行内包装，然后加热灭活病毒，温度为60°C、时间为144h；
以下工序都在洁净区中进行，分装工序、切割工序、内包装工序、检验工序、成品包装工序、入库。实施例3步骤1、选取原料和脱脂处理取新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料，进行脱脂处理；其工艺如下将新鲜哺乳动物的结缔组织或皮放入不锈钢桶中，按原料与20%碳酸钠溶液1 5的比例，浸泡30min，定时搅拌；浸泡后捞出，先用水反复冲洗数次，再用纯化水反复冲洗8次；浙净水分，用不锈钢刀具刮净原料上的油脂或毛囊等杂质；步骤2、粉碎工序先用切丝机将原料切成条状，然后倒入绞肉机中粉碎，倒入不锈钢桶中，加入75%乙醇溶液浸泡30min捞出，用纯化水反复冲洗7次，再用注射用水反复冲洗4次，浙干；步骤3、酶解工序按Ikg 15kg的比例加入注射用水混勻，倒入胶体磨中勻浆； 勻浆液转入酶解罐中，缓慢滴加盐酸溶液，调一定PH值；按Ikg原料加入5g胃蛋白酶，酶解温度控制在20°C之间，搅拌勻浆液PH值为3. 0时终止，此时酶解液成粘稠、均勻的胶状流体；步骤4、S/D病毒灭活工序S卩脂胞膜病毒灭活，酶解液与注射用水按1 5的比例进行稀释、混勻，用孔径为40 μ m的滤芯进行粗滤，再用孔径为1. 0 μ m滤芯进行精滤至病毒灭活罐中，加入蔗糖溶液、甘氨酸作为保护剂，达到终浓度为1.0%，在连续搅拌的状态下， 缓慢加入S/D病毒灭活液，即聚山梨酯80的浓度为1%，磷酸三丁酯的浓度为0. 3%，搅拌均勻，采用病毒灭活Mi即可；步骤5、盐析离心工序溶液加入10倍(W/W)注射用水，混勻，按1 3的比例加入饱和氯化钠溶液，搅勻，用连续流离心机13500rpm离心分离沉淀；取沉淀物加入10倍(W/ W)注射用水，搅勻，使沉淀溶解完全，进行二次盐析，再进行离心分离，收集沉淀物；其沉淀物与20倍注射水溶解，转入CM阳离子色谱纯化工序；步骤6、CM阳离子交换色谱纯化工序将装有CM阳离子交换树脂的色谱柱 (10X100CM,华美公司)进行平衡，上样速度为4. Oml/min,然后用PH = 4. O、浓度为 0. 4mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集细胞间质洗脱液；步骤7、超滤工序将收集的细胞间质洗脱液用孔径为30kD的超滤器超滤 (Millipore)，进行浓缩脱盐处理，收集截留液；步骤8、配制工序以截留液的生物蛋白含量与生长因子、凝血因子以一定比例进行配制，PH值为6.0;步骤9、过滤除菌工序将配制好的溶液依次用孔径为0. 45 μ m和0. 22 μ m滤芯 (PALL)过滤，分装；步骤10、冻干工序通过低温冷冻干燥将加有生长因子、凝血因子溶液中的水分去除，采用-35°C进行冷冻2.证，抽真空干燥，30°C恒温池；步骤11、二次灭活病毒工序将冻干后的产品进行内包装，然后加热灭活病毒，温度为80°C、时间为72h;以下工序都在洁净区中进行，分装工序、切割工序、内包装工序、检验工序、成品包装工序、入库。可以理解地是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种生物蛋白海绵，它包括细胞间质、生长因子、凝血因子，其特征在于是以细胞间质为基质，均勻的添加一定比例的生长因子、凝血因子，通过冷冻干燥技术制备成海绵状。
2.根据权利要求1所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述细胞间质由胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖组成。
3.根据权利要求2所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述胶原蛋白由I型和III型胶原蛋白为主的19种其他型胶原蛋白组成。
4.根据权利要求1所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述生长因子分为碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经生长因子、结缔组织生长因子、肽类生长因子、转化生长因子、血小板源生长因子。
5.根据权利要求1所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述凝血因子分为凝血酶因子、 纤维蛋白原因子、XIII因子。
6.根据权利要求1所述的生物蛋白海绵，其特征在于所述生物蛋白海绵每平方厘米生长因子、凝血因子的含量为30 300IU。
