专利名称：一种具有协同作用的治疗t(11;17)急性早幼粒细胞白血病的组合药物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗癌症的组合药物，具体地说，是一种具有协同作用的治疗 t(ll;17)急性早幼粒细胞白血病的组合药物及其应用。
背景技术：
急性髓细胞白血病(AML)是一种异质性的恶性血液肿瘤，也是发生在成人中最普遍的急性白血病种类。据资料记载，仅2003年就有大约11，000个美国人被诊断为AML，其中大约75%的病人最终由于该病死亡。而在中国，每年新增急性白血病患者达四万名之多。 急性早幼粒细胞性白血病(APL)是一种常见的血液恶性肿瘤，占AML的10-15%，临床表现为粒细胞分化被阻滞于早幼粒细胞阶段，造血细胞的正常分化以及凋亡途径受阻，导致骨髓及外周血中不成熟的原始细胞大量积累，影响了正常血细胞的生成与功能，导致患者出血、 贫血并易发感染，常伴有严重出血症状及播散性血管内凝血(DIC)，白血病细胞会在肝、脾等其它脏器浸润、播散，最终使器官功能衰竭而导致病人死亡。95%以上的APL病人携带有典型的t (15 ； 17) (q22 ； q21)染色体易位，该易位形成的PML-RARa融合基因被证实具有致白血病潜能。二十世纪八十年代后期，全反式维甲酸(ATRA)介导的细胞分化作用为APL的治疗带来了革命性的变化。ATRA联合传统化疗可使90-94%APL病人完全缓解，五年无病生存率达到75%。而九十年代出现的应用三氧化二砷(ATO)联合应用ATRA，辅以化疗，不仅克服了单用ATRA伴随的维甲酸综合症，而且降低了 ATRA耐药导致的复发，病人五年无病生存期可以达到90%以上，使APL成为临床上首个可以被治愈的白血病类型。研究发现，ATRA处理可以特异地降解PML-RARa融合蛋白，使 PML-RAR α对野生型PML和RAR α的显性负抑制作用被解除。而ATO在低剂量可部分诱导 APL细胞分化，高剂量则可诱导白血病细胞凋亡。ATRA和ATO相继应用于t (15 ； 17) APL的治疗，开创了诱导分化和靶向治疗的先河，实现了白血病细胞在体内外分化诱导剂作用下， 向正常造血细胞分化。然而携带t(ll;17)染色体易位的APL患者，虽然与典型的t(15;17)的患者具有类似的临床表型和免疫组化标志，但对于诱导分化治疗的反应性却与t (15; 17)APL患者有着明显的差别，病人对于ATRA天然耐药，对ATRA/AT0治疗方案反应性差。此外，由于 t (11 ； 17) APL患者对细胞毒性化疗也存在自身耐受，导致了较差的临床预后，大多数患者在临床诊断一年内死于白血病进展。其分子病因的差异在于t(ll;17)形成PLZF-RARa融合基因，相应融合蛋白与转录抑制物NCoRl有额外的结合位点。尽管病理性PLZF-RARα融合蛋白的RAR α部分可受ATRA调节，但PLZF部分亦能同NCoRl结合且对ATRA不敏感。因此即使在药理浓度的ATRA作用下，PLZF-RAR α无法完全释放NCoRl，染色质结构仍处于抑制状态而产生对ATRA的天然耐药，寻找针对t (11 ； 17) APL这一特殊亚型的有效治疗方案势在必行。应用携带PLZF/RARa融合基因的APL模型，我们对常用的细胞分化诱导剂及信号通路调节剂进行了筛选试验，这些药物包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂(SAHA，TSA, VPA), 蛋白激酶C调节剂(PMA，DMS0)，蛋白激酶A激活剂(8-CPT-cAMP)和中草药衍生化合物 (oridonin)等。从中发现8-CPT_cAMP作为一种高效的选择性蛋白激酶A (PKA)途径激动剂，可以显著地增强ATRA在这种耐药白血病细胞中的分化诱导作用，逆转耐药白血病细胞对ATRA的耐药。除了在细胞水平上观察到ATRA诱导分化作用之外，8_CPT_cAMP还显著促进ATRA对其下游造血调控关键性基因的转录活化作用，即在分子生物学水平回复了 ATRA 的生化作用，实现耐药逆转。然而，它们联合使用对t (11 ； 17) APL的疗效评价以及可能作用机制尚无相关报道。