专利名称：一种克服肿瘤耐药性的载药脂质体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种克服肿瘤耐药性的载药脂质体，该载药脂质体的制备方法，及其该载药脂质体在制备抗肿瘤药物和肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
1、肿瘤耐药性目前，在许多肿瘤的治疗中·，常规化疗效果差和预后不良是困扰临床的重要难题，而肿瘤多药耐药性(MDR)则是肿瘤化疗失败的关键因素。经治疗后.残存的肿瘤干细胞耐药性形成，常导致对某些药物治疗敏感性降低，并引起肿瘤复发甚至转移。人恶性肿瘤对化疗的耐药性可分为先天性耐药(nature resistance)和获得性耐药(acquiredresistance);根据耐药谱又分为原药耐药(primary drug resistance, PDR)和多药耐药(multidrug resistance, MDR)。PDR只对诱导的原药产生耐药,面对其它药物不产生产交叉耐药；MDR是由一种药物诱发，但同时又对其它多种结构和作用机制迥异的抗癌药物产生交叉耐药。耐药性产生的机制有多种，如:DNA修复能力的增强:化疗药致使DNA损伤，当二氢叶酸还原酶(DHFR)和DNA损伤修复相关酶活性增强(MGMT)可增加其对化疗药的耐药程度。P-糖蛋白表达:P-糖蛋白是一种能量依赖性药物排出泵，可以与一些抗肿瘤药物结合，也有ATP结合位点。P-糖蛋白一旦与抗肿瘤药物结合，通过ATP提供能量，就可将药物从细胞内泵出细胞外，使药物在细胞内浓度不断下降，并使其细胞毒作用减弱直至散失，出现耐药现象。P-糖蛋白在正常胆管、肾、小肠、肾上腺、造血干细胞等均有表达，负责激素运输及排泌毒物等生理功能。P-糖蛋白高表达的肿瘤病人常伴预后不良，如低缓解率、高复发率、生存期短，可作为预后评价指标。谷胱甘肽S-转移酶:谷胱甘肽是一种含半胱氨酸的三肽，为细胞内主要的非蛋白巯基。谷胱甘肽S-转移酶能够催化机体内亲电性化合物与GSH结合，使有毒化合物增加水溶性、减少毒性，最终排出细胞外。2、紫杉醇紫杉醇属有丝分裂抑制剂或纺锤体毒素，是从太平洋紫杉树皮中提取的二萜类化合物，是一种天然来源抗肿瘤药，能够诱导和促进微管的装配，具有聚合和稳定微管的作用，致使快速分裂的肿瘤细胞在有丝分裂阶段被牢牢固定，使癌细胞复制受阻断而死亡，1992年美国FDA批准使用，是目前临床上非常重要的用于卵巢癌和乳腺癌及非小细胞肺癌等癌症的一线和二线治疗用药。也可用于头颈癌、食管癌，精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等的治疗。其不良反应包括:过敏反应；骨髓抑制；神经毒性；心血管毒性；脱发以及炎症等局部反应。由于紫杉醇难溶于水，制剂由50%乙醇与50%的表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油衍生物配制而成，以增加紫杉醇的水溶性。该溶剂也存在毒副反应，如变态反应、中毒性肾损伤、神经毒性、心脏血管毒性等。
多烯紫杉醇注射液(艾素，多西他赛，Docetaxel Injection)是由欧洲红豆杉叶中提取物经合成而来的半合成紫杉醇类似物，作用机制是加强微管蛋白聚合作用和抑制微管解聚作用，导致形成稳定的非功能性微管束，因而破坏肿瘤细胞的有丝分裂。它在细胞内浓度比紫杉醇高3倍，并在细胞内滞留时间长，这是它在体外试验中比紫杉醇抗肿瘤活性大的重要原因。在体内试验中，对小鼠的结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢肿瘤移植物等有效。副作用与紫杉醇类似，其骨髓抑制毒性更大。多烯紫杉醇一般由聚山梨醇80配制而成。
脂质体是由磷脂和胆固醇组成的具有类似生物膜的双分子层结构。1971年Rymen等人开始将其作为药物载体。相比于其他载体，脂质体具有以下优点:细胞亲合性和靶向性；缓释性；降低药物毒性，提高药物稳定性。注射用紫杉醇脂质体(力扑素)是江苏省药物研究所、南京思科药业有限公司、江苏省脂质体药物工程技术研究中心研制的新型药物，于2004年上市推广。是我国食品药品监督管理局批准的第一个脂质体药物，也是国际首次上市的注射用紫杉醇脂质体药物。
