专利名称：白细胞介素-27在制备抗甲型流感病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，更具体涉及白细胞介素-27在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。
背景技术：
流感病毒是引起流行性感冒的病原，甲型流感病毒呈球形，新分离的毒株则多呈丝状，其直径在80至120纳米之间，丝状流感病毒的长度可达400纳米。流感病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中以甲型流感对人类威胁最大。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型，而目前危害严重的高致病性禽流感病毒多为H5、H7和H9亚型，即H5m、H7N7、H9N2等，其中以H5m亚型病死率高。本发明主要以甲型流感病毒为研究对象，对白介素-27的抗病毒复制作用进行了探讨。流感病毒属正粘病毒科，是单股负链RNA病毒，基因组约为13. 61Λ，具有包膜的8 个片段，共编码11种蛋白质的单链负RNA病毒。与其他RNA病毒不同的是，流感病毒所有 RNA(mRNA、cRNA, vRNA)的合成均在被感染细胞的核内完成。mRNA在核内合成后转移到胞浆，合成病毒的结构和非结构蛋白；而后开始装配流感病毒，完成后以出芽方式释放出子代病毒颗粒，进一步侵入新的宿主细胞。目前，流感仍属未能有效控制的急性上呼吸道传染病。由于流感病毒的抗原变异能力强，加之个体免疫力的不同，疫苗的保护率并不高，且疫苗只对已知的流感病毒亚型有预防作用，而对于由抗原性漂移或抗原性转换所产生的新型流感病毒无效。流感病毒感染将导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其它上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。流感病毒不仅感染人类而且感染畜禽类，给人类和畜禽的健康造成极大的威胁。白细胞介素27 (Interleukin 27，IL-27)是最近发现的I型细胞因子IL-6/IL-12 家族的新成员。IL-27是一个异源二聚体蛋白，由P^和Epstein-Barr病毒诱导3蛋白组成。通过由TCCR/WSX-1组成的受体介导信号传导。IL-27具有促进炎症和抑制炎症的作用，在桥接先天免疫和适应性免疫中起到重要作用，并且调控INF-α、IFN-γ、IL-10、IL-17 和IL-21的表达。除此以外，IL-27还具有抑制HIV在⑶4+T细胞中复制，抑制HCV和HCV/ HIV共感染。IL-27通过与IL-27受体结合后，激活STATl，继而促进转录因子T_bet、IL-12Rβ 和IFN-γ等的表达。在IL-27高表达的病毒性肝炎和肿瘤模型中，可增强⑶8+Τ细胞 IFN-Y产生，增强细胞毒作用和对肿瘤的清除能力。在自身免疫性疾病动物模型中如关节炎，IL-27可促进炎性反应，而IL-27特异性抗体可改善动物模型中的炎性反应。然而，在一些寄生虫和细菌感染的IL-27受体缺失动物模型中，IL-27却主要表现为T细胞反应的拮抗因子。虽然内源性IL-27在感染过程中促进细胞免疫反应的证据有限，但是一些研究显示它能促进自身免疫性疾病动物模型和肿瘤动物模型的炎症反应。在IL-27高表达的病毒性肝炎和肿瘤模型中，可增强CD8+T细胞INF- γ产生，增强细胞毒作用和对肿瘤的清除能力。另外，有报道在严重的由佐剂诱导的关节炎大鼠模型和EAE小鼠模型可通过使用IL-27 特异性抗体从而改善其炎性反应，在后一模型中使用IL-27p^能显著增加INF-Y和TNF 的产生并放大炎症反应。虽然在最初的研究证实IL-27及其受体在促进Thl反应中扮演重要角色，但最近的研究表明它们同时也抑制不同的免疫细胞反应的过程，包括抑制免疫细胞的增殖和细胞因子的产生。IL-27及其受体的这种相互矛盾的作用，既可促进炎症反应又可抑制炎症反应，可能对调解控制机体的免疫平衡起到重要作用，进一步深入研究IL-27及其受体的生物学功能可更加完善地了解机体的免疫系统及免疫过程，从而为人们对控制和预防疾病将起到至关重要的作用。
