专利名称：季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属于生物疫苗制备领域，涉及利用经检定证明为WHO推荐的病毒株或相似株的 Hmi 型IVR-148 ；H3N2 型NYMC X-175C ；B 型B/Florida/412006 流感病毒株制备用于预防季节性流感的流感病毒裂解疫苗的新工艺。
背景技术：
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要通过感染者含有病毒的飞沫以气溶胶的形式传染给易感者，具有高度传染性，容易引发大规模流行。上一世纪以来已先后发生四次全球流感大流行，流感大流行具有发病率和病死率高，传播迅速和波及范围广的特点。仅1918年“西班牙”流感的大流行就导致至少2000万人死亡，超过第一次世界大战的死亡人数。流感流行带来了巨大的疾病负担，造成了较严重的社会影响。据2002年世界卫生组织公布的数据，估计全球每年流感病例达6亿 12亿。 我国是流感的多发地，每年流感发病数估计可达上千万人。1957年、1968年和1977年三次大流行毒株均首发于我国。1997年在中国香港特别行政区人群中发现禽流感H5W感染病例。1988年以来，世界卫生组织每年公布的流感疫苗病毒株约一半来自中国。中国已成为世界流感监测的前哨。研究表明流感病毒是一种很容易变异的病毒，当变异达到一定程度，从而导致一种新的流感病毒产生时，因人类不具备相应的抗体，而易引发大流行。流感病毒属于正黏病毒科，典型毒粒呈球形，直径约为80-120nm，病毒最外部为病毒包膜，病毒包膜由基质蛋白、双层类脂膜和糖蛋白突起所组成。包膜内部为核衣壳，核衣壳包裹着病毒的遗传物质一一单股负链RNA，其RNA共分为8个节段。基因组分节段是造成同型不同毒株间易产生基因重配的主要原因。且病毒的RNA聚合酶不具有纠错功能，所以病毒基因易发生变异。若两种不同亚型毒株感染同一个细胞，使其基因组发生重新排列， 可引起抗原转变，导致新亚型的出现。另外，由于基因组自发的点突变，常引起抗原漂移。根据流感病毒核蛋白NP和膜蛋白Ml抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒可分为A、B、C三型。A型流感病毒根据其表面血凝素和神经氨酸酶结构及其基因特性的不同又分为许多亚型，目前已发现的血凝素有15个亚型(Hl 15)，神经氨酸酶有9个亚型 (Ni 9)，它们均为位于病毒表面的糖蛋白，其中血凝素Hl 3亚型和神经氨酸酶m 2 亚型的流感病毒常见于人类感染。对于流感疫苗的研制，全世界进行开发的疫苗类型包括全病毒型、裂解型、亚单位型。佐剂包括有氢氧化铝、MF59。主要免疫途径是肌肉注射。目前经过WHO认可的工艺流程制备的疫苗主要有传统的全病毒灭活疫苗、病毒裂解疫苗和新一代的亚单位疫苗及减毒活疫苗。在以往的流感疫苗研制过程中，不少科学研究者求助于基因工程疫苗如重组疫苗、 多肽疫苗、核酸疫苗的研究，然而该种疫苗较低的免疫原性与保护率限制了其应用。基于目前防控新型流感疫情的需要，世界各国的研究单位仍主要致力于这三种传统疫苗的制备。裂解型流感灭活疫苗是在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，经过不同的生产工艺去除裂解剂和纯化有效抗原成分制备而成的。按照历史上流感大流行的规律，理论上最近几年应该进行这方面的准备，因此从 WHO到国际上许多国家如美、欧等都在进行从策略上到技术上的准备。包括疾病的监测及预警、医疗能力的储备包括抗病毒药物的储备等；疫苗部分包括生产能力的评估、资源的充分利用、生产用毒株的可用性、生产周期、大流行疫苗的注册即国家管理部门系统的准备、疫苗的储备及供应等等。中国是一个流感大国，参照国际上的信息及我国具体情况，国家也制定出的应对流感大流行的策略和措施。其中生产技术的储备，提高生产流感疫苗能力是必不可少的重要部分。目前国内的生产能力要在大流行时提供足够的疫苗还有很大差距，因此我公司对流感病毒裂解疫苗的研发具有较高的社会意义。我国绝大多数流感病毒疫苗厂家的产品中添加硫柳汞防腐剂，本发明研制的流感病毒裂解型疫苗，不含硫柳汞防腐剂，其采用更为安全的2-苯氧乙醇作为防腐剂。