专利名称：血桐提取物的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然药物技术领域，具体涉及一种血桐提取物的制备方法及其应用。
背景技术：
结肠癌是人类高发恶性肿瘤，其发病率一直呈上升趋势，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位，其死亡率居恶性肿瘤死因的第二位。在我国，结直肠癌死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位，严重危害人类健康。各国政府，研究机构和制药公司均对抗结肠癌药物给予高度重视并进行巨额投资。目前，世界公认的最有价值的治癌药物为紫杉醇，它是红豆杉属植物中的一种复杂的此生代谢产物，从红豆杉树皮中分离提取物，其在树皮中含量仅万分之一，现有资源还无法摆脱依赖天然资源的现状。全世界约有11种红豆杉，主要分布在北半球温带和亚热带，我国有4个品系和1个变种。其中，除浆果红豆杉、加拿大红豆杉和杂交品种的曼地亚红豆杉外，其余红豆杉生产缓慢，需100多年才能成树，并且资源极少，属不可再生资源。因此，紫杉醇药物资源匮乏，价格昂贵，国内紫杉醇主要依赖进口，不利于向广大患者推广。血桐，拉丁命名(ifecara/？识tanarius (L. ) Muell. )，为莲叶桐科植物莲叶桐的叶或种子，以播种法繁殖，其繁殖力强，生长快速，种子落地常自生，在中国的广东、 福建和台湾均有分布。因此，针对现有技术中的不足，亟需解决现有治癌药物紫杉醇资源匮乏、价格昂贵的缺陷，而提供一种原料来源丰富、制备工艺简单的具有抗结肠癌活性的血桐提取物的制备方法。
发明内容
本发明的目的之一为了解决现有治癌药物紫杉醇资源匮乏、价格昂贵的缺陷，提供一种原料来源丰富、制备工艺简单的血桐提取物的制备方法。本发明的另一目的在于提供上述血桐提取物的应用，由本发明的制备方法得到的血桐提取物作为治疗结肠癌的抗癌药物的有效成分，可用于制备抗结肠癌药物。本发明的目的通过下述技术方案实现
提供一种血桐提取物的制备方法，包括有以下步骤
步骤一，取自然晾干的血桐树叶经100°c烘干，然后粉碎、过筛后获得血桐树叶粉； 步骤二，取步骤一获得的血桐树叶粉放入烧杯中，每IOOg血桐树叶粉加入1000 2000ml的蒸馏水，然后搅拌、常压下加热煮沸，沸腾后继续煎煮1 2小时，再经过八层医用纱布过滤后获得血桐提取物第一滤液和第一滤渣；
步骤三，将步骤二获得的第一滤渣重复操作步骤二两次，依次获得血桐提取物第二滤液、第二滤渣以及血桐提取物第三滤液和第三滤渣；
步骤四，合并所述血桐提取物第一滤液、血桐提取物第二滤液以及血桐提取物第三滤液，然后将滤液减压蒸馏浓缩至浸膏保存备用，即得血桐提取物。
其中，所述步骤二中，取步骤一获得的血桐树叶粉200g放入3000ml的烧杯中，加入2000ml蒸馏水，然后搅拌、常压下加热煮沸，沸腾后继续煎煮1小时，再经过八层医用纱布过滤后获得血桐提取物第一滤液和第一滤渣；
其中，所述步骤二中，取步骤一获得的血桐树叶粉200g放入3000ml的烧杯中，加入 2000ml蒸馏水，然后搅拌、常压下加热煮沸，沸腾后继续煎煮2小时，再经过八层医用纱布过滤后获得血桐提取物第一滤液和第一滤渣。其中，步骤一中，所述的过筛为过40目的筛网。本发明还提供由上述制备方法制得的血桐提取物的应用，它作为治疗结肠癌的抗癌药物的有效成分。本发明的有益效果