力扑素是将难溶于水的紫杉醇包封在新型药物载体-脂质体磷脂双分子层中，解决了紫杉醇的溶解性问题；与普通紫杉醇药物相比，力扑素具有的优势有:
(I)解除了由溶媒引发的超 过敏风险
紫杉醇脂质体从根本上革除了普通紫杉醇注射液必需使用的聚氧乙基代蓖麻油与无水乙醇混合溶媒，革除了超过敏反应发生的风险。并可不作预处理，这为临床用药提供了方便，使患者免除了大剂量使用激素产生的不良影响。
(2)紫杉醇脂质体的毒副反应较紫杉醇注射液明显减轻
由于脂质体药物独特的药代动力学特性，在体内半衰期延长、血药浓度波动小等因素，与紫杉醇注射液相比，紫杉醇脂质体对血液系统、血压和肝功能的影响更小，药物毒副反应更低。此外，紫杉醇脂质体对血压的影响明显低于紫杉醇注射液，且外周血液和肝脏毒性反应明显减弱。
(3)明显提高机体对紫杉醇的耐受性
急性毒性试验显示:紫杉醇脂质体的LD5tl比紫杉醇注射液大一倍，表明其耐受性明显提闻，为临床用药加大剂量、提闻疗效提供了空间。
(4)半衰期延长、突显缓释功效
临床前药代动力学试验表明:紫杉醇脂质体的半衰期较紫杉醇注射液明显延长一倍以上。
(5)具有靶向给药的特性
紫杉醇脂质体在肝脏、肺、淋巴组织等组织器官浓度明显增高。跟踪检测不增加该器官毒性，有利于局部病变的治疗。
通过实验室研究及临床观察发现，紫杉醇脂质体解决了紫杉醇的溶解性问题；提高了紫杉醇在溶液中的稳定性；避免过敏反应而不影响抗肿瘤活性；另外，紫杉醇脂质体还具有腹腔、胸腔给药的可能性。因此紫杉醇脂质体与紫杉醇相比具有一定的优势。
但是随着肿瘤化疗药物在临床治疗中的广泛应用，肿瘤的耐药性问题越来越突出，已成为肿瘤有效治疗的主要障碍之一。而上述各种形式的紫杉醇药物对耐药性肿瘤疗效都较差。
3、白藜芦醇20世纪80年代，世界卫生组织调查发现，尽管法国人偏爱奶酪等高脂肪食物，但冠心病发病率和死亡率低于其他西方国家，其原因可能是与法国人常饮含白藜芦醇的葡萄酒有关。此后，白藜芦醇备受关注。到目前为止至少已在21科、31属的72种植物中发现了白藜芦醇。白藜芦醇主要来源于寥科Polygonaceae植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根,葡萄科植物葡萄Vitis vinifera果实的皮和籽,豆科Fabaceae植物花生Arachis hypogaea的种子等。白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。此外，白藜芦醇还具有保护心血管、抗氧化、抗自由基、抗炎、抗菌等作用，而且还有很多的临床使用实例。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中各种形式的化疗药物对耐药性肿瘤疗效均较差的缺陷，提供一种对耐药性肿瘤疗效较好的载药脂质体及其制备方法和应用。本发明提供一种载药脂质体，其特征在于，该载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性组分，所述长循环脂质体为脂质体表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的脂质体，所述药物活性组分为紫杉醇和白藜芦醇。本发明还提供一种载药脂质体的制备方法，其特征在于，该方法包括，利用薄膜-超声法，将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分制成所述载药脂质体，所述药物活性组分为紫杉醇和白藜芦醇。以及提供由上述方法制得的载药脂质体。
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此外，本发明还提供上述载药脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用和在肿瘤治疗中的应用。本发明的载药脂质体含有紫杉醇和白藜芦醇，除了对药物敏感肿瘤的发展具有抑制活性外，其还可有效地抑制化疗药物耐药性肿瘤的发展，因此，具有极大的临床应用价值。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式