另外由于本发明采用了复合裂解剂和新的纯化工艺，最终制备得到了杂质含量更少、HA含量更高的卵清蛋白、内毒素含量、总蛋白含量等质量指标远低于国家标准的流感病毒裂解疫苗。临床前动物试验结果表明，采用本发明的方法制备得到的流感病毒裂解型疫苗免疫原性高， 具有较好的安全性。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种副反应更小，免疫原性更高，接种更安全，接种人群更广泛的新季节性流感裂解疫苗。本发明的另一目的是提供一种能高效低成本大量制备上述季节性流感裂解疫苗的制备方法。本发明的季节性流感裂解疫苗包括季节性流感免疫抗原及疫苗佐剂，其中流感免疫抗原为WHO推荐并经国家药品管理部门认可的Hmi型IVR-148 ；H3N2型NYMC X-175C ； B型B/Florida/412006流行性感冒病毒株或相似株毒种的血凝素HA，各型HA含量为30 36ug/ml，所述的疫苗佐剂为氢氧化铝。本发明的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法包括按顺序实施的建立病毒种子批、接种与培养病毒、收获病毒、对病毒进行灭活处理、超滤浓缩、离心纯化、柱层析纯化、裂解病毒、二次纯化、过滤除菌、半成品配制的步骤，其特征在于，其中的离心纯化步骤采用的是蔗糖速率区带离心法，包括将浓缩后的病毒液以不超过离心腔容积50%的上样量，在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心3小时；其中的建立病毒种子批步骤包括(1)主代种子库建立由索取的原始毒种传代制备，将毒种复溶并稀释，取稀释度为IO3 IO5的病毒液接种9 11日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0. 2ml/胚，33 35°C培养48 72小时后收获尿囊液并混合，加等量脱脂牛奶后分装为0. 2ml/支冻干后保存于-60°C以下，经检定合格即为主代种子批；自原始毒种到制成主代毒种传代不得超过2代；(2)工作种子库建立由主种子批毒种传代制备，将主代种子复溶，取稀释度为IO3 IO5的病毒液接种9 11日龄 SPF鸡胚尿囊腔，接种量0. 2ml/胚，33 35°C培养48 72小时后收获尿囊液并混合，分装后冻存于-60°C以下，经检定合格即为工作种子批，自主代毒种到制成工作种子传代不得超过2代。在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心3小时后，将收集的病毒液用截留分子量为 300KD的超滤膜进行超滤透析，以去除蔗糖，然后再进行接下来的柱层析步骤。二次纯化包括蔗糖密度梯度离心和超滤浓缩步骤，蔗糖密度梯度离心包括将病毒裂解物以不超过离心腔容积50%的量上样，在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心2小时。二次纯化中的超滤浓缩步骤是将收集的离心后的裂解物用IOKD的超滤膜进行超滤浓缩，以去除蔗糖和进一步去除裂解剂。采用Triton X-100和去氧胆酸钠裂解病毒，Triton X-100及去氧胆酸钠的终浓度均为0. 3%，裂解过程持续60 150分钟。用甲醛进行灭活处理，将病毒尿囊液加入终浓度为0. 02%的甲醛，置2 8°C条件下灭活16 M小时。灭活后的收获液用截留分子量为300KD的超滤膜超滤浓缩30-50倍，浓缩液取样进行细菌内毒素含量。柱层析采用 kphroSe-4FF凝胶层析纯化，洗脱液为0. 01mol/L的PBS，收集第一峰。本发明的方法制备得到的疫苗不含硫柳汞防腐剂，其中的卵蛋白含量为不高于300ng/ml，内毒素含量为小于 20EU/ml，其中的病毒是 Hmi 型IVR_148 ；H3N2 型NYMC X-175C ；B 型B/Florida/412006 流感病毒株，来源于英国国立生物制品研究所。单价原液检定一般包括(1)鉴别试验用相应(亚)型特异性免疫血清进行单向免疫扩散试验，应产生特异性沉淀反应， 证明样品的抗原性与推荐病毒株一致。(2)无菌检查按《中国药典》三部2010版附录XII A “无菌检查法”测定，符合规定。(3)病毒灭活验证试验将灭活后供试品按原倍、1 10和1 100稀释后分组接种于9 11日龄鸡胚尿囊腔中，每胚接种0. anl，每个稀释度接种10个鸡胚，置33 35°C培养72小时。