发明内容
本发明研究白细胞介素-27在流感病毒复制中的作用，探讨流感病毒感染后诱导白介素-27表达上调的作用机制，从而揭示出白细胞介素-27在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。白细胞介素-27在细胞和分子水平上对流感病毒复制有抑制作用，预示IL-27可以做为临床抗病毒药物而进一步研究开发。通过流感病毒感染上调IL-27在A549细胞和人外周血细胞中的表达实验证实了流感病毒感染人外周血细胞能上调IL-27的表达，并以 A549细胞作为细胞模型来研究流感病毒诱导IL-27表达的分子机制；通过流感病毒感染通过CREB激活IL-27/EBI3启动子实验确定了转录调控因子CREB在A型流感病毒感染激活 EBI3启动子的过程中是必需的；通过PKA是A型流感病毒通过CREB激活IL-27/EBI3启动子的上游信号通路的实验，我们可以得出A型流感病毒感染通过PKA信号通路激活CREB，促进CREB结合到IL-27/EBI3启动子，激活IL-27表达，同时，Ca离子信号通路又在PKA-CREB 信号通路的上游；通过流感病毒通过C0X-2/PGE2-PKA通路诱导IL-27表达实验我们得出A 型流感病毒感染诱导炎症因子C0X-2的高表达和其催化产物PGE2的累积，PGE2累积则激活 PKA-CREB信号通路，最后促进IL-27/EBI3启动子的活化和IL-27的表达；通过IL-27可以通过激活PKR来抑制流感病毒的复制实验我们得出流感病毒感染上调IL-27的表达是机体应对病毒的入侵，自我防卫的免疫机制，IL-27能起到类似干扰素的作用，激活抗病毒信号激活因子STATl和STAT2，促进抗病毒因子PKR的磷酸化，最终抑制流感病毒的复制；通过 IL-27在流感病人血清中表达水平和血清PGE2的临床相关性实验验证了签名细胞水平上 IL-27表和PGE2的关系，进一步说明了流感病毒感染，PGE2表达和IL-27上调的相关性。总体实验揭示了尚未被发现的A型流感病毒感染诱导IL-27表达的机制。即A型流感病毒感染后，激活炎症因子C0X-2的表达，C0X-2催化机体产生大量的PGE2，PGE2促及PKA的磷酸化，磷酸化后的PKA具有激酶活性，激活转录因子CREB转核并结合到IL-27/ EBI3的启动子上，促进IL-27的表达。同时A型流感病毒感染也能激活Ca依赖的PKA-CREB 信号通路，后者也能促进IL-27的表达。机体应答流感病毒的感染产生的大量IL-27，IL-27 发挥类似与干扰素的作用，激活抗病毒信号通路和促进抗病毒因子的表达，最后抑制流感病毒的复制。临床上，IL-27在流感病毒感染者血清中的高表达以及和PGE2的相关性，反过来证明了这里实验在细胞水平的结果和临床一致。本发明揭示了尚未被发现的A型流感病毒感染诱导IL-27表达的机制。在流感病毒感染细胞后能促进IL-27表达的上调，抑制病毒的复制，这一新发现为研制流感病毒药物提供基础。本发明实验结果说明，白细胞介素-27是一种很有潜力的抗甲型流感病毒药物， 可以用于制备抗甲型流感病毒药物。本发明也公开了抗甲型流感病毒的药物，其中含有白细胞介素-27，其制备方法按制药工业现有技术制备。