中国专利文献CN1304053C公开了一种可治愈急性早幼粒细胞白血病的组合药物，通过联合应用ATRA和As2O3两种药物，从诱导分化和诱导凋亡两个不同的角度，并结合联合化疗的方法去消除白血病细胞的克隆，最终达到治愈急性早幼粒细胞白血病的目的。 但是关于一种具有协同作用的治疗t (11; 17)急性早幼粒细胞白血病的组合药物及其应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种具有协同作用的治疗t (11; 17) 急性早幼粒细胞白血病的组合药物。本发明的再一的目的是，提供一种组合药物在制备治疗t (11 ； 17)急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种具有协同作用的治疗t (11; 17) 急性早幼粒细胞白血病的组合药物，所述的组合药物由ATRA和8-CPT-cAMP组成。所述的ATRA 和 8-CPT-cAMP 的比例为 1 μ M :50-100 μ Μ。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种组合药物在制备治疗 t(ll; 17)急性早幼粒细胞白血病药物中的应用，所述的组合药物由ATRA和8-CPT-cAMP组成，ATRA 和 8-CPT-cAMP 的比例为 1 μ M :50-100 μ Μ。所述的急性早幼粒细胞白血病是对ATRA天然耐药的t (11; 17)急性早幼粒细胞白血病。本发明优点在于
1、通过使用本发明的组合药物，发挥两种药的协同作用，逆转t(11; 17)白血病细胞对 ATRA的耐药性，显著抑制白血病细胞生长，促进其分化成熟；
2、两药组合在显著提高疗效的同时对正常的骨髓干细胞无明显毒副作用；
3、使用本发明的组合药物可以克服现有技术中单独使用一种药物引起耐药的缺点。
图IA =NBT还原实验表明多种促分化试剂体外处理t (11 ； 17) APL小鼠原代细胞48 小时后50 μ M 8-CPT-cAMP与1 μ M ATRA合用明显促进细胞分化。图IB 细胞形态学观察显示t(ll;17)APL原代小鼠白血病细胞经过50μΜ 8-CPT-cAMP和ΙμΜ ATRA协同作用后出现细胞明显变小，细胞核弯曲或成空心圈形状，核/ 质比降低等分化特征(放大倍数为1000倍)。
图 IC :U937-mt-PLZF-RAR α 细胞经过 100 μ M 8_CPT_cAMP 和 1 μ M ATRA 联合处理 7天后细胞形态学显示明显诱导分化特征(放大倍数为1000倍)。图ID :ΝΒΤ还原实验显示，U937-mt-PLZF-RARa细胞相比较U937-mt_P/R9和空载细胞，经过100 μ M 8-CPT-cAMP和1 μ M ATRA联合处理后出现特异的分化表型(***号表示 P<Q. 0001)。图2 在U937-mt-PLZF-RARa细胞株中8_CPT_cAMP促进ATRA诱导的维甲酸应答基因似σ ^ RARfi 2，CEBP ε，TGM2 的表达。图3Α 分别使用抗NcoRl，SMRT,乙酰化组蛋白H3和H4的兔抗进行ChIP-PCR实验，表明8-CPT-cAMP促进ATRA诱导SMRT与PLZF-RAR α解离，增强与乙酰化组蛋白H3和 H4的结合，促进转录激活。图;3B 哺乳动物双杂交实验提示8-CPT-cAMP与ATRA相互协同，促进PLZF-RAR a 与SMRT的解离。 图4A 使用PKA磷酸化抗体Western blot检测发现，8_CPT_cAMP和ATRA联合作用能够增强PKA下游靶蛋白质的丝氨酸/苏氨酸磷酸化程度。图4B 哺乳动物双杂交实验显示，PLZF-RAR a -S765A突变体与SMRT的结合能力相比野生型PLZF-RARα明显减弱，提示kr765位点的磷酸化对PLZF-RARα与SMRT的结合
有着重要作用。图5A 在t (11 ； 17) APL小鼠体内使用8_CPT_cAMP与ATRA短期联合治疗可以显著减轻肿瘤负荷。图5B =ATRA和8_CPT_cAMP共同作用下小鼠肝、脾造血重建，白血病细胞出现明显的诱导分化特征。图6 在t(ll; 17)APL小鼠体内进行长期的8_CPT_cAMP与ATRA联合治疗可以减少白血病细胞的脏器浸润，显著延长小鼠的生存期。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。一、方法
