淫羊藿多糖及其组分和它们用于疫苗佐剂的用途的制作方法

专利名称：淫羊藿多糖及其组分和它们用于疫苗佐剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及淫羊藿的多糖提取物，具体地，涉及从中药材淫羊藿叶提取的淫羊藿总多糖及其其中的酸性糖组分和非糖组分，本发明还涉及所述的淫羊藿总多糖及其其中的酸性糖组分和非糖组分用于疫苗佐剂、疫苗组合物和抗体制备的用途。
背景技术：
淫羊藿(Epimedium)为小檗硷科(Berberidaceae)植物，常用于补肾壮阳、祛风除湿和益气。现代药理研究表明淫羊藿具有镇咳、去痰、平喘、抑菌等活性。淫羊藿中主要化学成分有黄酮、木质素、生物碱以及多糖等。近年来有以下文献报道有关淫羊藿多糖对动物免疫功能的影响，具体内容如下徐颖等(沈阳药科大学学报，2000，17(6) :434-437)采用淫羊藿水煎、醇沉、洗涤和透析获得淫羊藿多糖。该多糖腹腔注射给予环磷酰胺所致的免疫低下小鼠及荷瘤(S180) 小鼠，观察对免疫功能的影响。结果表明该多糖50、25mg/kgX7d，可使脾重量指数上升，使下降的溶血素值及空斑形成细胞的溶血能力回升，使下降的白细胞总数上升。小鼠荷瘤后免疫功能低下，皮下注射该多糖50mg/kgX8d可对抗荷瘤引起的胸腺指数下降，，使荷瘤小鼠的血清溶血素、空斑形成细胞的溶血能力及迟发性超敏反应能力有所提高.王刚等(武警医学院学报，2003，12(3) =194-196)由水煎煮提取、结晶、透析48h 方法获得淫羊藿多糖。该多糖12.5、25.0和50.0!1^/1^连续给予荷瘤小鼠皮下注射8(1。结果表明淫羊藿多糖可显著提高小鼠因荷瘤所导致的胸腺指数下降，溶血素形成减少，溶血空斑值降低以及迟发性超敏反应低下。靳录洋等(甘肃畜牧兽医，2004，观(3) 7-10)观察不同浓度的淫羊藿多糖(EPS， 多糖含量为32. 30% )对正常罗曼雏鸡免疫功能的影响。试验结果表明EPS可使外周血淋巴细胞转化率和ND-HI抗体效价明显升高。罗艳等采用相同的淫羊藿多糖，探讨淫羊藿多糖(EPQ对雏鸡免疫功能和禽流感-新城疫重组二联苗免疫效果的影响。结果表明不同浓度EPS均能显著提高淋巴细胞转化率、中性粒细胞吞噬力、AI-HI和ND-HI抗体效价、红细胞-Ob花环率，降低红细胞-IC花环率，且中剂量效果较好张述斌等(甘肃畜牧兽医，2004, ) J4-25)采用Ca (0!1)2水提取工艺制备淫羊藿多糖，苯酚-硫酸法测定糖含量为73. 68%。实验结果表明该多糖鸡新城疫疫苗有明显的免疫增强作用，用该多糖免疫后鸡血清中HI抗体效价比对照鸡明显提高，而且维持时间延长。此外，T淋巴细胞ANAE阳性率与HI抗体效价有相应的消长趋势。孔祥峰等(畜牧兽医学报，2004，35 0),468-47 用新城疫IV系疫苗免疫雏鸡，在免疫前、后分别注射高、低剂量淫羊藿多糖(糖含量为66. 38% )，均能不同程度地提高抗体效价，且与给药时间、剂量和免疫接种次数有一定关系。尚川川等(动物医学进展，2009，3(K4) :23-26)将50、100、150g/L等不同浓度的淫羊藿多糖与灭活的鸡新城疫病毒乳化制备疫苗免疫雏鸡，探讨淫羊藿多糖作为免疫佐剂对鸡免疫功能的影响。结果表明100g/L和150g/L的淫羊藿多糖作为免疫佐剂均可促进抗体的产生，提高脾脏指数，但对法氏囊指数的促进作用不明显。孙艳等(中国专利，专利号CN1360894)从淫羊藿中提取一种淫羊藿多糖，该多糖是由A部分和B部分组成，包括鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七种单糖，具有明显的促免疫作用，是一种很有发展前途的生物调节剂。适用于乳腺癌、小细胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等癌症患者化疗、放疗需要辅助治疗者。Yang LS等(Vaccine，2008，洸=4451-4455)研究黄芪多糖、淫羊藿多糖(糖含量为71. 23% )和蜂胶黄酮组成的复方对兔出血病疫苗的佐剂作用。结果表明该复方体外能显著促进T淋巴细胞的增殖，提高T细胞分泌IFN-Y和IL-10的mRNA表达水平，其佐剂作用略强于铝佐剂，对兔出血病有保护作用。Wang DW 等(Vaccine，2006，24 :7109-7114)将淫羊藿多糖(糖含量为 71. 23% ) 与蜂胶黄酮混和，研究与IL-2免疫协同作用，以及对鸡外周淋巴细胞IL-2和IFN-YmRNA 表达水平的影响。结果表明该混合物能提高抗体滴度和IFN- y mRNA表达水平，但与IL-2 的协同作用不明显。Sun JL 等(Vaccine, 2006, 24 :2343-2348)把淫羊藿多糖(糖含量 88. 96%)和蜂胶黄酮混和作为佐剂，研究对兔出血疫苗的免疫激活作用；同时研究了该混合物对鸡新城疫疫苗佐剂效应和免疫功能的影响。结果显示淫羊藿多糖和蜂胶黄酮混和作为佐剂，能显著提高抗体滴度，促进淋巴细胞增殖，其作用效果与油佐剂相近。