图IA型流感病毒可以上调IL-27在A549细胞和PBMCs中的表达。A. A/Hong Kong/H3N2感染上调IL-27在A549细胞中的表达。B. A/Hong Kong/H3N2 感染上调 IL-27 在 PBMCs 中的表达。C. A/Hong Kong/H3N2感染后，IL-27在单核细胞和淋巴细胞中的表达情况。D. A/Hong Kong/H3N2 感染 PBMCs 后，IL-27 表达呈时间趋势。E. A/Hong Kong/H3N2感染PBMCs后，IL-27两个亚基基因的表达呈时间趋势。图2CREB在A型流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子中是必须的。A. CREB截短和突变对A型流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子的影响。B. SiCREB敲除对A型流感病毒感染激活IL-27/EBI3启动子的影响。C. A型流感病毒感染促进CREB转核。D. A型流感病毒感染促进CREB结合到IL-27/EBI3启动子。图3流感病毒通过PKA信号通路促进CREB激活IL-27/EBI3启动子和IL-27表达。A.蛋白酶抑制剂筛选。B. PKA抑制剂H-89抑制流感病毒诱导IL-27表达。C.流感病毒感染促进PKA磷酸化。D. PKA抑制剂H-89抑制流感病毒促进CREB转核。图4有机化学试剂对细胞活性和病毒感染的影响。A.各种有机化学试剂对细胞活性的影响。B.各种有机化学试剂对流感病毒感染的影响，以病毒的NP蛋白是否存在来表示化学试剂是否影响了病毒的感染。图5Ca离子参与了流感病毒通过PKA-CREB通路诱导IL-27表达。A-B. Ca离子螯合剂EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒激活IL-27/EBI3启动子。C. Ca离子螯合剂EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒诱导IL-27表达。D. Ca离子螯合剂EGTA和BAPTA/AM抑制流感病毒促进CREB转核。图6A型流感病毒通过C0X-2/PGE2-PKA信号通路诱导IL-27表达。A-C.过表达C0X-2上调IL-27表达，促进CREB转核和PKA磷酸化。D-F.抑制C0X-2可抑制流感病毒感染诱导的IL-27表达，CREB转核和PKA磷酸化而外源PGE2可以回复抑制。G-I. PGE2可以单独上调IL-27表达，促进CREB转核和PKA磷酸化，而这些诱导可以被PKA抑制剂所抑制。图7重组人IL-27抑制流感病毒的复制。图8IL-27抗流感病毒的机制。图9IL-27的临床水平和PGE2的相关性。
具体实施例方式白细胞介素-27目前已经商品化，可以直接购得成品的白细胞介素-27。一、流感病毒感染上调IL-27在A549细胞和PBMCs中的表达(一 )实验材料1、临床样本健康人全血来自献血志愿者。2、生化试剂及试剂盒人外周血单核细胞(PBMCs)分离试齐[J pyrogen-free saline over Histopaque (Sigma, St. Louis, MO, USA)购自武汉天源生物技术公司。LEGEND MAX Human IL-27 ELISA kit 购自 BioLegend(San Diego, CA, USA)。总RNA 提取试剂盒 RNeasy Mini Kit 购自 Qigen (Dusselforf, Germany)。F12K 培养基，RPMI 1640 培养基和胎牛血清(Gibco-BRL，Gaithersburg, MD)购自武汉生命生物技术公司。细胞用青霉素和链霉素购自武汉大学校医院。3、细胞和病毒毒株人肺癌细胞系A549和A型流感病毒毒株A/HongKong/498/97H3N2由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，由本实验室保存。4、逆转录酶等M-MLV逆转录酶够自Promega公司。dNTP和荧光定量预混合物购自hvitrogen公司。Oligo dT(18T)和 RNase 抑制剂 RNasin 购自 Invitrogen 公司。5、耗材及仪器细胞培养板、细胞培养皿和细胞培养瓶购自Corning公司。4°C高速离心机、台式小型高速离心机、二氧化碳细胞培养箱和细胞操作台购自 Herus0超纯水系统购自Millipore。