(一)细胞培养与试剂
稳定转染 MT1-PML-RAR α 和 MT1-PLZF-RAR α 的 U937 细胞株，即 U937-mt_P/R9 和 U937-mt-PLZF-RAR α，可以在锌离子诱导下分别表达PML-RAR α和PLZF-RAR α融合蛋白。 同时，稳定转染只含MTl启动子序列的空白载体U937细胞株U937-mt-Bulk作为对照(制备过禾呈见参考文献The acute promyelocytic leukemia-specific PML-RAR α fusion protein inhibits differentiation and promotes survival of myeloid precursor cells.著者Grignani F, Ferrucci PF, Testa U, Talamo G, Fagioli M, Alcalay M, Mencarelli A, Grignani F, Peschle C, Nicoletti I，Pelicci PG.杂志名Cell 1993 年74卷3期，第423至431页)。所有细胞均在37°C，5% CO2的饱和湿度下，使用含10%胎牛血清(Gibco BRL，美国)的RPMI 1640完全培养基进行培养。C0S-7和CHO细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC，美国)，使用加有10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养。白血病发病小鼠的原代骨髓细胞，则使用含20%胎牛血清的DMEM完全培养基进行体外培养。
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实验使用到的试剂和药品全反式维甲酸(ATRA)，辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)， 曲古柳菌素A (TSA)，佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)，二甲基亚砜(DMS0)，茶碱 (theophylline)，吡拉米特(piclamilast)，PKA 通路抑制剂 H89 (Sigma-Aldrich 公司，美国),毛萼乙素(eriocalyxin B)，冬凌草甲素(oridonin)和8_CPT_cAMP (BIOLOG生命科学研究所，德国)，RAR α的兔源多克隆抗体(SC-551，Santa Cruz，美国)，PLZF兔源多克隆抗体 (ab39354, abeam, HH),Phospho-(Ser/Thr) PKA Substrates 兔抗(9621，Cell signaling technology，美国)，β -肌动蛋白鼠抗(al978，Sigma-Aldrich)。(二)细胞形态学与病理组织化学分析
细胞形态学每个样品取0. 5-1 X IO5个细胞使用Cytopro离心式细胞甩片机进行玻片制备，晾干后，用瑞氏-姬姆萨(Wright-Giemsa)染液染色，显微镜下观察细胞形态学变化。 对于硝基四唑(NBT)还原实验，细胞培养于37° C，含0. 1%的硝基四氮唑和0. Syg/ml PMA 的PBS溶液中，30分钟后使用PBS冲洗3次，然后甩片进行显微镜观察。所有细胞化学染色试剂均购自Sigma-Aldrich公司。病理组织化学小鼠处死后分别取肝脏、脾脏，浸泡于10%福尔马林溶液中固定， 石蜡包埋，切成4 mm薄片，经脱蜡后作苏木精-伊红染色，显微镜下观察病理变化。(三)基因组PCR 与 RT-PCR a)基因组DNA的提取
使用 Wizard Genomic DNA Purification Kit 抽提(A1125，Promega，美国) 1.取5 X IO6个小鼠脾脏细胞，加600 μ 1核裂解液，吹打混勻直到无细胞团块。2.加200 μ 1蛋白沉淀液，剧烈震荡20s，冰上放置5 min。3. 13，000-16，000 g离心4 min，可见白色蛋白沉淀。4.小心移取上清至干净的1. 5 ml离心管，加600 μ 1异丙醇，温和颠倒混勻，直至可见白色丝状DNA。5. 13,000-16,000 g 离心 1 min，弃上清。6.加70%乙醇，温和颠倒洗涤DNA。7. 13，000-16，000 g 离心 1 min。8.弃上清，晾干，加100 μ 1 DNA溶解液溶解，得细胞基因组DNA。9.紫外分光光度计(Beckman DU-600)对DNA定量并检测沈0/观0比值鉴定其纯度。b)总RNA的提取