M小时内死亡的不计数，每组鸡胚至少存活80%。自存活鸡胚中每胚取0. 5ml尿囊液，按组混合后， 再盲传一代，每组接种于9 11日龄鸡胚尿囊腔中，每胚0. anl，每个稀释度接种10个鸡胚，置33 35°C培养72小时，取尿囊液直接进行血凝试验，结果应不出现血凝反应。(4)血凝素含量采用单向免疫扩散法测定，各型原液的血凝素含量均应不低于90μ g/ml。制备含病毒标准血清的1. 5%琼脂糖凝胶板，打孔(孔径为2. 5 3mm)，将标准抗原和待检样品每孔分别加入10 μ 1，置20 25°C扩散至少18小时，用PBS浸泡1小时后干燥、染色、脱色。 准确测量标准抗原和待检样品所形成的沉淀环直径，以标准抗原形成的沉淀环的直径对其相应抗原含量进行直线回归，求出直线回归方程，代入供试品的沉淀环直径，即可得到原液血凝素的含量。(5)蛋白质含量按《中国药典》三部2010版附录VI B “蛋白测定法(Lowry法)”测定，应不高于疫苗血凝素含量4倍。半成品检定包括(1)无菌检查按《中国药典》三部2010版附录XII A “无菌检查法”测定，符合规定。(2)血凝素含量
各型流感毒株血凝素含量应为配制量的80% 120%。(3)蛋白质含量按《中国药典》三部2010版附录VI B “蛋白测定法(Lowry法)”测定，应不高于 350 μ g/ml，且不超过疫苗血凝素含量4倍。(4)卵清蛋白含量采用酶联免疫法进行检测，应不高于300ng/ml。(5) Triton X-100 残留量Triton X-100残留量应不高于260 μ g/ml。用反相高效液相色谱检测Triton x-100残留量(6)去氧胆酸钠残留量去氧胆酸钠残留量应不高于100 μ g/ml。将供试品与去氧胆酸钠标准溶液置酸性条件下，于387nm波长处测定A值，采用对照品法计算供试品中去氧胆酸钠的残留量。成品检定包括(1)鉴别试验用相应(亚)型特异免疫血清进行单向免疫扩散试验，应产生特异性沉淀反应，证明样品的抗原性与推荐病毒株一致。(2)外观检查为无色或微乳白色液体，无异物。(3)装量按《中国药典》三部2010版附录V F “最低装量检查法”检查，应不低于标示量。(4)pH 值按《中国药典》三部2010版附录V A “pH值测定法”测定，应为6. 8-8. 0。( 游离甲醛含量按《中国药典》三部2010版附录VI L “游离甲醛测定法”测定，应不高于30 μ g/ ml ο(6)血凝素含量各型流感毒株血凝素含量应为配制量的80% 120%。(7)蛋白质含量按《中国药典》三部2010版附录VI B “蛋白测定法(Lowry法)”测定，应不超过 350 μ g/ml，且不超过疫苗血凝素含量的4倍。(8)卵清蛋白含量采用酶联免疫法进行检测，卵清蛋白含量应不高于300ng/ml。(9) 2-苯氧乙醇含量采用液相色谱法，2-苯氧乙醇含量应为5 士 ang/ml。(10)无菌检查按《中国药典》三部2010版附录XII A “无菌检查法”测定，符合规定。(11)细菌内毒素检查按《中国药典》三部2010版附录XII E “细菌内毒素检查法”测定，应小于20EU/ ml ο
(12)异常毒性检查按《中国药典》三部2010版附录XII F “异常毒性检查法”检查，应符合规定。(13)抗生素残留量采用酶联免疫法，抗生素残留量不高于20ng/剂。与现有技术相比，本发明的制备方法具有以下优点1、将区带离心纯化和分子筛层析柱纯化进行组合，同时在病毒裂解后进行包括区带离心纯化步骤的二次纯化，通过上述纯化步骤的组合，本领域技术人员在相对简陋的实验条件下能够制备得到杂质更少，HA含量更高的裂解疫苗。2、本品纯度高，内毒素、卵清蛋白标准远远优于《中国药典》2010版及《欧洲药典》 的要求。3、浓缩效率及回收率好，成本低，效率高，操作容易。4、采用复合裂解剂，裂解更完全，有效保护抗原。5、病毒滴度高，平均1. 5个鸡胚就能生产出1人份疫苗。