荧光定量PCR 系统 LightCycler480II 购自 Roche。RNA提取所使用的RNase free的各种型号枪头和EP管购自Eppendorf。常规PCR仪购自东胜创新。( 二)实验方法1、哺乳动物细胞(贴壁)的培养(1)细胞复苏1)预先准备好37°C _38°C温水，从液氮罐中取出需要复苏的细胞，用眼科手术镊子固定，迅速置于水中，保证冻存管完全浸没与水中，使其均勻受热，直到冻存管内的细胞完全融化。2)用酒精消毒冻存管。3)用吸管预先吸取5ml细胞培养基于T25细胞培养瓶中，再用新的吸管将融化的细胞转移到细胞瓶中并轻轻吹打一遍。4)盖好细胞瓶盖，将细胞瓶放置于细胞培养箱中，37°C，5% (体积比)CO2静置培养。5)约6-8小时后(取决于不同的细胞)，更换信息培养基以消除细胞冻存液中存留的DMSO对细胞生长的影响。(2)细胞的传代和冻存1)当细胞长满T25细胞瓶后，用吸管吸取培养基并弃去。2)加入IOml的PBS，轻柔洗涤细胞后用吸管吸取并弃去。3)用吸管吸取1-1. 5ml胰酶，使其覆盖住细胞瓶底部，将细胞瓶放入37°C，5% CO2 细胞培养箱静止3-5min(消化时间的长短取决于细胞种类)。4)显微镜观察，贴壁细胞变圆并且全部从细胞瓶壁脱离。5)在细胞操作台内，用吸管吸取约培养基，加入细胞瓶内，轻柔的吹打，以吹散细胞和中和胰酶的消化效果。6)用吸管吸取吹勻的细胞悬液(体积约1/3-2/3)到另一新的细胞瓶，再补加5ml 的培养基，放置于细胞培养箱中，37V,5% (体积比)CO2的环境下继续静置培养。(3)细胞的冻存1)处于生长旺盛期的细胞用胰酶消化下后，转移到细胞离心管中，2000rpm离心 5min。2)用全血清重悬细胞，加入终浓度10% (质量比)的冻存液DMS0，吹勻后分装到细胞冻存关。3)做好标记后，进行梯度降温冻存细胞，即4°C放置lh，_20°C放置lh，_80°C过夜， 再转到液氮罐中冻存。2、单核细胞(monocytes)和淋巴细胞(lymphocytes)PBMCs分离好计数，按一定的量接种于M孔细胞培养板，放置37°C，5% (体积比) CO2细胞培养箱静置培养池，此时单核细胞均贴壁生长，而淋巴细胞则悬浮生长。用移液器将培养全部转移到新的细胞培养板培养即分离得到淋巴细胞，再补充原体积的培养基到原细胞培养板中，即分离得到单核细胞。H3N2感染，polyI:C处理A549细胞、PBMCs、单核细胞和淋巴细胞。H3N2感染或polyl C诱导A549前，将含有胎牛血清的完全培养基换成无血清培养基，H3N2感染的剂量为IMOI，polyl:C的终浓度为50 μ g。PBMCs，单核细胞和淋巴细胞的处理由于分离后为无血清培养基培养，所以无需更换培养基，处理方法同A549细胞。感染或处理24h后，收集培养上清进行下一步实验。3、ELISA试剂盒检测 IL-27 表达水平(根据 LEGEND MAX Human IL-27 ELISAKit)1)使用前lh，将试剂盒所有试剂放到室温平衡。2)准备500 μ 1浓度为16ng/ml的标准曲线母液。在6个EP管中依次倍比稀释母液，得到浓度为 8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、lng/ml、0. 5ng/ml 和 0. 25ng/ml 的标准品，另外以稀释液作为Ong/ml。3)每孔加入300 μ 1 IX漂洗缓冲液振荡洗涤所需要的ELISA板，吸水纸上拍干，
重复4次。4)每孔加入50 μ 1 Assay Buffer A和50 μ 1标准品或待测样品，标准品和待测样品均做3个复孔作为重复。5)用ELISA板密封膜将所以空密封，室温，水平摇床放置池。6)弃去ELISA板中的溶液，每孔加入300 μ 1 IX漂洗缓冲液振荡洗涤，并在吸水纸上拍干，重复4次。7)每孔加入100 μ 1 IL-27检测抗体，用密封膜封好，室温，水平摇床放置lh。8)弃去ELISA板中的溶液，每孔加入300 μ 1 IX漂洗缓冲液振荡洗涤，并在吸水