细胞总RNA使用TRIzof按照产品说明书的推荐步骤进行制备(15596-026， Invitrogen,美国)。1.取5X106个小鼠脾脏细胞，加1 ml Trizol试剂震荡充分混勻，室温放置10 min。2.加0. 2 ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3 min。3.4° C、12000 rpm 离心 15 min。4.吸出上清到另ー个干净的1. 5 ml离心管，加等量异丙醇充分混勻。5.4° C、12000 rpm 离心 10 min 以沉淀 RNA。6.弃上清，カロ 1 ml 75% 乙醇，12000 rpm 离心 5 min。
7.弃上清，晾干，加DEPC水溶解，得细胞总RNA。8.紫外分光光度计(Beckman DU-600)对RNA定量并检测比值鉴定其纯度。c)基因组PCR鉴定小鼠特异融合基因鹤PLZF-RAR α融合位点的引物序列
ZRA: 5，CATGGACTTCAGCACCTATG 3，(SEQ ID NO. 1) ZRB: 5，TAGTGGTAGCCTGAGGACTT 3，(SEQ ID NO. 2)
反应条件94°C变性5 min 循环包括94° C变性45s，55° C退火30s，72° C延伸45s 35个循环后72° C延伸10 min 跨7 / σ -PLZF融合位点的引物序列 RZF: 5，CAGCACCAGCTTCCAGTTAG 3，(SEQ ID NO. 3) RZR: 5，GGCAGTACTCTGTGCAGATG 3，(SEQ ID NO. 4) 反应条件94° C变性5 min
循环包括94° C变性45s，61° C退火30s，72° C延伸1 min 35个循环后72° C延伸10 min
取PCR反应产物5 μ 1进行m琼脂糖凝胶电泳，凝胶仪成像下观察，摄片。d)逆转录 PCR (RT-PCR)
对抽提好的RNA进行电泳确认质量后，用核酸分光光度计对标本进行定量。每个样品取ι μ g总RNA使用随机引物和莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(48190-011和 28025-013, Invitrogen)逆转录反应，反转录成cDNA，取1/20 RT产物进行PCR反应。实时荧光定量RT-PCR检测使用ABI的Prism 7000 SDS系统和SYBR Green荧光PCR检测试剂盒(ABI，美国)。用Ct值的偏差衡量这些基因之间的相对丰度，用同一样品的AjCTI检测值作为内参校准。逆转录反应的体系如下
反应成分体积5X buffer8mlDTT (0. 1M)4mldNTP(IOmM)2mlRandomprimers(IOmM)2mlRNA(0. lmg/ml)IOmlM-MLV(200U/ml)ImlH2O13ml
用于PCR扩增的定量或半定量引物列表如下
人源基因方向序列SEQIDN0.产物(bp)1 值(° C)hRARPForwardGATCGTGGAGTTTGCTAAACG520256ReverseCAGAGGACCAAATCCAGCAT6hTGM2ForwardGTCAATGCCGACGTGGTAG720156ReverseGTTCAGGTGGTTCGCCCTT8hRAR a 2Forwardgaaccgggcctgtttgctcccaga926661Reverseggatgctgcggcggaag10hCEBP εForwardACAATCCCCTGCAGTACCAA1118456ReverseGCCTTCTTGCCCTTGTGTAA12(四)蛋白制备与免疫印迹 a)核蛋白质抽提与制备
