专利名称：一种抗癌药物的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是一种抗癌药物的制备方法。
背景技术：
新城疫病毒(NDV)为副粘病毒科副粘病毒属成员，能够引起禽类发生急性传染病，对养禽业的危害极大。NDV有时感染人，主要引起人的急性结膜炎，偶尔也可以侵害角膜，个别病人出现流感样症状，大多数病人不经治疗，7 IOd自行康复，且不传染给别人。NDV治疗患瘤病人的安全性高，对人的危害小。NDV抗肿瘤作用主要表现在三个方面，病毒可促进宿主产生细胞因子，如IFN，TNF，IL等；NDV可直接对肿瘤细胞产生细胞毒作用，加强 肿瘤抗原的免疫原性，通过宿主免疫机制杀伤肿瘤细胞；NDV可激活患瘤机体的免疫细胞，活化免疫细胞对肿瘤细胞的毒性作用。因此，通过提高病毒纯度，减少病毒中卵清蛋白等杂蛋白，制备出对人体副作用少而抗癌作用显著的制剂，具有非常重要的应用价值和经济价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供上述抗癌药物的制备方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种抗癌药物，是由下述方法得到的接种新城疫病毒之后，收取的病毒液，经过超滤浓缩后，再进行纯化，除菌过滤后获得该抗癌药物。上述抗癌药物，所述方法的具体步骤为(I)鸡胚成纤维细胞制备选择良好的鸡胚取9 10日龄鸡胚，用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30分钟。剪切用眼科剪把组织切成I. 5毫米大小的块，以便于消化。处理组织将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入
O.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚Iml (组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。消化将其置入37°C水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10 15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。分离在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在倒置显微镜镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入含5%犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hanks液少许。用力震摇，或用吸管吹打，使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500 1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)，加入适量含有血清的培养液。将培养瓶置入0)2细胞培养箱中，37°C、5% C02。瓶口用螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，培养24小时进行观察。一般在24 48小时可形成单层细胞。(2)病毒接种取培养24小时以上的的细胞，加入O. 2ml新城疫病毒，换维持液继续培养72小时。培养温度33 35 °C。(3)病毒收获取来培养72小时的细胞瓶，镜下观察有无病变产生，将有病变的细胞在_20°C冻·融多次，使病毒完全释放，收获含有病毒细胞悬液。(4)超滤在无菌环境下通过超滤系统对病毒液超滤浓缩至原来的10倍，其中超滤膜包截留分子量为lOOKd。(5)纯化无菌条件下取步骤(4)收集超滤后的病毒液，将膜上的病毒液打入层析柱中进行纯化，用PBS进行洗脱，收集病毒峰，所得纯化后的新城疫病毒液。(6)混合无菌条件下取步骤(5)纯化后的病毒液与超滤后的膜下有效成份相混合，除菌过滤后得到一种新的抗癌药物。本发明所述的抗癌药物纯度高，而病毒液中卵清蛋白等杂蛋白少，大大减小了该制剂对人体的副作用，从而大大提高了该药物的抗肿瘤作用；所述制备方法可有效提高病毒纯度，减少病毒中卵清蛋白等杂蛋白，制备方法简单，大大降低了生产成本，适合规模化工业生产的需要。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。具体实施例I一、鸡胚成纤维细胞的制备选择良好的鸡胚取9日龄鸡胚，用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台，用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30分钟。剪切用眼科剪把组织切成I. 5毫米大小的块，以便于消化。处理组织将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入
O.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚Iml (组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。消化将其置入37°C水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10 15分钟，一般约12分钟，视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短，见组织松软即可。一般不可消化时间太长，否则容易导致细胞活力不足。分离在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在倒置显微镜镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化。加入含5%犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hanks液少许,用力震摇或用吸管吹打,使细胞分散,脱落,然后用纱布过滤，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速1000转/分离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
