专利名称：一种含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物及制备方法
技术领域：
本发明涉及医疗器械领域，特别涉及一种含神经营养因子人工神经移植物及其制备方法。
背景技术：
现实社会中交通事故、工伤事故、运动意外及临床手术等事件均会造成周围神经损伤，临床上但当中长距离的神经缺损不能依靠端对端的缝合来弥补神经缺失时，就不得不依靠移植物来桥接修复。近年来，基于生命科学与工程学的原理和技术发展起来的组织工程学为构建神经移植替代品提供了一条新的出路。采用组织工程技术修复神经损伤的研究主要集中在设计和构建新的组织工程神经桥接装置，目前这类桥接物通常是单独采用生物材料，通过将其加工成管状结构的神经引导通道，为神经的再生提供适当的空间和引导作用。但对于长距离、粗大神经缺损，这类单纯由生物材料组成的导管由于缺乏神经营养因子等微环境物质的支持，取得的修复效果非常有限。这可能是因为长距离神经缺损修复早期，神经断端内细胞分泌的神经营养因子有限，难以在长距离或较粗的神经导管中发挥作用。神经营养因子(NTF)是一组超出普通维持生存所必须的基本营养物质以外的、对神经细胞起特殊营养作用的多肽分子。研究表明神经营养因子在胚胎发育、细胞分化、创伤愈合、免疫调节及肿瘤发生等方面都发挥着重要的生物学调节作用。各种NTF因子在单独发挥作用的同时，还通过相互促进和协同作用产生放大效应，使它们在体内发挥出更大的生物学活性。这些神经营养因子包括神经生长因子(NGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、神经营养素_3 (NT-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-4 (NT-4)、胶质细胞源性神经营养因子(⑶NF)等。现有研究表明，在神经缺损修复中需要生物微环境如神经营养因子等物质的作用，这提示人工神经移植物上含有一定浓度的神经营养因子，将能够提高缺损神经的修复效果，尤其是对长距离、粗大神经缺损。因此，理想的组织工程人工神经移植物应该包含支架材料、神经营养因子和种子细胞三部分，其中要求具有良好的生物相容性和生物降解吸收功能，并具备适宜的机械性能、三维结构和一定的通透性；神经营养因子应具有合适浓度、良好释放率和尽量长的释放时间。目前用于人工神经移植物材料一类是自体非神经组织，如静脉导管，但其机械强度不够，易于塌陷。另一类包括(1)不可降解吸收材料，如硅胶管、聚四氟乙烯等，这些材料不能够被人体吸收，长时间存在可引起慢性的异物反应，对再生的神经造成损伤；(2)可降解吸收材料，如聚乳酸、聚乙烯酸、壳聚糖等。壳聚糖为一种天然高分子聚合物，具有稳定的化学性质，有着良好的生物相容性，安全无毒，还具有抗凝血等多种生物活性和优良的抗菌性，且容易获得。有文献公开了应用壳聚糖神经导引管作为神经再生室桥接大鼠坐骨神经缺损，结果表明壳聚糖神经导引管为大鼠坐骨神经再生提供一个良好的再生微环境，再生坐骨神经功能恢复良好(于炎冰等，壳聚糖导管桥接周围神经缺损的实验研究，中华神经外科杂志，2000，Vol. 16，No. 6, P375-378)。中国专利99123745. 5公开了一种用于神经修复的导管，主要由壳聚糖、明胶、戊二醛、醋酸、氢氧化钠、多聚赖氨酸组成。但是作为交联剂的戊二醛具有一定的毒性。随着人工神经移植物材料研究的逐渐成熟和完善，在材料上固定神经生长因子这方面的研究逐步成为神经再生领域的一个研究热点。中国专利01136314. 2，公开了一种引导和促进神经有效再生的脱乙酰度为15-45%的甲壳质生物套管，该套管管壁上还可以进一步包括0. 3%-3%的海藻盐和5-10% 的促神经生长因子药物。但是该法制得的套管缺乏丰富的能提供神经轴突攀附生长的管道。中国专利20041009259. 9公开了一种由壳聚糖外管壁和具有轴向多通道的生物来源填充基质组成的神经组织工程管状支架，该支架具有7 50的轴向通道，通道内径为200 500 μ m，各通道间具有相互连通的微孔。但该法需要将多根一定直径的不锈钢针平行贯穿固定在壳聚糖管内，步骤繁琐且产品孔径较大，神经导管抗拉强度有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物及其制备方法。本发明的技术解决方案是