一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:图1a和图1b是本发明一种实施方式的载药脂质体的透射电镜图；图2a显示出本发明一种实施方式的载药脂质体处理MCF-7敏感细胞24小时后的结果，图2b显示出该载药脂质体处理MCF-7抗性细胞24小时后的结果；图3a显示出本发明一种实施方式的载药脂质体处理MCF-7敏感细胞48小时后的结果，图3b显示出该载药脂质体处理MCF-7抗性细胞48小时后的结果；图4a显示出本发明一种实施方式的载药脂质体处理MCF-7敏感细胞72小时后的结果，图4b显示出该载药脂质体处理MCF-7抗性细胞72小时后的结果；
图5显示出本发明一种实施方式的载药脂质体处理耐药乳腺癌荷瘤裸鼠后肿瘤的变化结果。
具体实施方式
本发明提供一种载药脂质体，其特征在于，该载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性组分，所述长循环脂质体为脂质体表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000 (DSPE-mPEG2000)修饰的脂质体，所述药物活性组分为紫杉醇和白藜芦醇。
本发明中，所述长循环脂质体与药物活性组分的摩尔比可以与现有技术中脂质体载体与药物活性组分的比例相同，优选地，所述长循环脂质体与药物活性组分的摩尔比为I: 0.001-0.5，进一步优选为 I: 0.01-0.3，最优选为 I: 0.02-0.1。
根据本发明，所述药物活性组分中，紫杉醇和白藜芦醇的摩尔比可以在较宽的范围内变化，例如，所述紫杉醇和白藜芦醇的摩尔比可以为1: 0.01-100;本发明的发明人发现，在一定浓度范围内，随着白藜芦醇量的增加，其与紫杉醇的协同作用也越来越显著，优选地，所述紫杉醇和白藜芦醇的摩尔比为1: 1-80，进一步优选为1: 3-40，综合考虑白藜芦醇的协同作用和紫杉醇的细胞毒性，最优选为1: 5-20。本发明的发明人发现，使用上述优选比例范围内的紫杉醇和白藜芦醇能够获得具有更高的治疗效果的载药脂质体。
根据本发明，所述长循环脂质体可以与现有技术中的常规的长循环脂质体相同，其中，脂质体源与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩尔比可以在很宽的范围内变化，例如可以为1: 0.01-1，优选为1: 0.02-0.2，进一步优选为1: 0.05-0.1。
本发明提供一种载药脂质体的制备方法，其特征在于，该方法包括，利用薄膜-超声法，将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分制成所述载药脂质体，所述药物活性组分为紫杉醇和白藜芦醇。
其中，所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分的摩尔 比为可以为常规的脂质体载体与药物活性组分的比例，优选地，所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分的摩尔比为 1: 0.01-1: 0.001-0.5，进一步优选为 1: 0.02-0.2: 0.01-0.3，最优选为I: 0.05-0.1: 0.02-0.1。
根据本发明的方法，所述药物活性组分中，紫杉醇和白藜芦醇的摩尔比可以根据需要进行调节，优选地，所述紫杉醇和白藜芦醇的摩尔比为1: 0.01-100，进一步优选为I: 1-80，再优选为1: 3-40，最优选为1: 5-20。
根据本发明，所述脂质体源可以为本领域任何常规的能够制得脂质体载体的物质，包括但不限于大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、蛋黄卵磷脂中的至少一种，优选为大豆卵磷脂。
所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇和白藜芦醇均可以通过商购获得。