发明内容
发明人意外地发现，本发明制备的淫羊藿多糖以及其多糖和非糖组分，具有良好的疫苗佐剂作用。具体地，本发明包括以下几个方面本发明的第一方面涉及淫羊藿多糖(也称为淫羊藿总多糖)，其是通过如下方法获得的1)取淫羊藿叶，加入水浸泡，得到水提液；加水浸提的时间为1 72小时，视浸提温度而定。在室温条件下，优选为M 48 小时，在本发明的一个实施方案中，为48小时；2)将步骤1)得到的水提液进行乙醇沉淀，取沉淀部分加入水中溶解，离心，取上清液进行透析；3)取透析所得的透析液进行冷冻干燥，得到淫羊藿多糖。根据本发明第一方面的淫羊藿多糖，其特征在于如下的(1)-(12)项中的任意一项或多项(1)步骤1)中所述的淫羊藿叶，为未经提取的淫羊藿叶，或者经过有机溶剂例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、环己烷、正丁醇、乙醇或甲醇萃取后得到的残渣叶；通过有机溶剂浸提可以去除叶绿素等杂质以及脂溶性小分子成分。有机溶剂浸提的温度通常为室温；浸提的时间为4 72小时，优选为12 48小时，在本发明的一个实施方案中，为M小时；(2)步骤1)中所用水为蒸馏水或去离子水；(3)步骤1)中，加入水浸提的温度为4 60°C，优选为20 60°C，更优选为20 500C。在此温度范围内，不会破坏糖的性质，且随温度升高，糖的得率增加。
(4)步骤1)中，将浸提后得到的淫羊藿叶按照相同条件进行一次或多次浸提，合并水提液；在本发明的一个实施方案中，进行两次浸提。(5)步骤1)中水的用量为淫羊藿叶的5-20倍量(L/Kg)；(6)步骤1)中，浸提期间进行搅拌；(7)步骤1)中，将得到的水提液在50°C _55°C下进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；(8)步骤2)中，乙醇沉淀的条件是醇沉后乙醇的终浓度为60-80 %，例如 70-75% ；优选地，醇沉的时间大于12小时，例如为48-72小时；(9)步骤2、中，将乙醇沉淀后离心得到的沉淀再进行一次或多次乙醇沉淀；(10)步骤2)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000 ；(11)步骤2)中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；(12)步骤2)中，透析时间为M 72小时，透析进行一次或多次；(13)步骤幻中，在冷冻干燥之前，将得到的透析液在50°C-55°C下进行减压浓缩。在本发明的一个实施方案中，所述的淫羊藿多糖是通过以下方法制备的取淫羊藿叶，向其中加入蒸馏水浸泡，期间不时搅拌；过滤，滤液离心；浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行第二次提取；合并两次提取的水提液，减压浓缩，然后加入3 4倍体积的乙醇进行醇沉；醇沉液离心，将沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次；合并溶解的上清液，装入透析袋，截留分子量> 1000，用水透析；将所得透析液减压浓缩后，装入小瓶进行冷冻干燥，获得所述淫羊藿多糖。在另一个实施方案中，本发明所述的淫羊藿多糖是通过如下方法获得的取淫羊藿叶，向其中加入石油醚浸没浸泡；过滤，将滤液减压回收浸膏；浸提后的淫羊藿叶自然挥干后，向其中加入蒸馏水浸泡，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心，浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行第二次提取；合并两次提取的水提液，减压浓缩，然后加入 3 4倍体积的乙醇进行醇沉；醇沉液离心，向沉淀部分中加入水搅拌溶解，离心，再将沉淀同样操作二次；合并溶解的上清液，装入透析袋，截留分子量> 1000，用水透析；将得到的透析液减压浓缩后，装入小瓶进行冷冻干燥，获得所述淫羊藿多糖。