纸上拍干，重复4次。9)每空加入100 μ 1 Avidin-HRP A溶液，用密封膜封好，避光，室温，水平摇床放置 lh。10)弃去ELISA板中的溶液，每孔加入300 μ 1 1 X漂洗缓冲液振荡洗涤，并在吸水纸上拍干，重复5次。加入漂洗缓冲液后静置30s到lmin，有助于减少背景。11)每孔加入100 μ 1底物溶液F，室温避光放置15min，IL-27含量高的孔，此时溶
液颜色会变蓝。12)每孔加入100 μ 1终止液，此时此时溶液颜色变成黄色。13) 30min内，酶标仪450nm参考波长，570nm校正波长读板，450nm波长下的读数减去570nm波长下的读数即为最后的读数。4、荧光定量PCR检测IL-27两个亚基EBI3和p28的mRNA表达水平(1)细胞总 RNA的提取(以用Qiagen试剂盒提前6孔板培养贴壁细胞为例)1)用移液枪吸取细胞培养板每个孔中的培养基并弃去，加入Iml预冷的PBS漂洗细胞2次。2)加入600μ 1 Buffer RLT Plus，用枪反复吹吸，使细胞裂解均勻。3)将细胞裂解液转移至除gDNA的离心柱中，12000rpm离心30s，弃去离心柱，留溶液。4)加入1200 μ 1 70% (体积比)的乙醇到含离心溶液离心管中，轻轻吹打混勻。5)每700 μ 1混合物转移到RNeasy离心柱中，12000rpm离心15s，保留离心柱，弃
去离心所得。6)向离心柱中加入500μ1 Buffer RPE，12000rpm离心15s，漂洗离心柱，弃去离心所得。7)向离心柱中加入500μ1 Buffer RPE，12000rpm离心2min，漂洗离心柱。8)将离心柱转移到新的套管中，12000rpm离心lmin，以除去残余的漂洗液。9)将离心柱转移到新的套管中，加入50μ 1 RNase-free水溶解挂在离心柱上的 RNA, 12000rpm离心Imin得到总RNA，取2 μ 1 RNA溶液，在测定RNA浓度以进行下一步实验。(2)逆转录荧光定量PCR检测目的基因mRNA的表达水平1)在 PCR 管中按如下体系依次加入 M-MLV IOXbuffer 2. 5 μ 1，RNasin 0. 5μ 1，dNTP 2 μ 1，Olgio dT 3 μ 1，M-MLV 1 μ 1，用 RNase-free 水补足总体积至 25
Total RNA 溶液200 ngM-MLV 10 X缓冲液2.5 μ 1RNasin0.5 μ 1dNTP IOmM2μ 1Olgio dT3 μ 1M-MLV1 μ 1补足RNase-free水至25 μ 1
2)逆转录反应条件:37°C lh, 75°C IOmin
Real-time反应体系
1)目的基因的检测引物和内参引物
EBI3 :5’ -GAGCCAGGTACTACGTCCAA-3’(正义链，SEQ ID NO 1)
5，-GCTAGGCAGATCCCATCC-3，(反义链，SEQ ID NO 2)
p28 :5，-CGCTTTGCGGAATCTCAC-3，(正义链，SEQ ID NO 3),
5，-GGGCATGGAAGGGCTGAA-3，(反义链，SEQ ID NO 4)
GAPDH :5，-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3，(正义链，SEQ ID NO
5' -CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3‘(反义链，SEQ ID NO 6)
2)反应体系L
2 X Real-time 混合物10μ 1cDNA产物2μ 1primer正义链2μ 1primer反义链2μ 1
补足RNase-free水至
25 μ 1
3)反应条件
95 "C 95 "C 56 "C
72°C(采集荧光信号) 56 "C