本发明中，所述薄膜-超声法的具体步骤为本领域技术人员公知，即，将各种原料溶解后去除溶剂制成薄膜，然后通过超声破碎制得颗粒。
优选地，所述薄膜-超声法中的超声条件包括，频率为200-800W，优选为300-500W ;超声时间为5-30S，优选为10-20S ;间隔时间为2-20S，优选为5-10S ;循环次数为5-30次，优选为10-20次。具体地，所述薄膜-超声法可包括以下步骤，(I)将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜芦醇和第一有机溶剂混合，得到第一混合溶液，(2)蒸发去除第一混合溶液中的第一有机溶剂，形成薄膜，(3)将所述薄膜与纯水或生理盐水混合得到第二混合溶液，超声得到所述载药脂质体。其中，所述第一有机溶剂可以为能够溶解各种原料的溶剂，优选为无水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一种，最优选为无水乙醇。本发明中，所述蒸发的方法为本领域常规的方法，只要能够将其中的第一有机溶剂去除即可，例如可以在旋转蒸发仪中进行。根据本发明，所述第一有机溶剂的加入量可以为本领域的常规选择，优选地，在第一混合溶液中，所述紫杉醇的浓度为IX 10_4mOl/L-10mOl/L。所述纯水或生理盐水的加入量也可以为本领域的常规选择，优选地，在第二混合溶液中，所述紫杉醇的浓度为IX 10_5mol/L-10mol/L，进一步优选为I X 10_3mol/L-lmol/L，最优选为 5 X 10 2mol/L-0.5mol/L。本发明对于所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜芦醇和第一有机溶 剂的混合方式没有特别的限定，优选地，先将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和第一有机溶剂混合，再加入紫杉醇和白藜芦醇。其中，对于脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和第一有机溶剂三者的加入顺序没有特别的限定,对于再加入的紫杉醇和白藜芦醇的加入顺序也没有特别的限定。本发明的发明人发现，通过上述优选的方法，能够得到治疗效果更好的载药脂质体。本发明提供由上述方法制得的载药脂质体。本发明还提供上述载药脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的所述载药脂质体特别适合于制备抗耐药性肿瘤的药物。本发明还提供上述载药脂质体在肿瘤治疗中的应用。本发明的所述载药脂质体特别适合于治疗耐药性肿瘤。所述肿瘤和耐药性肿瘤包括但不限于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞癌、头颈癌、食管癌、精原细胞瘤、肝癌、肺腺细胞癌、前列腺癌和非何金氏淋巴瘤，以及它们的耐药性肿瘤中的至少一种。通过以下实施例对本发明进行更详细的说明。本发明的实施例中，所用大豆卵磷脂购自上海沪宇生化试剂有限公司，商品号为LE030A，CAS号为8002-43-5 ;所用蛋黄卵磷脂购自上海沪宇生化试剂有限公司，商品号为P0051 ;所用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000购自genzyme公司，商品号为LP-R4-039，CAS号为147867-65-0 ;所用紫杉醇(PTX)购自北京诺瑞医药技术有限公司，CAS号为33069-62-4 ;所用白藜芦醇(Res)购自湖北兴银河化工有限公司，CAS号为501-36-0。实施例1
本实施例用于制备载药脂质体:PTX+Res脂质体-1。
(I)将4X 10_2mol大豆卵磷脂、2X 10_3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺_甲氧基聚乙二醇2000与150ml的无水乙醇混合，溶解后加入3 X ΙΟΛιοΙ紫杉醇和1.2 X IO^mol白藜芦醇，得到第一混合溶液，