本发明的第二方面涉及一种淫羊藿多糖，或者根据本发明第一方面任一项所述的淫羊藿多糖，其特征在于(1)含糖量为25-45% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为5_20% (以半乳糖醛酸计算)；和/或(2)其具有附图1和附图2所示的特征。在本发明的一个实施方案中，含糖量为35. 60% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为 7. 53% (以半乳糖醛酸计算)。本发明的第三方面涉及一种淫羊藿酸性多糖组分，其为根据本发明第一方面或第二方面任一项所述的淫羊藿多糖经DEAE-纤维素柱层析，得到的具有硫酸-苯酚显色、 490nm波长吸收的0. 25mol/L NaHCO3洗脱部分。本发明的第四方面涉及一种淫羊藿酸性多糖组分，或者根据本发明第三方面所述的淫羊藿酸性多糖组分，其特征在于
包含鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸；以及，其分子量为6000 20000。根据本发明第四方面的淫羊藿酸性多糖组分，其特征在于，(1)含糖量为45-65% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为5_15% (以半乳糖醛酸计算)；和/或(2)鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔比为鼠李糖 岩藻糖阿拉伯糖木糖甘露糖葡萄糖半乳糖=1. 00 0. 33 4. 44 0. 38 0. 640. 87 5. 26。在本发明的一个实施方案中，含糖量为58. 93% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为 8. 40% (以半乳糖醛酸计算)。在本发明的实施方案中，含糖量(以葡萄糖计)的测定方法为硫酸-苯酚法；糖醛酸含量(以半乳糖醛酸计)的测定方法为间羟联苯法。本发明的第五方面涉及一种淫羊藿非糖组分，其为本发明第一方面或第二方面任一项所述的淫羊藿多糖经DEAE-纤维素柱层析，得到的具有^Onm吸收的0. 25mol/L NaHCO3洗脱部分。本发明的第六方面涉及一种淫羊藿非糖组分，或者根据本发明第五方面所述的淫羊藿非糖组分，其为淫羊藿多糖的非糖组分，其分子量为2000 10000。本发明的第七方面涉及一种药物组合物，其包含本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分，以及药学上可接受的辅料。本发明的第八方面涉及一种疫苗佐剂，其包含本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分。本发明的第九方面涉及一种疫苗制剂或疫苗组合物，其包含本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分。本发明的第十方面涉及本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分用于制备疫苗佐剂、疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。本发明还涉及一种制备抗体的方法，其包括使用有效量的本发明第一方面至第六方面任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分的步骤。本发明还涉及一种免疫方法或者接种方法，包括给予哺乳动物有效量的疫苗制剂或疫苗组合物的步骤。在本发明中，所述淫羊藿多糖组分是指从淫羊藿总多糖中分离得到的不同组分。 在本发明的一个实施方案中，为其中的酸性糖组分，例如为YYH-G1。在本发明的另一个实施方案中，为其中的非糖组分，例如为YYH-G4。在本发明中，所述疫苗包括减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫
田ο在本发明中，所述有效量是指给予哺乳动物实现能够免疫效果的疫苗制剂或疫苗组合物的剂量。发明的有益效果