5 min 30 s 30 s 30 s 1 min
I^I
45循环
溶解曲线分析
95 V
(三)实验结果和讨论
当A型流感病毒1 MOI A/Hong Kong/H3N2感染A549细胞M小时或终浓度为50 μ g/ml的polyl :C作为模拟流感病毒复制过程中产生的dsRNA模型作为对照诱导A549 细胞M小时后，和对照组相比IL-27的表达量都有显著提高。病毒感染使IL-27的表达量从 176. 45士 19. 81pg/ml 上升到 327. 73士 13. 50pg/ml ；polyl :C 诱导使 IL-27 的表达量上升到245.88±21.36pg/ml(图1A)。同样的处理，在PBMCs中，H3N2感染使IL-27的表达量从 98. 00士26. 43pg/ml 上升到 309. 73士91. 54pg/ml ；polyl :C 诱导使 IL-27 的表达量上升到198. 17 士 37. 69pg/ml (图IB)。由于PBMCs是淋巴细胞(B细胞和T细胞)、单核细胞 (包括为分化的单核细胞、由单核细胞分化而来的巨噬细胞和树突状细胞)的混合物。为了区分流感病毒感染哪一种类的细胞，淋巴细胞还是单核细胞，在分泌IL-27起主要作用， 我们又用IMOI的病毒或50 μ g/ml的polyl C分别感染或诱导贴壁生长的单核细胞和悬浮生长的淋巴细胞，结果显示两种细胞类型在应答流感病毒感染或polyl C诱导时都产生大量的IL-27，但两种细胞相比并无显著性差异(图1C)。因此，后面感染PBMCs实验不再区分细胞类型。接着我们用1M0I H3N2感染PBMCs，再不同的时间点检测IL-27的表达情况。 结果显示，流感病毒感染PBMCs后，IL-27的表达呈现出时间梯度，对比0小时的IL-27表达量84. 24 士 20. 77pg/ml，感染6小时后的表达量上升为342. 00 士 13. 41pg/ml ；感染12小时后的表达量升到顶峰，为411. 04士38. 52pg/ml ；到M小时，IL-27的表达量略有下降，为 312. 49士26. 68pg/ml ；到 48 小时，IL-27 的表达量则进一步下降，为 167. 10士 18. 02pg/ml, 但仍显著高于感染0小时的表达(图ID)。由于IL-27是一个异源二聚体复合物，我们进一步检测的流感病毒感染后，IL-27的两个亚基EBI3和p^基因的表达情况。和IL-27蛋白表达水平一样，两个亚基EBI3和p^基因的表达水平也呈现出时间梯度。和0小时相比， 感染6小时后，EBI3和p^基因的表达水平即显著上调。到12小时，p28基因的表达水平即达到峰值，并且从M小时到48小时开始逐渐降低；EBI3基因的表达水平则在感染后M 小时达到峰值，并且也是到48小时开始降低(图1E)。该部分实验表明流感病毒感染PBMCs能上调IL-27的表达。而感染A549细胞也同样能上调IL-27的表达则为我们的后续实验，即A549细胞可以作为细胞模型来研究流感病毒诱导IL-27表达的分子机制。对于流感病毒感染PBMCs后，IL-27的两个亚基EBI3和 P28基因的表达水平在时间上不同步。P^基因的表达比EBI3基因的表达早12小时达到峰值，也印证了别人研究的结果，即P^的表达比EBI3早10-12小时。二、流感病毒感染通过CREB激活IL-27/EBI3启动子(一)实验材料1、细胞及病毒株同前所述。2、生化试剂及试剂盒转染试剂 Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)。荧光素酶活性报告基因试剂盒购自Promega公司。高纯度基因组DNA提取试剂盒购自Qigen公司。核抽提物试剂盒购自Chemicon公司。DNA胶回收试剂盒购自Tiangen公司。兔多克隆抗体CREB，鼠单克隆抗体lamin A，prtoeinA/G购自Santa CruzBiotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA)。