将培养瓶置入0)2细胞培养箱中，37°C、5% C02。瓶口用螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，培养24小时进行观察，一般在24 48小时可形成单层细胞。二、病毒接种取培养24小时以上的的细胞，加入O. 2ml新城疫病毒，换维持液继续培养72小时，培养温度33 35°C。三、病毒收获取来培养72小时的细胞瓶，镜下观察有无病变产生，将有病变的细胞在_20°C冻融多次，使病毒完全释放，收获含有病毒细胞悬液。四、超滤浓缩在无菌环境下通过超滤系统对2500ml病毒液超滤浓缩至原来的10倍，其中超滤膜包截留分子量为lOOKd，最后得到膜上浓缩液250ml，膜下1750ml。五、纯化将浓缩后超滤膜膜上250ml病毒液移入无菌器皿，在无菌条件下将病毒液打入层析柱中，通过凝胶介质对样品进行层析纯化，获得纯化后的病毒样品750ml。六、合并将纯化后的病毒液750ml与IOOKd膜下有效成份1750ml混合，除菌过滤后得到一种抗癌药物。具体实施例2一、鸡胚成纤维细胞的制备选择良好的鸡胚取10日龄鸡胚，用新洁尔灭消毒蛋壳，放入净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。用另一套镊子将壳膜打开，将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。用Hanks液漂洗3次，去除血污。用眼科剪把组织切成I. 5毫米大小的块，加入O. 25%的胰酶消化，消化约12分钟。低速1000转/分离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。CO2细胞培养箱中培养，一般在24 48小时可形成单层细胞。二、病毒接种取培养24小时以上的的细胞，加入O. 2ml新城疫病毒，换维持液继续培养72小时，培养温度33 35°C。三、病毒收获取来培养72小时的细胞瓶，镜下观察有无病变产生，将有病变的细胞在_20°C冻融多次，使病毒完全释放，收获含有病毒细胞悬液。四、超滤浓缩在无菌环境下通过超滤系统对5000ml病毒液超滤浓缩至原来的10倍，其中超滤膜包截留分子量为lOOKd。最后得到膜上浓缩液500ml，膜下3500ml。五、纯化将浓缩后超滤膜膜上500ml病毒液移入无菌器皿，在无菌条件下将病毒液打入层析柱中，通过凝胶介质对样品进行层析纯化，获得纯化后的病毒样品1500ml。六、合并将纯化后的病毒液1500ml与100KD膜下有效成份3500ml混合，除菌过滤后得到一种抗癌药物。具体实施例3一、鸡胚成纤维细胞的制备选择良好的鸡胚，制备单层鸡胚成纤维细胞。二、病毒接种取培养24小时以上的的细胞，加入O. 2ml新城疫病毒，换维持液继续培养72小时。培养温度33 35 °C。三、病毒收获用培养72小时的细胞，在_20°C下反复冻融多次，使病毒完全释放，收获含有病毒细胞悬液。四、超滤浓缩在无菌环境下通过超滤系统对IOOOml病毒液超滤浓缩至原来的10倍，其中超滤膜包截留分子量为lOOKd。超滤后的病毒液100ml，膜下900ml。五、纯化将浓缩后超滤膜膜上IOOml病毒液拿进无菌器皿，在无菌条件下将病毒液打入层析柱中，通过凝胶介质对样品进行层析纯化，获得纯化后的病毒样品300ml。六、合并将纯化后的病毒液300ml与100K超滤后膜下900ml混合除菌过滤后，得到一种抗
癌药物。抗癌药物的活性检测用小白鼠做抗肿瘤实验，本次试验共分为8组，小鼠腋下接种S180肉瘤细胞，制作鼠源肉瘤模型。各药物均瘤内注射，每只O. I毫升，每天一次，用药疗程为7天，试验结果如下表
权利要求
1.一种抗癌药物的制备方法，其特征在于制备鸡胚成纤维细胞，用新城疫病毒接种鸡胚成纤维细胞，经过培养收获病毒液，收获的病毒液经过IOOK膜包超滤浓缩，超滤后的膜上样品再通过柱层析纯化，将超滤膜下的有效成份和纯化后的病毒样品等量混合，经除菌过滤后获得一种抗癌药物。
2.根据权利要求I所述的抗癌药物，其特征在于 (1)鸡胚成纤维细胞制备 通过选择良好的鸡胚、剪切、处理组织、消化、分离、培养等步骤进行制备鸡胚成纤维细胞。
(2)病毒接种 取培养24小时以上的的细胞按一定比例加入新城疫病毒，换维持液培养。
(3)病毒收获将在倒置显微镜镜下观察有病变的细胞，在_20°C冻融多次，收获细胞悬液。
(4)超滤浓缩 在无菌环境下通过超滤系统对步骤(3)的病毒液超滤浓缩，其中超滤膜包截留分子量为 IOOKd0 (5)纯化 在无菌条件下将步骤(4)中浓缩后超滤膜膜上病毒液打入层析柱中进行纯化。
(6)混合 将超滤后的膜下有效成份与纯化后的病毒液混合，过滤除菌。
3.根据权利要求2所述的制备一种抗癌药物的制备方法，其特征在于所述步骤(I)中的鸡胚应选择9 11日龄鸡胚。
4.根据权利要求2所述的制备一种抗癌药物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中接种的病毒是新城疫病毒。
5.根据权利要求2所述的制备一种抗癌药物的制备方法，其特征在于所述步骤(3)应收获发生病变的细胞。
6.根据权利要求2所述的制备一种抗癌药物的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中超滤膜包截留分子量为lOOKd。
7.根据权利要求2所述的制备一种抗癌药物的制备方法，其特征在于所述步骤(5)纯化所用层析柱为凝胶过滤层析柱。
8.根据权利要求2所述的制备一种抗癌药物的制备方法，其特征在于所述步骤(6)纯化后的新城疫病毒和膜下有效成份相混合，除菌过滤后得到一种抗癌药物。
全文摘要
本发明提供了一种抗癌药物的制备方法，其特征在于选择鸡胚成纤维细胞，接种新城疫病毒，经过培养收获病毒液，收获后的病毒液经过超滤浓缩，将膜上浓缩液通过柱层析纯化，最终将膜下的有效成份和纯化病毒混合得到一种抗癌药物。本发明的产品能够通过提高机体免疫力等多种机制发挥其强大的抗肿瘤作用。
文档编号A61K35/76GK102908367SQ20111021911
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者赵钢 申请人:天津济命生生物科技有限公司