本发明从淫羊藿叶中通过水浸提的方式提取得到淫羊藿总多糖，进而分离得到其中的多糖组分和非糖组分，并对其进行了鉴定，进一步明确了其组成成分。实验证明得到的淫羊藿总多糖及其多糖和非糖组分均能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，为疫苗和抗体的制备提供了新途径。同时，分离得到了淫羊藿总多糖中具有佐剂作用的多糖组分和非糖组分，为淫羊藿总多糖的佐剂作用机制研究奠定了基础，为找到具有更好佐剂效果的多糖或非糖制剂提供了可能。


图1为总多糖YYH-G的DEAE-纤维素柱层析洗脱曲线，苯酚-硫酸法检测，490nm 波长检测糖吸收峰图2为总多糖YYH-G的DEAE-纤维素柱层析洗脱曲线，280nm波长检测非糖成分图3为OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫1次后小鼠血清抗体滴度，mean士SD，η = 5图4为OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫2次后小鼠血清抗体滴度，mean士SD，η = 5图5为OVA抗原配伍多糖YYH-G免疫3次后小鼠血清抗体滴度，mean士SD，η = 5图6为OVA抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫1次后小鼠的抗体滴度， mean士SD, η = 5 图7为OVA抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫2次后小鼠的抗体滴度， mean士SD, η = 5图8为Hmi病毒抗原配伍多糖YYH-Gl免疫1次后小鼠血清抗体滴度，mean士SD， η = 5图9为Hmi病毒抗原配伍多糖YYH-G4免疫1次后小鼠血清抗体滴度，mean士SD， η = 5图10为Hmi病毒抗原配伍多糖YYH-Gl免疫2次后小鼠血清抗体滴度，mean士SD， η = 5图11为Hmi病毒抗原配伍多糖YYH-G4免疫2次后小鼠血清抗体滴度，mean士SD， η = 5图12为Hmi病毒抗原配伍多糖YYH-Gl或YYH-G4免疫1次后小鼠血清抗体滴度， mean士SD, η = 具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1 淫羊蕾总多糖的制备淫羊藿叶1kg，室温下加入石油醚浸没浸泡M小时，过滤，滤液30 35°C减压回收浸膏。经过石油醚浸提后的淫羊藿叶自然挥干后，加入15L蒸馏水，室温下(20 30°C) 浸泡48小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心IOmin (转速3000r/min)，浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液，50 55°C减压浓缩至1000ml，然后加入3倍体积(3000ml)95%的乙醇进行48小时的醇沉。醇沉液离心IOmin(转速 3000r/min)，沉淀部分加入IOOOml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量> 1000)，自来水透析48小时后换蒸馏水再透析M小时。 该透析液50 55°C减压浓缩至200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得棕色粉末，即总多糖(得率为0. 74% ) ο实施例2 淫羊蕾总多糖的制备淫羊藿叶1kg，室温下加入15L蒸馏水，室温下QO 30°C )浸泡48小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心IOmin(转速3000r/min)，浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液，50 55°C减压浓缩至1000ml，然后加入3倍体积 (3000ml) 95%的乙醇进行48 72小时的醇沉。醇沉液离心IOmin (转速3000r/min)，沉淀部分加入IOOOml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量> 1000)，自来水透析48小时后换蒸馏水再透析M小时。