具体实施例方式实施例1(1)选取菌种用 HlNl 型IVR-148 ；H3N2 型NYMC X-175C ；B 型B/ Florida/412006流感病毒株，来源于英国国立生物制品研究所。(2)鉴定毒种a)材料①将菌种在鸡胚中传二代(P》。②血清禽流感病毒Hmi型IVR_148 ； H3N2型NYMC X-175C ；B型B/Florida/412006流感病毒株，来源于英国国立生物制品研究所。b)方法①血凝抑制试验和单向免疫扩散试验按常规法。②病毒滴度测定按常规鸡胚感染法，每稀释度接种4只鸡胚。③无菌试验和外源因子检查按现行版《中国药典》的要求测定。④毒种免疫源性测定病毒经灭活、浓缩、纯化后，用不同剂量的血凝素经大腿肌肉接种20 25kg家兔4只，14d后加强1针，首针后28d采血，测定血凝抑制抗体和中和抗体。⑤血凝素序列测定根据Hmi型IVR-148 ；H3N2型NYMC X-175C ；B型B/ Florida/412006的核酸序列，设计一对特异性引物，经RT-PCR扩增H5基因，通过T-A克隆， 将其插入载体，转导大肠埃希菌，筛选阳克隆，提取质粒，测序。⑥经检定证明为WHO推荐的病毒株或相似株(3)种子批的建立a、主代种子库建立由索取的原始毒种传代制备，将毒种复溶并稀释，取稀释度为IO5的病毒液接种11 日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0. 2ml/胚，34°C培养50小时后收获尿囊液并混合，加等量脱脂牛奶后分装约0. aiil/支，冻干后保存于-70°C，经检定合格即为主代种子批。自原始毒种到制成主代种子传代2代。
b、工作种子库建立由主种子批毒种传代制备，将主代种子复溶，取稀释度为IO3 IO5的病毒液接种 11日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0. 2ml/胚，34°C培养50小时后收获尿囊液并混合，分装后冻存于-70°C，经检定合格即为工作种子批。自主代毒种到制成工作种子传代2代。自WHO获得毒种代次为基础到制成工作种子传代3代。至成品苗的病毒总代次为 4代。(4)病毒接种与培养取工作种子批毒种，用0. 01mol/L的PBS稀释为10_4，将稀释后的病毒接种于鸡胚尿囊腔内，每胚0. anl，接种后置34°C培养50小时。工作种子批毒种融化后若一次未用完， 不得再冻结使用。(5)病毒收获筛选活胚置4°C冷胚16小时，吸取外观澄清的尿囊液于无菌容器中，取样进行尿囊收获液检定。(6)灭活病毒尿囊液加入终浓度为0. 02%的甲醛约200ug/ml，置4°C条件下灭活18小时，
灭活到期后每个灭活容器应立即进行取样，分别进行病毒灭活验证试验，进行细菌内毒素含量测定。(7)病毒收获液超滤浓缩灭活后的收获液用截留分子量为300KD的超滤膜超滤浓缩50倍，浓缩液取样进行细菌内毒素含量。(8)蔗糖速率区带离心浓缩后的病毒液以不超过离心腔容积50%的上样量，在蔗糖溶液中以30000r/ min区带离心3小时，将收集的病毒液用截留分子量为300KD的超滤膜进行超滤透析，以去
除蔗糖。(9)柱层柱用kphroSe-4FF凝胶层析纯化，洗脱液为0. 01mol/L的PBS，收集第一峰。(10)病毒裂解纯化后的病毒液加入终浓度为0.3% Triton X-100及0. 3%去氧胆酸钠，裂解120 分钟。(11)再纯化病毒裂解物以不超过离心腔容积50%的量上样，在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心2小时，收集离心后的裂解物用10KD的超滤膜进行超滤浓缩，以去除蔗糖和进一步去除裂解剂，超滤后的病毒裂解液取样进行细菌内毒素含量和微生物限度检查，微生物限度检查菌落数小于10CFU/ml。(12)过滤除菌(原液)纯化后的裂解物经除菌过滤后，即为单价原液。(13)单价原液检定(14)半成品配制用0. 01mol/L PBS将各型经检定合格的单价原液稀释至血凝素含量为36 μ g/ml，加入2-苯氧乙醇至终浓度为5mg/ml，即为半成品。实施例2(1)选取菌种用 HlNl 型IVR-148 ；H3N2 型NYMC X-175C ；B 型B/ Florida/412006流感病毒株，来源于英国国立生物制品研究所。(2)鉴定毒种a)材料①将在鸡胚中传二代(P2)。②血清Hmi型IVR_148 ； H3N2型NYMC X-175C ；B型B/Florida/412006流感病毒株，来源于英国国立生物制品研究所。b)方法:①血凝抑制试验和单向免疫扩散试验按常规法。