一种含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物，包括壳聚糖人工神经移植物支架和神经营养因子，其特征在于所述壳聚糖人工神经移植物支架管腔内分布有丰富的孔隙，促进神经再生的神经营养因子均勻吸附固定在支架管腔内外表面以及管腔内的孔隙表面。上述壳聚糖人工神经移植物支架为孔隙率为50%_90%且孔径为IOMm-IOOMm的具有多孔结构抗拉强度高的神经导管。支架内径为0. 5-8mm，壁厚0. l_3mm。上述壳聚糖人工神经移植物支架不含有发泡剂和/或交联剂。本发明所述壳聚糖人工神经移植物支架吸附固定的神经营养因子是碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3( NT-3 )、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )中的一种或几种。本发明还提供了一种所述壳聚糖人工神经移植物支架的制备方法，步骤包括
(1)将弱酸溶解壳聚糖得到浓度为3%-6%的溶液，将溶液倒入模具，置于-60°c-90°C， 冷冻2-4小时；
(2)将冷冻后壳聚糖冰体置于碱性溶液中和固定，用水清洗；
(3)对步骤(2)得到的定型的壳聚糖冷冻干燥，得到具有多孔结构、抗拉强度高的壳聚糖神经移植物支架；
(4)将壳聚糖神经移植物支架浸泡在神经营养因子溶液中，利用材料表面丰富的孔隙吸附固定神经营养因子。上述步骤得到的吸附有神经营养因子的神经移植物支架可直接进行使用，或者还可以将其进一步进行冻干，便于长期保存和运输使用。上述壳聚糖人工神经导管通过将壳聚糖用弱酸溶解、注模、冷冻成型、中和固定、 清洗、冷冻干燥工艺，将壳聚糖加工成具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管。在制造过程中，可以通过改变壳聚糖溶液的浓度来调节导管管壁的孔隙率，壳聚糖溶液浓度越高，所得到的产品越致密，孔隙率越低；通过改变冷冻成型温度调节所生成的冰晶大小以控制壳聚糖导管管壁的孔径，冷冻温度越低，生成冰晶越小，所得产品孔径就越小。此外可通过改变壳聚糖的脱乙酰化程度以控制导管的降解速度，脱乙酰化程度越高，导管降解速度越快。上述壳聚糖人工神经导管的制备方法使用的弱酸是醋酸、磷酸、柠檬酸、乳酸中的任意一种或几种。将本发明所述壳聚糖人工神经导管预先称重后浸泡于已知浓度和体积的市售神经营养因子产品溶液(例如30yg/2ml的NGF溶液)中，用常规神经营养因子ELISA方法检测并计算浸泡液中残留的神经营养因子的量，可计算得到吸附固定在神经导管上的神经营养因子的量。通过浸泡时间控制本发明产品每克神经导管上吸附神经营养因子的量为 1 μ g-10mgo使用扫描电镜检测本发明所述人工神经移植物支架孔径为lOMffl-lOOMffl。采用常规乙醇浸泡法测定本发明所述人工神经移植物支架孔隙率为50%_90%。本发明产品具有稳定的结构，合适的孔径、孔隙率及通透性，能够模拟正常神经结构，能够提供轴突攀附生长的管道及神经营养因子，并且可以承载利于神经修复和再生的细胞，本发明的产品含神经营养因子，所用壳聚糖材料为天然可降解性材料，与人体有着良好的生物相容性，制得的产品不含有由制备工艺带入的外源性毒、副作用的发泡剂和交联剂。由于本发明导管管壁具有相对于现有技术公开的神经导管更小的孔径和更高的孔隙率和比表面积，使得本发明所述导管具有更好的抗拉强度且能够更好的吸附神经营养因子， 更有利于输送神经细胞生长过程所需的营养物质，给神经细胞提供良好的生长环境。使用效果好。本发明利用控制壳聚糖溶液浓度和冷冻温度来控制神经导管孔隙率和孔径，方法简便易行，此外，可将制备好的神经导管浸泡吸附固定神经营养因子直接用于手术，或者将制备好的神经导管浸泡在神经营养因子溶液中吸附固定，再进行冻干，便于长期保存和运输，使用方便。由于神经营养因子为活性蛋白或肽类，很容易受到环境影响而失去活性，本发明将现有技术中将神经营养因子溶液加入到制备神经导管的材料中进行制模成型改为先制备好神经导管，再浸泡吸附固定，这能够更好的保证神经营养因子的活性。通过将本发明产品在体外与神经组织细胞联合培养，经形态观察、酶代谢活力测定、神经生长因子的测定，显示该产品具有良好的生物相容性。在大鼠动物体内使用该产品修复坐骨神经1厘米距离缺损，结果表明该产品能有利于神经再生，导致恢复损伤神经功能的恢复，同时该产品具有很好的组织相容性。下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
。实施例1
用浓度为0. 5%的乳酸溶解壳聚糖得到壳聚糖的浓度为3%溶液。然后将溶液注入模具，经-60°C冷冻预成型后，将材料退出模具，放入5%氢氧化钠溶液，中和材料中的酸，固定成型后，用蒸馏水将过量的碱及生成的盐清洗干净后，放置到15yg/ml的神经生长因子 (NGF)溶液中，利用材料表面丰富的孔隙固定30分钟。然后经冷冻干燥得到含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物，孔隙率89%，平均孔径为87-98 μ m。实施例2