该透析液50 55°C减压浓缩至200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得棕色粉末，即总多糖(得率为 0. 81% )。实施例3 淫羊蕾总多糖的制备淫羊藿叶1kg，在55 60°C温度下加入15L蒸馏水，浸泡48小时，期间不时搅拌；然后过滤，滤液离心IOmin (转速3000r/min)，浸提后的淫羊藿叶在同样条件下进行二次提取。合并二次提取的水提液，50 55°C减压浓缩至1000ml，然后加入3倍体积 (3000ml) 95%的乙醇进行48 72小时的醇沉。醇沉液离心IOmin (转速3000r/min)，沉淀部分加入IOOOml水搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次。合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量> 1000)，自来水透析48小时后换蒸馏水再透析M小时。该透析液50 55°C减压浓缩至200ml左右，装入小瓶进行冷冻干燥，获得棕色粉末，即总多糖(得率为 1. 9% )。实施例4 淫羊蕾多糖组分的制备室温浸提的淫羊藿总多糖YYH-G (实施例1制备)lg，加入蒸馏水50ml溶解，溶解液上样 DEAE-纤维素柱(Φ8ο Χ :35cm)，分别采用水、0. 25mol/L NaHCO3、0. 5mol/L NaHCO3 和0. lmol/L NaOH进行连续洗脱，流速lml/min，IOml/管，相应获得多糖组分YYH-GO (490nm 吸收，H2O)、YYH-Gl (490nm 吸收，0. 25mol/L NaHCO3)、YYH-G2 (490nm 吸收，0. 5mol/L NaHCO3)、YYH-G3 (490nm 吸收，0. Imol/LNaOH)以及非糖组分 YYH-G4 (280nm 吸收，0. 25mol/L NaHCO3)、YYH-G5 (280nm 吸收，0. 5mol/L NaHCO3)、YYH-G6 (280nm 吸收，0. lmol/L NaOH)。总多糖YYH-G在DEAE-纤维素柱层析的色谱图如图1和图2所示。实施例5 淫羊蕾总多糖、酸性多糖组分和非糖组分的理化性质淫羊藿总多糖YYH-G由实施例4制备，酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4 由实施例4制备。1.淫羊藿总多糖和酸性多糖组分的含糖量(以葡萄糖计)的测定1)实验方法采用硫酸-苯酚法测定糖含量(参考文献Dubois M.，et al. Colorimetric method for detemination of sugars and related substances. Anal. Chem. 1956 ；28 350-56)。
2)实验结果总多糖YYH-G为棕色粉末，含糖量为35. 60% (以葡萄糖计算)；酸性多糖组分YYH-Gl为淡黄色粉末，含糖量为58. 93% (以葡萄糖计算)；非糖组分YYH-G4为浅黄色粉末。2.淫羊藿总多糖和酸性多糖组分的的糖醛酸含量(以半乳糖醛酸计)的测定1)实验方法采用间羟联苯法测定糖醛酸含量(参考文献=Blumenkrantz N, et al. New method for quantitative determiation of uronic acid. Anal Biochem 1973 :484_89)。2)实验结果总多糖YYH-G的糖醛酸含量为7. 53% (以半乳糖醛酸计算)；酸性多糖组分YYH-Gl的糖醛酸含量为8. 40% (以半乳糖醛酸计算)。3.淫羊藿总多糖中酸性多糖组分和非糖组分的分子量测定1)实验方法仪器HPLC，Waters公司；色谱柱TSKsw4000 ；流动相0. IM Na2S04 ；流速0. 6ml/ min ；检测器示差。2)实验结果酸性多糖组分YYH-Gl的分子量为6000 20000 ；非糖组分YYH-G4的分子量为2000 10000。4.淫羊藿总多糖中酸性多糖组分的单糖组成酸性多糖组分YYH-Gl的单糖组成是鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸，摩尔比分别为1.00 0. 33 4.44 0. 38 0. 64 0. 87 5. 2 6。由于药材产地、批次不同，其中的糖含量和糖醛酸含量不可能完全相同，而是在本实施例数值周围波动。