细胞核蛋白抽提离心收集5-20 X IO6个细胞，以冰预冷的PBS洗涤2遍。加入冰预冷的 A 缓冲液(含 HEPES 10 mM, pH7. 9 ；MgC12 1. 5 mM ；KCl 10 mM ；DTT 0. 5 mM) 1 ml 重悬细胞，置冰上冰浴20分钟。离心收集细胞，小心地去除上清，加入200 ml Α，缓冲液(含HEPES 10 mM,pH7. 9 ；MgC12 1. 5 mM ；KCl 10 mM ；DTT 0. 5 mM ；0. 2% NP-40 ；PMSF 0. 5 mM及蛋白酶抑制剂复合物)重悬细胞，冰浴5分钟；离心收集细胞核，吸取上清液为胞浆组份。取A缓冲液洗涤细胞核沉淀以去除胞浆组份的残留。再次离心沉淀后以50 ml B缓冲液(含HEPES 20 mM,pH7. 9 ；NaCl 420 mM ；EDTA 0. 2 mM ；DTT 0. 5 mM ；PMSF 0. 5 mM 及蛋白酶抑制剂复合物)重悬细胞核沉淀，冰浴20分钟后，于4° C以12000 rpm转速离心10分钟，收集上清即为核蛋白组份，以Bradford法进行蛋白质定量后，取每个样品20mg的总蛋白质加热变性后行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE电泳)凝胶电泳进行蛋白分离。b)小鼠原代细胞总蛋白质抽提
取5X IO6个小鼠脾脏细胞，加100ml PBS悬浮，加100ml 2XSDS裂解缓冲液，用移液器反复吹打，震荡，超声5 min，沸水浴5 min，得细胞总蛋白。c)免疫印迹检测 CWestern blot)
用8-1 SDS-PAGE电泳分离蛋白，再将其湿法电转移至PVDF膜上(GE，弗赖堡，德国)。PVDF膜在溶有5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中封闭lh，然后与一抗4° C孵育池左右。 用TBST缓冲液洗膜三次，再与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育1小时。TBST洗膜三次后，β-肌动蛋白鼠抗(al978，Sigma-Aldrich)作为上样内参对照。(五)细胞电转与荧光素酶报告基因实验
pRARE-tk-luc报告基因质粒的原理是通过在萤火虫荧光素酶启动子区域插入一段人工合成的核苷酸序列，其核心序列是来源于人类基因维甲酸β受体中的RARE元件，由此来检验和评估细胞内维甲酸通路的活化或抑制情况。PRL-SV40被用来作为转染效率内参。瞬时转染U937细胞使用GenePulsereII电转染系统(Bio-Rad，美国)。电转之前，U937-mt_P/ R9和U937-mt-PLZF-RAR α细胞在含有100 μ M硫酸锌的培养基中培养12小时，分别诱导 PML-RARa和PLZF-RARa融合蛋白表达。进行电穿孔时，先离心除去完全培养基，每一电转杯取 2 X IO6 个细胞重悬于混有 10 μ g pRARE-tk-luc 和 2. 5 μ g pRL_SV40 的 RPMI 1640 培养液中。在室温下，电转参数设置为电容950 μ F和电压220V。转染后12小时，细胞再经M小时的加药处理。最后，每个样品的荧光素酶活性在Lumat LB9507光度计(Berthold Technologies，德国)上用双荧光素酶检测系统(E1980，Promega)检测。(六)哺乳动物双杂交实验
哺乳动物双杂交分析的质粒，包括pGAL(RE)5-tk-luc，pNLVP16, pVP16-PLZF-RARα， pGal4空白对照载体。(其中pGAL (RE) 5-tk_luc，pGal4空白对照载体，pGal4_SMRT和 pGal4_NcoRl 制备过禾呈见参考文献The nuclear corepressors recognize distinct nuclear receptor complexes.著者Cohen RN, Putney A, Wondisford FE, Hollenberg AN.杂志名Molecular Endocrinology 2000 年 14 卷 6 期，第 900 至 914 页。