7.—种生物蛋白海绵的制备方法，采用如下工艺流程以新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料脱脂工序——粉碎工序——酶解工序——S/D病毒灭活工序——一次盐析沉淀工序——离心分离工序——二次盐析工序——CM阳离子交换色谱纯化工序——超滤工序——配制工序一过滤除菌工序一分装工序——冻干工序——切割工序——内包装工序——二次灭活病毒工序——检验工序——成品包装工序——入库。包括以下步骤步骤1、选取原料和脱脂处理取新鲜哺乳动物的结缔组织或皮为原料，进行脱脂处理；其工艺如下将新鲜哺乳动物的结缔组织或皮放入不锈钢桶中，按原料与10 35%碳酸钠溶液1 1 10的比例，浸泡5 60min，定时搅拌；浸泡后捞出，先用水反复冲洗数次，再用纯化水反复冲洗5 10次；浙净水分，用不锈钢刀具刮净原料上的油脂或毛囊等杂质；步骤2、粉碎工序先用切丝机将原料切成条状，然后倒入绞肉机中粉碎，倒入不锈钢桶中，加入75%乙醇溶液浸泡5 60min捞出，用纯化水反复冲洗5 10次，再用注射用水反复冲洗2 5次，浙干；步骤3、酶解工序按Ikg 5-30kg的比例加入注射用水混勻，倒入胶体磨中勻浆；勻浆液转入酶解罐中，缓慢滴加盐酸溶液，调一定PH值；按Ikg原料加入1 IOg胃蛋白酶， 酶解温度控制在10°C 35°C之间，搅拌勻浆液PH值为2. 0 4. 0时终止，此时酶解液成粘稠、均勻的胶状流体；步骤4、S/D病毒灭活工序S卩脂胞膜病毒灭活，酶解液与注射用水按1 1 10的比例进行稀释、混勻，用孔径为40 μ m的滤芯进行粗滤，再用孔径为1. 0 μ m滤芯进行精滤至病毒灭活罐中，加入保护剂，达到终浓度为0. 5 1. 5%，在连续搅拌的状态下，缓慢加入 S/D病毒灭活液，即聚山梨酯80的浓度为1 %，磷酸三丁酯的浓度为0. 3%，搅拌均勻，采用病毒灭活6h即可；步骤5、盐析离心工序溶液加入1 20倍(W/W)注射用水，混勻，按1 1 5的比例加入饱和氯化钠溶液，搅勻，用连续流离心机10000 17000rpm离心分离沉淀；取沉淀物加入1 20倍(W/W)注射用水，搅勻，使沉淀溶解完全，进行二次盐析，再进行离心分离，收集沉淀物；其沉淀物与10 25倍注射水溶解，转入CM阳离子色谱纯化工序；步骤6、CM阳离子交换色谱纯化工序将装有CM阳离子交换树脂的色谱柱 (10X100CM，华美公司)进行平衡，上样速度为3.0 6. Oml/min，然后用pH = 4. O、浓度为 0. 3 0. 6mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，收集细胞间质洗脱液；步骤7、超滤工序将收集的细胞间质洗脱液用优选孔径为IOkD还可使用20kD、30kD 的超滤器超滤(Millipore)，进行浓缩脱盐处理，收集截留液；步骤8、配制工序以截留液的生物蛋白含量与生长因子、凝血因子以一定比例进行配制，PH值为4. 5 7.5 ；步骤9、过滤除菌工序将配制好的溶液依次用孔径为0. 45 μ m和0. 22 μ m滤芯(PALL) 过滤，分装；步骤10、冻干工序通过低温冷冻干燥将加有生长因子、凝血因子溶液中的水分去除， 采用-20°C -45°C进行冷冻1 釙，抽真空干燥，20°C 40°C恒温1 釙；步骤11、二次灭活病毒工序将冻干后的产品进行加热灭活病毒，温度为60 100°C、 时间为0. 5 144h ；以下工序都在洁净区中进行分装工序、切割工序、内包装工序、检验工序、成品包装工序、入库。
8.根据权利要求7所述的生物蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述S/D病毒灭活工序加入蔗糖溶液、甘氨酸作为保护剂。
9.根据权利要求7所述的生物蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述二次灭活病毒工序优选温度为60°c、80°c、10(rc ；优选时间为144h、72h、0.釙。
全文摘要
本发明公开了一种生物蛋白海绵及其制备方法，提供一种根据人体和动物体内细胞和细胞生长环境相适应的特点，利用细胞间质作为生长因子的缓释载体，并通过冷冻干燥技术，使其形成冻干海绵状，以缓释的给药方式作用于肌体创面。本发明的制备方法改变了传统的制备过程，采用S/D病毒灭活并添加保护剂，避免人畜共患病毒交叉感染几率；CM阳离子色谱纯化过程，提高生物蛋白纯度，促进生物蛋白海绵止血及组织愈合效果，降低临床副反应；采用超滤工序替代透析工序，缩短了制备周期，保护生物蛋白活性，降低了生产成本；用加热灭活病毒代替钴60辐射灭菌方法，避免了放射线给产品带来的危害，同时保护了生物蛋白的活性，实现产品在临床应用上安全可靠。
文档编号A61L15/32GK102357259SQ20111021271
公开日2012年2月22日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者王珊珊 申请人:王珊珊