例如总多糖YYH-G的含糖量为25-45%，酸性多糖组分YYH-Gl的含糖量为45-65%，总多糖YYH-G的糖醛酸含量为5_20 %，酸性多糖组分YYH-Gl的糖醛酸含量为5-15%实施例6 淫羊蕾总多糖的生物学试验将室温下提取的淫羊藿总多糖YYH_G(实施例1制备)作为佐剂，以卵清蛋白 (OVA)为抗原，二者联用肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。具体实验方法如下实验动物Balb/C，6-8周，5只/组，雌性。药物浓度总多糖YYH-G :20mg/ml ；OVA :1. 2mg/ml ；铝佐剂2mg/ml ；对照溶剂生理盐水给药剂量:0VA-60μ g/50 μ 1/ 鼠；铝佐剂-100 μ g/50 μ 1/ 鼠；YYH-G :lmg/50 μ 1/ 鼠；分组(1)P 组PBS+0VA ； (2)铝佐剂组铝佐剂 +OVA ； (3) YYH-G 组YYH_G+0VA ； (4)溶剂对照组生理盐水。注射前等体积混合，100 μ 1/鼠，右后肢肌肉注射。免疫方案动物按照免疫分组首次免疫注射后3周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。首次免疫注射后第3周检测抗体滴度，第4周加强免疫，二次免疫注射后2周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度，视滴度情况，测定后2周进行第3次免疫。ELISA测定血清中抗体滴度。ELISA法所用试剂配制1.抗原包被液50mmol/L碳酸盐缓冲液pH9. 6。称取无水Na2CO3 1. 696g，NaHCO3 2. 856g加水溶解到IOOOml，调节pH至9. 6。2.洗涤液(10XPBST，ρΗ7· 4)称取 NaCl 80g，KCl 2g，Na2HP0429g, KH2PO4 2g， Tween-20 10ml，双蒸水至1000ml，调节pH7. 4，10倍稀释使用。3.封闭液1% BSA，用 50mmol/L PBS ρΗ7· 4 溶解。4.底物液(TMB-H2O2)使用时将底物液A和B等体积混合，加入30 % H2O2，终浓度 0. 5%。5.底物液A(TMB)，称取TMB 200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml。6.底物液 B (0. lmol/L 柠檬酸-0. 2mol/L Na2HPO4 缓冲液)，Na2HPO4 24. 8g，柠檬酸19. 33g，加双蒸水至1000ml，调节pH5. 0 5. 4。7. 2N H2SO48. OVA溶解于抗原包被液，浓度为4 μ g/ml，包被96孔板(Costa) 100 μ 1/孔，4°C 过夜。PBST洗3遍，1 % BSA-PBS 37 °C封闭Ih。PBST洗3遍后加入以PBST稀释的小鼠血清样品，100 μ 1/孔，37°C孵温 lh。PBST 洗 3 遍，加入 HRP-羊抗小鼠 IgG(l 1000，PBST) 100 μ 1/ 孔，37°C孵温1，PBST洗6遍，加入100 μ 1底物液显色后，加入50 μ 12NH2S04终止反应测定
A45ciO实验结果淫羊藿总多糖YYH-G、生理盐水、Al (OH)3分别与OVA等体积混合，免疫小鼠， 100 μ 1/鼠，免疫3周尾静脉取血，取血清自1 200始至1 1观00等比稀释，ELISA方法检测血清抗体滴度。实验结果表明第一次免疫所有测试组抗体滴度均比较低(图幻，而经过第二、三次免疫后YYH-G注射组动物血清滴度明显升高(见图4和图幻，表明YYH-G具有显著促进抗体产生作用。实施例7 淫羊蕾多糖组分的生物学试验室温下提取的淫羊藿总多糖YYH_G(实施例1制备)经DEAE-纤维素柱层析，获得酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4。YYH-Gl和YYH-G4分别作为佐剂，以卵清蛋白 (OVA)为抗原，二者联用肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。具体实验同实施例6。药物浓度YYH-Gl:10mg/ml ；YYH-G4 :10mg/ml ；OVA :1. 2mg/ml ；铝佐剂:2mg/ml ； 对照溶剂生理盐水给药剂量ΥΥΗ-60μ g/50 μ 1/ 鼠；铝佐剂-100 μ g/50 μ 1/ 鼠；YYH-G1 0. 