②病毒滴度测定按常规鸡胚感染法，每稀释度接种4只鸡胚。③无菌试验和外源因子检查按现行版《中国药典》的要求测定。④毒种免疫源性测定病毒经灭活、浓缩、纯化后，用不同剂量的血凝素经大腿肌肉接种25kg家兔4只，14d后加强1针，首针后28d采血，测定血凝抑制抗体和中和抗体。⑤血凝素序列测定根据Hmi型IVR-148 ；H3N2型NYMC X-175C ；B型B/ Florida/412006的核酸序列，设计一对特异性引物，经RT-PCR扩增H5基因，通过T-A克隆， 将其插入载体，转导大肠埃希菌，筛选阳克隆，提取质粒，测序。⑥经检定证明为WHO推荐的病毒株或相似株(3)种子批的建立a、主代种子库建立由索取的原始毒种传代制备，将毒种复溶并稀释，取稀释度为IO3的病毒液接种9 日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0. 2ml/胚，35°C培养52小时后收获尿囊液并混合，加等量脱脂牛奶后分装约0. aiil/支，冻干后保存于-60°C，经检定合格即为主代种子批。自原始毒种到制成主代种子传代共2代。b、工作种子库建立由主种子批毒种传代制备，将主代种子复溶，取稀释度为IO3的病毒液接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0. 2ml/胚，35°C培养52小时后收获尿囊液并混合，分装后冻存于-60°C，经检定合格即为工作种子批。自主代毒种到制成工作种子传代2代。自WHO获得毒种代次为基础到制成工作种子传代4代。至成品苗的病毒总代次为 5代。(4)病毒接种与培养取工作种子批毒种，用0. 01mol/L的PBS稀释为10_4，将稀释后的病毒接种于鸡胚尿囊腔内，每胚0. anl，接种后置35°C培养52小时。工作种子批毒种融化后若一次未用完， 不得再冻结使用。(5)病毒收获筛选活胚置4°C冷胚16小时，吸取外观澄清的尿囊液于无菌容器中，取样进行尿囊收获液检定。(6)灭活病毒尿囊液加入终浓度为0. 02%的甲醛约200ug/ml，置4°C条件下灭活18小时， 灭活到期后每个灭活容器应立即进行取样，分别进行病毒灭活验证试验，进行细菌内毒素含量测定。(7)病毒收获液超滤浓缩灭活后的收获液用截留分子量为300KD的超滤膜超滤浓缩30倍，浓缩液取样进行细菌内毒素含量。(8)蔗糖速率区带离心浓缩后的病毒液以不超过离心腔容积50%的上样量，在蔗糖溶液中以30000r/ min区带离心3小时，将收集的病毒液用截留分子量为300KD的超滤膜进行超滤透析，以去
除蔗糖。(9)柱层柱用kphr0Se-4FF凝胶层析纯化，洗脱液为0. 01mol/L的PBS，收集第一峰。(10)病毒裂解纯化后的病毒液加入终浓度为0.3% Triton X-100及0. 3%去氧胆酸钠，裂解120 分钟。(11)再纯化病毒裂解物以不超过离心腔容积50%的量上样，在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心2小时，收集离心后的裂解物用IOKD的超滤膜进行超滤浓缩，以去除蔗糖和进一步去除裂解剂，超滤后的病毒裂解液取样进行细菌内毒素含量和微生物限度检查，微生物限度检查菌落数小于10CFU/ml。(12)过滤除菌纯化后的裂解物经除菌过滤后，即为单价原液。(13)单价原液检定(14)半成品配制用0. 01mol/L PBS将各型经检定合格的单价原液稀释至血凝素含量为30 μ g/ml, 加入2-苯氧乙醇至终浓度为5mg/ml，即为半成品。
权利要求
1.一种季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，该方法包括按顺序实施的建立病毒种子批、接种与培养病毒、收获病毒、对病毒进行灭活处理、超滤浓缩、离心纯化、柱层析纯化、裂解病毒、二次纯化、过滤除菌、半成品配制的步骤，其中的病毒是甲1、甲3和乙型流感病毒株，其特征在于，其中的离心纯化步骤采用的是蔗糖速率区带离心法，包括将浓缩后的病毒液以不超过离心腔容积50%的上样量，在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心3小时；其中的建立病毒种子批步骤包括(1)主代种子库建立由索取的原始毒种传代制备，将毒种复溶并稀释，取稀释度为 IO3 IO5的病毒液接种9 11日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0. aiil/胚，33 35°C培养48 72小时后收获尿囊液并混合，加等量脱脂牛奶后分装为0. 