3、工具酶和质粒载体高保真Taq酶KOD购自日本Τ0Υ0Β0公司。限制性内切酶MluI and BglII购自大连Takara公司。限制性内切酶DpnI购自晶美公司。
T4 DNA连接酶购自Promega公司。pGL3载体购自Promega公司，由本室保存。pSliencer2. lU6_neo购自美国Ambion公司，由本室保存。pSliencer2. 1 U6_siCREB 有本室构建保存。4、感受态细菌DH5a由本室保存。5、耗材及仪器荧光素酶活性检测仪。超声破碎仪、16°C低温连接水浴锅购自Fisher公司。凝胶成像系统、电泳仪及Western转膜仪购自北京君意东方公司。Western扫描系统购自日本富士公司。(二)实验方法1、IL-27/EBI3启动子的预测、克隆、截短和突变启动子的预测由在线软件 http //www. genomatix. de/cgi-bin/. /eldorado/ main, pi 完成。2、IL-27/EBI3启动子的克隆之人基因组DNA的提取(以Qigen细胞基因组DNA提取试剂盒从H3N2感染的PBMCs提取DNA为例)1)H3N2感染PBMCs如前所述。2)用细胞刮轻轻刮动细胞生长面，使细胞全部从细胞培养板的生长面脱落，悬浮于培养液中。3)用移液枪将悬浮液转移至EP管，500g离心;3min以收集细胞。4)加入预冷的PBS，重新悬浮细胞，500g离心;3min以清洗细胞，除去培养基。5)除去上清，加入Iml细胞裂解液，用移液枪反复吹打，是细胞均勻重悬，37°C放置，直至溶液均勻无细胞块存在。6)加入 15 μ 1 RNase A，37°C放置 5min 以除去 RNA。7)加入Iml蛋白沉淀溶液，振荡器最高速度振荡20s。8) 13000g离心lmin，将上清转移到15ml离心管中，加入3ml异丙醇并上下颠倒轻柔混勻50次。9) 13000g离心lmin，弃去上清，此时DNA作为可见的白色小团被离到管底。10)加入:3ml 70 % (体积比)乙醇，上下颠倒洗涤DNA团。ll) 13000g离心lmin，弃去上清，空气中干燥DNA团。12)加入250 μ 1 DNA溶解液，中速振荡以促进DNA溶解。13) 65°C放置Ih以彻底溶解DNA，此时得到的DNA将作为模版供PCR使用。3、IL-27/EBI3启动子的克隆、截短和突变1)引物
正义链5，-CTACGCGTTCTGTCATCCCCCTT-3，,(SEQ ID NO 7)反义链5’ -ATTAGATCTAGACATGATCCGAGGCCAGTCCTCG-3，(SEQ IDNO 8)-464/+142 正义链5，-CTACGCGTGTCTCTGTATCCCTC-3，, (SEQ ID NO 9)-105/+142 正义链5，-CTACGCGTGGCCTGTGCTCCCCA-3，, (SEQ ID NO 10)+50/+142 正义链5，-CTACGCGTTCCCACGACGTTCCC-3’ (SEQ ID NO 11)2)反应体系
权利要求
1.白细胞介素-27用于制备抗甲型流感病毒药物。
2.抗甲型流感病毒的药物，其中含有白细胞介素-27。
全文摘要
本发明公开了白细胞介素-27在制备抗流感病毒药物中的应用。本发明证实白细胞介素-27在体外对A型流感病毒具有良好的抑制流感病毒复制的作用。用蛋白抗体芯片技术筛选到流感病毒感染的病人血清和体外感染的PBMCs中，IL-27都是显著上调的，并且，A型流感病毒通过促炎因子COX-2激活PKA-CREB通路IL-27的表达，IL-27起到类似干扰素的作用来抑制病毒复制。
文档编号A61P31/16GK102416164SQ20111041078
公开日2012年4月18日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者刘礼, 吴建国, 曹中莹, 朱应 申请人:武汉大学