本发明的血桐提取物的制备方法，是直接从血桐树叶中制备的血桐提取物，原料血桐在中国的广东、福建和台湾均有分布，其来源丰富、繁殖力强、生长快速，因此制备的血桐提取物价格低廉，可有效降低生产成本。通过本发明的方法制备的血桐提取物，作为治疗结肠癌的抗癌药物的有效成分， 对于抗结肠癌具有抑制肿瘤生长、分解肿瘤细胞的效果，具有稳定、可靠、治愈快的特点。与现有技术的紫杉醇相比，还具有制备工艺简单、易操作的优点，特别适宜于大规模的工业化生产，从而利于向众多病患者推广，使更多患者得到救治。
图1为本发明的实施例1中正常对照组人结肠癌LoVo细胞的形态图。图2为本发明的实施例1中受试药物高剂量组人结肠癌LoVo细胞的形态图。图3为本发明的实施例1中受试药物低剂量组人结肠癌LoVo细胞的形态图。图4为本发明的实施例1中阳性药物对照组人结肠癌LoVo细胞的形态图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1
本发明的血桐提取物的制备方法的实施例1，包括有以下步骤 步骤一，取自然晾干的血桐树叶经100°c烘干，然后粉碎、过筛后获得血桐树叶粉； 步骤二，取步骤一获得的血桐树叶粉放入烧杯中，每IOOg血桐树叶粉加入1000 2000ml的蒸馏水，然后搅拌、常压下加热煮沸，沸腾后继续煎煮1 2小时，再经过三层医用纱布过滤后获得血桐提取物第一滤液和第一滤渣；
步骤三，将步骤二的第一滤渣重复步骤二两次，依次获得血桐提取物第二滤液、第二滤渣以及血桐提取物第三滤液和第三滤渣；
步骤四，合并血桐提取物第一滤液、血桐提取物第二滤液以及血桐提取物第三滤液，然后将滤液减压蒸馏浓缩至浸膏保存备用，即得血桐提取物。具体的，上述步骤一中，过筛为过40目的筛网。将血桐提取物进行以下实验一、人结肠癌LoVo细胞培养及分组 1.人结肠癌LoVo细胞培养
取人结肠癌LoVo细胞培养，培养液为含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，37°C、5%C02 条件下培养，待细胞长满瓶底，消化后，倒掉培养液，用PBS液轻轻荡洗1 2次，加入浓度 0. 25%的胰蛋白酶液，消化lmin，再加入5 ml含胎牛血清(FBS)的DMEM培养液终止消化， 用吸管轻轻吹打，使细胞分散开，移入离心管进行离心800r/min离心％iin，弃上清液，加入含胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，使细胞重悬，吸取少量细胞滴入记数板并在倒置相差显微镜下观察、计数，将细胞以IX IO5个/ml的密度接种于96孔培养板，继续培养，待细胞长满单层，即可用于实验。2. 人结肠癌LoVo细胞分组
吸掉培养板上的培养液，用PBS液洗涤细胞1次，进行分组
1)正常对照组
换入100 μ 1的PBS (含FBS培养基)；
2)受试药物高剂量组(药液中药物浓度0.5mg浸膏/ml) 换入0. 5mg浸膏/ml浓度的药液100 μ 1 ；
3)受试药物低剂量组(药液中药物浓度0.125 mg浸膏/ml) 换入0. 125 mg浸膏/ml浓度的药液100 μ 1 ；
4)阳性对照组
换入100 μ 1的50 μ mol/L氟尿嘧啶。将上述四组培养液于37°C、5%C02饱和湿度的CO2培养箱内孵育4小时，吸弃上清液，用PBS液洗涤2次，然后各组分别换入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，继续培养， 24h后观察细胞形态及用MTT法进行细胞活力的检测。二、显微镜观察细胞形态
如图1至图4所示，倒置相差显微镜下观察显示
正常对照组的细胞生长旺盛，形状呈梭形、三角形，胞体大，呈高折光率，随时间延长变化不大(见图1)。受试药物高剂量组、低剂量组及阳性对照组的细胞的突起减少或消失，细胞肿胀变圆，折光率下降，部分细胞裂解成碎片(见图2、图3及图4)。由此说明本发明的血桐提取物可以改变人结肠癌LoVo细胞的细胞形态，抑制其生长，并且这种抑制作用呈现出量-效关系。三、细胞活力检测(MTT法)