(2)蒸发去除第一混合溶液中的无水乙醇，形成薄膜，
(3)将所述薄膜与5ml生理盐水混合，超声得到载药脂质体，即PTX+Res脂质体_1。
所述超声的条件包括:频率为350W，超声18s，间隔8s，超声15次。
实施例2
本实施例用于制备载药脂质体:PTX+Res脂质体_2。
(I)将4X 10_2mol大豆卵磷脂、2X 10_3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000与200ml的无水乙醇混合，溶解后加入3 X ΙΟΛιοΙ紫杉醇和3.6Χ 10_3mOl白藜芦醇，得到第一混合溶液，
(2)蒸发去除第一混合溶液中的无水乙醇，形成薄膜，
(3)将所述薄膜与4ml生理盐水混合，超声得到载药脂质体，即PTX+Res脂质体_2。
所述超声的条件包括:频率为400W，超声15s，间隔5s，超声10次。
对比例I
根据实施例2的方法制备紫杉醇载药脂质体(PTX脂质体)，不同的是，不加入白藜芦醇。
对比例2
根据实施例2的方法制备白藜芦醇载药脂质体(Res脂质体)，不同的是，不加入紫杉醇。
对比例3
根据实施例2的方法，将4X l(T2mol大豆卵磷脂和2X l(T3mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000与200ml的无水乙醇混合，制得长循环脂质体。
实施例3
本实施例用于制备载药脂质体:PTX+Res脂质体_3。
(I)将8X10_2mol的大豆卵磷脂、2X 10_3mol的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺_甲氧基聚乙二醇2000与IOOml的氯仿混合，溶解后加入3X 10_4mol紫杉醇和6X 10_3mol白藜芦醇，得到第一混合溶液，
(2)蒸发去除第一混合溶液中的氯仿，形成薄膜，
(3)将所述薄膜与3ml纯水混合，超声得到载药脂质体，即PTX+Res脂质体_3。
所述超声的条件包括:频率为300W，超声20s，间隔10s，超声20次。
实施例4
本实施例用于制备载药脂质体:PTX+Res脂质体_4。
(I)将0.4mol蛋黄卵磷脂、2X 10_2mol 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000与IOOml的无水乙醇混合，溶解后加入3X 10_4mol紫杉醇和1.2 XlO^moI白藜芦醇，得到第一混合溶液，
(2)蒸发去除第一混合溶液中的无水乙醇，形成薄膜，(3)将所述薄膜与2ml生理盐水混合，超声得到载药脂质体，即PTX+Res脂质体-4。所述超声的条件包括:频率为500W，超声10s，间隔5s，超声12次。测试例I用透射电镜(型号为Tecnai G2 F20 U-TWIN)对PTX+Res脂质体_3进行检测，结果如图1a和图1b所示，由图1a和图1b可以看出，载药脂质体形成了较为均一的直径为70-1OOnm的颗粒。测试例2本测试例用于在细胞水平上检测本发明的载药脂质体的活性。细胞实验1:在96孔板中接种MCF-7敏感细胞(人乳腺癌细胞)，接种量为5000个细胞/孔，细胞贴壁后加药，根据药物的不同分为4组，分别是:(I)生理盐水组；(2)脂质体组(单独加入对比例3制得的长循环脂质体);(3)紫杉醇脂质体组(加入对比例I制得的PTX脂质体)，其中，紫杉醇的在培养基中的终浓度为Syg/ml ；(4)同时包裹紫杉醇和白藜芦醇的脂质体组(PTX+Res脂质体)，其中，包括4个小组，分别加入实施例1-4制得的PTX+Res脂质体-1、PTX+Res脂质体-2、PTX+Res脂质体-3和PTX+Res脂质体_4，其中，各组中紫杉醇在培养基中的终浓度均为5 μ g/ml，而白藜芦醇的终浓度分别是5，15，25，50 μ g/ml，每个浓度6个重复孔；其中，(2)和(4)中加入PTX+Res脂质体-2的组中的脂质体加入量均相同。在加药24h，48h，72h后用MTS试剂盒检测OD值。细胞实验2:根据与细胞实验I相同的方法进行检测，不同的是，接种MCF-7紫杉醇抗性细胞。细胞实验2的结果如图2a-2b、3a-3b和4a_4b所示。