5mg/50 μ 1/ 鼠；YYH-G4 :0. 5mg/50 μ 1/ 鼠;分组(1)P 组:PBS+0VA ； (2)铝佐剂组铝佐剂 +OVA ； (3) YYH-G1 组YYH_G1+0VA ； (4) YYH-G4 组YYH-G4+0VA ；注射前等体积混合，100 μ 1/鼠，右后肢肌肉注射。实验结果淫羊藿总多糖YYH-G经DEAE-纤维素柱层析分离，得到酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4，按照免疫方案进行进一步的佐剂活性功能测定，经第二次免疫后检测， YYH-Gl和YYH-G4组分具有显著的免疫佐剂活性，能够促进抗体的产生(图6和图7)。
实施例8淫羊蕾多糖组分的牛物学试验55 60°C下提取淫羊藿总多糖YYH_G(实施例3制备)经DEAE-纤维素柱层析， 获得酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4。采用Hmi病毒裂解液为抗原测定两种糖组分的活性。YYH-Gl和YYH-G4分别作为佐剂，以Hmi病毒裂解液为抗原，YYH-Gl和YYH-G4按照不同的剂量分别与甲型流感疫苗Hmi病毒裂解液配伍肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。具体实验同实施例6。混合后药物浓度YYH-Gl:10,5,2. 5，1. 25mg/ml ；YYH-G4 :5，2· 5，1. 25mg/ml ； HlNl :30μ g/ml ；铝佐剂:lmg/ml ；对照溶剂生理盐水给药剂量HlNl:3μ g/ΙΟΟμ 1/ 鼠；铝佐剂-100 μ g/100 μ 1/ 鼠；YYH-G1 :1. 0， 0. 5,0. 25，0. 125mg/100 μ 1/ 鼠；YYH-G4 :0. 5,0. 25,0. 125，0mg/100 μ 1/ 鼠;分组(1)P 组=HlNl (YYH-G1 or YYH-G4 :0mg/100 μ 1/鼠)；(2)铝佐剂组铝佐剂 +HlNl ； (3) YYH-Gl 组:YYH_G1+H1N1 ； (4) YYH-G4 组:YYH_G4+H1N1 ；注射前等体积混合，100 μ 1/鼠，右后肢肌肉注射。实验结果淫羊藿总多糖YYH-G经DEAE-纤维素柱层析分离，得到酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4，与甲型流感疫苗Hmi病毒裂解液配伍免疫，结果显示初次免疫后18天小鼠血清中具有较高Hmi病毒抗体滴度，YYH-Gl免疫剂量每只小鼠为0. 125-lmg、YYH-G4免疫剂量每只小鼠为0. 125-0. 5mg，均具有较高的佐剂活性，剂量组之间没有明显的差异，说明低剂量有效(图8-11)。实施例9淫羊蕾多糖组分的生物学试验室温下提取淫羊藿总多糖YYH-G (实施例2制备)经DEAE-纤维素柱层析，获得酸性多糖组分YYH-Gl和非糖组分YYH-G4。采用Hmi病毒裂解液为抗原测定两种糖组分的活性。具体方法如实施例8。结果显示室温提取的YYH-Gl和YYH-G4配伍Hmi抗原初次免疫即可产生较高滴度的抗体(图12)。尽管本发明的具体实施方式
已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
权利要求
1.淫羊藿多糖，其是通过如下方法获得的1)取淫羊藿叶，加入水浸泡，得到水提液；2)将步骤1)得到的水提液进行乙醇沉淀，取沉淀部分加入水中溶解，离心，取上清液进行透析；3)取透析所得的透析液进行冷冻干燥，得到淫羊藿多糖。
2.权利要求1的淫羊藿多糖，其特征在于如下的(1)-(12)项中的任意一项或多项(1)步骤1)中所述的淫羊藿叶，为未经提取的淫羊藿叶，或者经过有机溶剂例如石油醚、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正己烷、环己烷、正丁醇、乙醇或甲醇萃取后得到的残渣叶；(2)步骤1)中所用水为蒸馏水或去离子水；(3)步骤1)中，加入水浸提的温度为4 60°C，优选为20 60°C，更优选为20 