用浓度为8%的醋酸溶解壳聚糖得到壳聚糖的浓度为5%溶液。然后将溶液注入模具，经-80°C冷冻预成型后，将材料退出模具，放入到10%碳酸钠溶液中，中和材料中的酸固定成型后，用蒸馏水将过量的碱及生成的盐清洗干净后，然后经冷冻干燥得到壳聚糖人工神经移植物。在使用前，将壳聚糖人工神经移植物放置到20μ g/ml碱性成纤维生长因子 (bFGF)溶液中，利用材料表面丰富的孔隙固定1小时。然后经冷冻干燥得到含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物，孔隙率77%，平均孔径为55-67 μ m。
实施例3
用浓度为2%的磷酸溶解壳聚糖得到壳聚糖的浓度为6%溶液，然后将溶液注入模具， 经-90°C冷冻预成型后，将材料退出模具，放入到5%氢氧化钠溶液中，中和材料中的酸固定成型后，用蒸馏水将过量的碱及生成的盐清洗干净后，然后经冷冻干燥得到壳聚糖人工神经移植物。在使用前，将壳聚糖人工神经移植物放置到20 μ g/ml脑源神经营养因子(BDNF) 溶液中，利用材料表面丰富的孔隙固定2小时。然后经冷冻干燥得到含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物，孔隙率53%，平均孔径为11-23 μ m。
权利要求
1.一种含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物，包括壳聚糖人工神经移植物支架和神经营养因子，其特征在于所述壳聚糖人工神经移植物支架管腔内分布有丰富的孔隙，促进神经再生的神经营养因子均勻吸附固定在支架管腔内外表面以及管腔内的孔隙表面。
2.如权利要求1所述壳聚糖人工神经移植物，其特征在于所述壳聚糖人工神经移植物支架为孔隙率为50%_90%且孔径为IOMffl-IOOMffl的具有多孔结构抗拉强度高的神经导管。
3.如权利要求2所述壳聚糖人工神经移植物，其特征在于所述壳聚糖人工神经移植物支架内径为0. 5-8mm，壁厚0. l_3mm。
4.如权利要求1所述壳聚糖人工神经移植物，其特征在于所述壳聚糖人工神经移植物支架不含有发泡剂和/或交联剂。
5.如权利要求1-4任一项所述壳聚糖人工神经移植物，其特征在于所述神经营养因子是碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3( NT-3 )、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胶质细胞源神经营养因子(⑶NF )中的一种或几种。
6.如权利要求5所述壳聚糖人工神经移植物，其特征在于所述神经营养因子在神经移植物支架材料上的量为1 μ g/g-10mg/g。
7.—种如权利要求1所述壳聚糖人工神经移植物支架的制备方法，步骤包括(1)将弱酸溶解壳聚糖得到浓度为3%-6%的溶液，将溶液倒入模具，置于_60°C-90°C， 冷冻2-4小时；(2)将冷冻后壳聚糖冰体置于碱性溶液中和固定，用水清洗；(3)对步骤(2)得到的定型的壳聚糖冷冻干燥，得到具有多孔结构、抗拉强度高的壳聚糖神经移植物支架；(4)将壳聚糖神经移植物支架浸泡在神经营养因子溶液中，利用材料表面丰富的孔隙吸附固定神经营养因子。
8.如权利要求7所述壳聚糖人工神经移植物支架的制备方法，其特征在于将吸附固定有神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物进一步进行冻干。
9.如权利要求7所述壳聚糖人工神经移植物的制备方法，其特征在于所述弱酸是醋酸、磷酸、柠檬酸、乳酸中的一种或几种。
全文摘要
本发明公开了一种含神经营养因子的壳聚糖人工神经移植物及制备方法，壳聚糖人工神经移植物是在不添加任何发泡剂、交联剂的情况下，通过弱酸溶解、注模、冷冻成型、中和固定、清洗、冷冻干燥等工艺，将壳聚糖加工成具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管。在神经导管中含有治疗作用的细胞因子是碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)等中的一种或多种。本发明的产品含神经营养因子，所用材料均为可降解性材料，与人体有着良好的生物相容性。制得的产品不含有由于制备工艺带入的外源性毒、副作用物质。
文档编号A61L27/20GK102343112SQ20111030266
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者丁斐, 张添, 杨宇民, 顾晓松 申请人:江苏益通生物科技有限公司