图2a和图2b为处理24小时后的结果，其中，纵轴表示测得的OD值，其反映出存活细胞的数量，各组柱状图反映出生理盐水组、脂质体组、紫杉醇脂质体组，以及PTX+Res脂质体-1至PTX+Res脂质体-4中的一组的测试结果(横轴表示白藜芦醇在培养基中的终浓度，从左至右依次为PTX+Res脂质体-1至PTX+Res脂质体-4的测试结果)。图2a为对MCF-7敏感细胞的检测结果，图2b为对紫杉醇耐药性乳腺癌细胞(MCF-7抗性细胞)的检测结果。图2a中，加入不同浓度的白藜芦醇的PTX+Res脂质体_1至PTX+Res脂质体_4对乳腺癌细胞的抑制活性与单独使用紫杉醇的抑制活性接近，甚至在加入低浓度的白藜芦醇时，PTX+Res脂质体-1至PTX+Res脂质体_4的抑制活性还差于单独使用紫杉醇的效果。但是从图2b中可以看出，紫杉醇脂质体对于紫杉醇耐药性肿瘤细胞几乎不再具有抑制活性，而根据本发明的载药脂质体PTX+Res脂质体-1至PTX+Res脂质体_4均具有明显的癌细胞抑制活性。并且，随着白藜芦醇浓度的增加，其抑制活性越来越显著。图3a和图3b为处理 48小时后的结果，其中，图3a为对MCF-7敏感细胞的检测结果，图3b为对MCF-7抗性细胞的检测结果。图3a和图3b与图2a和图2b的结果类似，力口入不同浓度的白藜芦醇的PTX+Res脂质体-1至PTX+Res脂质体-4对乳腺癌细胞的抑制活性与单独使用紫杉醇的抑制活性接近，但是，紫杉醇脂质体对于紫杉醇耐药性肿瘤细胞几乎不再具有抑制活性，而根据本发明的PTX+Res脂质体-1至PTX+Res脂质体_4均具有明显的癌细胞抑制活性。
图4a和图4b为处理72小时后的结果，其中，图4a为对MCF-7敏感细胞的检测结果，图4b为对MCF-7抗性细胞的检测结果。图4a和图4b与上述两组图的结果也类似，相比于图3a和图3b,图4a和图4b中的存活细胞的数目进一步下降。
由上述结果可以看出，本发明的载药脂质体特别适合于抑制紫杉醇抗性肿瘤细胞的发展和繁殖，并且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性，在处理72小时后，仍有明显的抗肿瘤活性，说明本发明的载药脂质体的抗肿瘤活性持久。
测试例3
本测试例用于在动物水平上检测本发明的载药脂质体对紫杉醇耐药的乳腺癌的抑制活性。
动物实验:通过皮下注射将MCF-7抗性细胞接种至16g Balb/c的裸鼠中，IO7个细胞/只，当肿瘤长至3mm时打药，共5组，分别是:
(I)生理盐水组，
(2)脂质体组(注射对比例3制得的脂质体)，
(3)紫杉醇脂质体组(注射对比例I制得的PTX脂质体，注射量为8mg/kg体重)，
(4)白藜芦醇脂质体组(注射对比例2制得的Res脂质体，注射量为20mg/kg体重)，
(5)同时包裹紫杉醇和白藜芦醇的脂质体组(注射实施例2制得的PTX+Res脂质体)，每天腹腔注射，紫杉醇注射量为8mg/kg体重，白藜芦醇注射量为20mg/kg体重。
其中，(2)组中的脂质体注射量与(5)组相同。注射2周后取出肿瘤照相，结果如图5所示(每组三个平行实验)。
由图5可以看出，与生理盐水组相比，单独使用紫杉醇脂质体和单独使用白藜芦醇脂质体已经无法对紫杉醇耐药的乳腺癌细胞产生抑制作用，但是，使用本发明的PTX+Res脂质体-2，即组合使用白藜芦醇和紫杉醇的载药脂质体对紫杉醇耐药的乳腺肿瘤产生明显的抑制。
动物实验结果进一步证明了本发明的载药脂质体对耐药性肿瘤具有强的抑制活性。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
权利要求
1.一种载药脂质体，其特征在于，该载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性组分，所述长循环脂质体为脂质体表面被二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000修饰的脂质体，所述药物活性组分为紫杉醇和白藜芦醇。
2.根据权利要求1所述的载药脂质体，其中，所述长循环脂质体与药物活性组分的摩尔比为 1: 0.001-0.5。