pNLVP16 和 pVP16-PLZF-RARa 质粒制备过程见参考文献Reduced retinoic acid-sensitivities of nuclear receptor corepressor binding to PML- and PLZF-RARalpha underliemolecular pathogenesis and treatment of acute promyelocytic leukemia.著者 Guidez F, Ivins S, Zhu J, Soderstrom M, Waxman S, Zelent A.杂志名Blood 1998年 91 卷 8 期，第洸34 至洸42 页)。PLZF-RAR α 在 Ser76、Serl97、Thr282 和 kr765 位的突变体 (pVP16-PLZF-RARa -S76A、S197A、I^82A和 S765A)，通过 QuikChange II 定点突变试剂盒进行定点突变构建(Strategene，美国)。C0S-7和CHO细胞培养在24孔板中，使用SuperFect 转染试剂盒(301305，QIAGEN，美国)进行瞬时转染，用50 ng pVP16_PLZF_RARα质粒分别和 50 ng pGal4-SMRT 或 p(ial4-NcoRl 质粒混合，同时加入 600 ng pGAL (RE) 5_tk_luc 和 1. 5 ng pRL-SV40。经过转染后18个小时，细胞经ATRA和/或8_CPT_cAMP处理6小时。荧光素酶的活性测定如前节所述。
(七)染色质免疫共沉淀及半定量PCR
如前所述，硫酸锌诱导后，U937-mt-PLZF-RAR α细胞经ATRA和/或8_CPT_cAMP。 每次检测取2X IO7个细胞进行染色质免疫沉淀(ChIP)实验。染色质样品分别与SMRT (ab24551)，NcoRl (ab24552)，组蛋白 H3 (K18 乙酰化，abll91)或组蛋白 H4 (K12 乙酰化， abl5823, abcam，英国)的兔多克隆抗体在4°C过夜孵育。兔源非特异性IgG抗体用于阴性对照。基因组DNA片段进行沉淀洗脱后回收，用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，美国)定量。等量的洗脱后DNA用作半定量PCR的DNA扩增模板。PCR反应同前。 针对特定基因启动子区RARE位点附近的ChIP-PCR引物序列如下
权利要求
1.一种具有协同作用的治疗t(ll;17)急性早幼粒细胞白血病的组合药物，其特征在于，所述的组合药物由ATRA和8-CPT-cAMP组成。
2.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于，所述的ATRA和8-CPT-cAMP的比例为 ΙμΜ :50-100 μ Mo
3.一种组合药物在制备治疗t (11; 17)急性早幼粒细胞白血病药物中的应用，其特征在于，所述的组合药物由ATRA和8-CPT-cAMP组成，ATRA和8-CPT-cAMP的比例为ΙμΜ: 50-100 μ M0
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的急性早幼粒细胞白血病是对ATRA 天然耐药的t (11; 17)急性早幼粒细胞白血病。
全文摘要
本发明涉及一种具有协同作用的治疗t(11;17)急性早幼粒细胞白血病的组合药物，所述的组合药物由ATRA和8-CPT-cAMP组成。本发明还提供一种组合药物在制备治疗t(11;17)急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。本发明优点在于通过使用本发明的组合药物，发挥两种药的协同作用，逆转t(11;17)白血病细胞对ATRA的耐药性，显著抑制白血病细胞生长，促进其分化成熟；两药组合在显著提高疗效的同时对正常的骨髓干细胞无明显毒副作用；使用本发明的组合药物可以克服现有技术中单独使用一种药物引起耐药的缺点。
文档编号A61P35/02GK102512436SQ201110402338
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者任志宏, 刘萍, 施静艺, 焦波, 陈竺, 陈赛娟 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院