50°C；(4)步骤1)中，将浸提后得到的淫羊藿叶按照相同条件进行一次或多次浸提，合并水提液；(5)步骤1)中水的用量为淫羊藿叶的5-20倍量(L/Kg)；(6)步骤1)中，浸提期间进行搅拌；(7)步骤1)中，将得到的水提液在50°C_55°C下进行减压浓缩，得到浓缩的水提液；(8)步骤2~)中，乙醇沉淀的条件是醇沉后乙醇的终浓度为60-80%，例如70-75%;优选地，醇沉的时间大于12小时，例如为48-72小时；(9)步骤幻中，将乙醇沉淀后离心得到的沉淀再进行一次或多次乙醇沉淀，合并上清液；(10)步骤幻中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000；(11)步骤2、中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；(12)步骤幻中，透析进行一次或多次；(13)步骤幻中，在冷冻干燥之前，将得到的透析液在50°C-55°C下进行减压浓缩。
3.一种淫羊藿多糖，或者权利要求1或2所述的淫羊藿多糖，其特征在于(1)含糖量为25-45%，例如35.60% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为5_20 %，例如 7.53% (以半乳糖醛酸计算)；和/或(2)其具有附图1和附图2所示的特征。
4.淫羊藿酸性多糖组分，其为权利要求1-3任一项所述的淫羊藿多糖经DEAE-纤维素柱层析，得到的利用硫酸-苯酚法显色、具有490nm波长吸收的0. 25mol/L NaHCO3洗脱部分。
5.一种淫羊藿酸性多糖组分，或者权利要求4所述的淫羊藿酸性多糖组分，其特征在于包含鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及半乳糖醛酸；以及， 其分子量为6000 20000。
6.权利要求5的淫羊藿酸性多糖组分，其特征在于，(1)含糖量为45-65%，例如58.93% (以葡萄糖计算)，糖醛酸含量为5_15 %，例如 8.40% (以半乳糖醛酸计算)；和/或(2)鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔比为鼠李糖岩藻糖阿拉伯糖木糖甘露糖葡萄糖半乳糖=1. 00 0. 33 4. 44 0. 38 0. 64 0. 8
7.淫羊藿非糖组分，其为权利要求1-3任一项所述的淫羊藿多糖经DEAE-纤维素柱层析，得到的具有^Onm吸收的0. 25mol/L NaHCO3洗脱部分。
8.一种淫羊藿非糖组分，或者权利要求7所述的淫羊藿非糖组分，其为淫羊藿多糖的非糖组分，其分子量为2000 10000。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-8任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分，以及药学上可接受的辅料。
10.一种疫苗佐剂，其包含权利要求1-8任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分。
11.一种疫苗制剂或疫苗组合物，其包含权利要求1-8任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分。
12.权利要求1-8任一项的淫羊藿多糖和/或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分用于制备疫苗佐剂、疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。
13.一种制备抗体的方法，其包括使用有效量的权利要求1-8任一项的淫羊藿多糖和/ 或淫羊藿酸性多糖组分和/或淫羊藿非糖组分的步骤。
全文摘要
本发明涉及淫羊藿的多糖提取物，具体地，本发明涉及从中药材淫羊藿叶中提取的淫羊藿总多糖及其其中的酸性糖组分和非糖组分，以及它们用于制备疫苗佐剂、疫苗制剂、疫苗组合物或抗体的用途。本发明还涉及包含所述淫羊藿总多糖及其组分的药物组合物、疫苗佐剂、疫苗制剂或疫苗组合物。
文档编号A61P37/04GK102464726SQ201110220409
公开日2012年5月23日 申请日期2011年8月3日 优先权日2010年11月5日
发明者刁玉林, 单俊杰, 朱婷, 武军华, 段丹丹, 王佩瑞, 王晨宇, 王玉霞, 贾培媛, 赵修南 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所