3.根据权利要求1所述的载药脂质体，其中，所述药物活性组分中，紫杉醇和白藜芦醇的摩尔比为I: 0.01-100。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的载药脂质体，其中，所述长循环脂质体中，脂质体与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000的摩尔比为1: 0.01-1。
5.一种载药脂质体的制备方法，其特征在于，该方法包括，利用薄膜-超声法，将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分制成所述载药脂质体，所述药物活性组分为紫杉醇和白藜芦醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分的摩尔比为I: 0.01-1: 0.001-0.5。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述药物活性组分中，紫杉醇和白藜芦醇的摩尔比为 I: 0.01-100。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述脂质体源为大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、蛋黄卵磷脂中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的方法，其中，所述薄膜-超声法中的超声条件包括，频率为200-800W，超声时间为5-30S，间隔时间为2-20S，循环次数为5-30次。
10.根据权利要求5-9中任意一项所述的方法，其中，所述薄膜-超声法包括以下步骤， (1)将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000、紫杉醇、白藜芦醇和第一有机溶剂混合，得到第一混合溶液， (2)蒸发去除第一混合溶液中的第一有机溶剂，形成薄膜， (3)将所述薄膜与纯水或生理盐水混合得到第二混合溶液，超声得到所述载药脂质体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述第一有机溶剂为无水乙醇、氯仿和甲醇中的至少一种。
12.根据权利要求10 所述的方法，其中，在第二混合溶液中，所述紫杉醇的浓度为I X105mol/L_10mol/L。
13.由权利要求5-12中任意一项所述的方法制得的载药脂质体。
14.权利要求1-4和13中任意一项所述的载药脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其中，所述肿瘤为耐药性肿瘤。
16.权利要求1-4和13中任意一项所述的载药脂质体在肿瘤治疗中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其中，所述肿瘤为耐药性肿瘤。
全文摘要
本发明提供一种载药脂质体，该载药脂质体包括长循环脂质体和包裹于其中的药物活性组分，所述药物活性组分为紫杉醇和白藜芦醇。本发明还提供一种载药脂质体的制备方法，该方法包括，利用薄膜-超声法，将脂质体源、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000和药物活性组分制成所述载药脂质体，所述药物活性组分为紫杉醇和白藜芦醇。以及提供由上述方法制得的载药脂质体。此外，本发明还提供上述脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用和在肿瘤治疗中的应用。本发明的载药脂质体含有紫杉醇和白藜芦醇，除了具有抑制药物敏感肿瘤发展的活性外，其还可有效地抑制化疗药物耐药性肿瘤的发展，具有极大的临床应用价值。
文档编号A61K9/127GK103142481SQ20111040211
公开日2013年6月12日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者杨先达, 孟洁, 王琛 申请人:国家纳米科学中心