细胞复氧24h后，向96孔培养板内每孔加入5mg/ml的MTT溶液15 μ 1，继续孵育4h 后终止培养，小心吸弃孔内的培养上清液，每孔加入150μ 1 二甲基亚砜(DMS0)，于37°C振荡lOmin，使紫色结晶物充分溶解，然后通过酶标仪测定492nm波长处的吸收值(A)。抑制率=(A对照组一A药物组)/A对照组X 100% 。四、统计学分析
数据以平均值士标准差(
士 s)表示，使用SPSS13. O统计软件进行方差分析，组间差异采用单因素方差分析，若方差齐全，两两比较采用LSD法，P ^ 0. 05认为有显著性差异。
结果见表1。表1血桐提取物对人结肠癌LoVo细胞活力的影响(n=20)
权利要求
1.血桐提取物的制备方法，其特征在于包括有以下步骤步骤一，取自然晾干的血桐树叶经100°c烘干，然后粉碎、过筛后获得血桐树叶粉； 步骤二，取步骤一获得的血桐树叶粉放入烧杯中，每IOOg血桐树叶粉加入1000 2000ml的蒸馏水，然后搅拌、常压下加热煮沸，沸腾后继续煎煮1 2小时，再经过八层医用纱布过滤后获得血桐提取物第一滤液和第一滤渣；步骤三，将步骤二获得的第一滤渣重复操作步骤二两次，依次获得血桐提取物第二滤液、第二滤渣以及血桐提取物第三滤液和第三滤渣；步骤四，合并所述血桐提取物第一滤液、血桐提取物第二滤液以及血桐提取物第三滤液，然后将滤液减压蒸馏浓缩至浸膏保存备用，即得血桐提取物。
2.根据权利要求1所述的血桐提取物的制备方法，其特征在于所述步骤二中，取步骤一获得的血桐树叶粉200g放入3000ml的烧杯中，加入2000ml蒸馏水，然后搅拌、常压下加热煮沸，沸腾后继续煎煮1小时，再经过八层医用纱布过滤后获得血桐提取物第一滤液和第一滤渣。
3.根据权利要求1所述的血桐提取物的制备方法，其特征在于所述步骤二中，取步骤一获得的血桐树叶粉200g放入3000ml的烧杯中，加入2000ml蒸馏水，然后搅拌、常压下加热煮沸，沸腾后继续煎煮2小时，再经过八层医用纱布过滤后获得血桐提取物第一滤液和第一滤渣。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的血桐提取物的制备方法，其特征在于步骤一中，所述的过筛为过40目的筛网。
5.血桐提取物的应用，其特征在于权利要求1至4任意一项制备方法制得的血桐提取物，它作为治疗结肠癌的抗癌药物的有效成分。
全文摘要
本发明涉及天然药物技术领域，具体涉及一种血桐提取物的制备方法及其应用，制备方法包括取自然晾干的血桐树叶经100℃烘干，然后粉碎、过筛后获得血桐树叶粉；每100g血桐树叶粉加入1000～2000ml的蒸馏水，然后搅拌、常压下加热煮沸，沸腾后继续煎煮1～2小时，再经过八层医用纱布过滤后获得血桐提取物第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣重复上述操作两次，获得血桐提取物第二滤液、血桐提取物第三滤液；合并血桐提取物第一滤液、血桐提取物第二滤液和血桐提取物第三滤液，然后将滤液减压蒸馏浓缩至浸膏。本发明的血桐提取物对抗结肠癌有明显的治疗效果，且原料来源丰富，提取工艺简单，易形成规模化生产，利于向众多病患者推广。
文档编号A61P35/00GK102302526SQ20111027798
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者何带桂, 周代营, 张焜, 温桂萍, 赵肃清, 郑杰, 陈伟强 申请人:广东工业大学, 广东瀚森生物药业有限公司