2ml/支冻干后保存于-60°C以下，经检定合格即为主代种子批；自原始毒种到制成主代毒种传代不得超过2代；(2)工作种子库建立由主种子批毒种传代制备，将主代种子复溶，取稀释度为IO3 IO5的病毒液接种9 11日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0. 2ml/胚，33 35°C培养48 72 小时后收获尿囊液并混合，分装后冻存于-60°C以下，经检定合格即为工作种子批，自主代毒种到制成工作种子传代不得超过2代。
2.权利要求1所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心3小时后，将收集的病毒液用截留分子量为300KD的超滤膜进行超滤透析，以去除蔗糖，然后再进行接下来的柱层析步骤。
3.权利要求1或2所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于二次纯化包括蔗糖密度梯度离心和超滤浓缩步骤，蔗糖密度梯度离心包括将病毒裂解物以不超过离心腔容积50%的量上样，在蔗糖溶液中以30000r/min区带离心2小时。
4.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于二次纯化中的超滤浓缩步骤是将收集的离心后的裂解物用IOKD的超滤膜进行超滤浓缩，以去除蔗糖和进一步去除裂解剂。
5.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于采用Triton X-100和去氧胆酸钠裂解病毒，Triton X-100及去氧胆酸钠的终浓度均为0. 3%，裂解过程持续60 150分钟。
6.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于采用甲醛进行灭活处理。
7.权利要求9所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于将病毒尿囊液加入终浓度为0. 02%的甲醛，置2 8°C条件下灭活16 M小时。
8.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于灭活后的收获液用截留分子量为300KD的超滤膜超滤浓缩30-50倍，浓缩液取样进行细菌内毒素含量。
9.权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于柱层析采用 Sephrose-4FF凝胶层析纯化，洗脱液为0. 01mol/L的PBS，收集第一峰。
10.采用权利要求3所述的季节性流感病毒裂解疫苗制备方法制备得到的疫苗，其特征在于所述疫苗不含硫柳汞防腐剂，其中的卵蛋白含量为不高于300ng/ml，内毒素含量为小于 20EU/ml。
全文摘要
本发明提供一种季节性流感病毒裂解疫苗的制备方法及该方法制备得到的疫苗，属于疫苗制备工艺技术领域。所述制备方法采用经检定证明为WHO推荐病毒株或相似株的甲1、甲3、乙型流感病毒株，经过传代建立工作种子库，接种鸡胚、培养收获病毒液、灭活病毒、超滤浓缩、区带离心、超滤除糖、柱层析、病毒裂解、二次纯化、过滤除菌步骤制备获得原液，然后通过半成品配置、成品包装制备得到季节性流感病毒裂解疫苗。本发明的方法将区带离心纯化和分子筛层析柱纯化进行组合，同时在病毒裂解后进行包括区带离心纯化步骤的二次纯化，具有浓缩效率及回收率好，成本低，效率高，容易操作的优点。最终制备得到的产品杂质含量低，HA含量高，内毒素、卵清蛋白标准远远优于《中国药典》2010版及《欧洲药典》的要求。而且，本发明的产品不含硫柳汞，接种更安全，接种人群更广泛。
文档编号A61P31/16GK102406930SQ20111038207
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者侯文礼, 冯晓, 张涛, 钟泽荣 申请人:成都康华生物制品有限公司