专利名称：一种生物可降解高分子血管支架及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种血管支架及其制备方法，特别是涉及一种生物可降解高分子血管支架及其制备方法，属于组织工程领域。
背景技术：
血管修复一直是一个世界性难题。目前血管修复的临床方式还是用正常的自体静脉或动脉用于移植静脉或动脉，但移植后的血管的远期通畅率一直不理想。同时，目前的一些干预方法，如药物、血管吻合口外支架等，已经能够起到一定的防治移植血管血栓形成和内膜增生效果，但自体移植给病人带来的伤害难以去除。研究认为找到一种合理的人工制备的血管支架代替自体移植是一条有效的血管修复途径。合理的可降解的血管外支架(或内支架)应该满足以下几个要求:
(1)支架的材料生物可降解，且降解速率应该能够调节；
(2)支架具有一定的机械性能，能够为血管提供足够的支撑强度；
(3)支架最里层可能直接与血接触，应为平滑的表层，防止形成血栓；
(4)具有一定的机械性能，能够为血管提供足够的支撑强度
(5)具有良好的生物相容性，不能影响组织活性和功能。目前已经有一些血管修复的组织工程支架在进行临床研究，但都存在着各种问题。现在普遍使用的镁钛合金的血管支架或内支架，这类支架自身不可降解，同时不能种植细胞种子，其生物相容性也优劣各异。而可降解的材料血管修复的组织工程支架公开的较少。目前已有的血管修复的组织工程支架中公开的一种聚羟基脂肪酸酯血管支架。支架由多孔内膜层、实心外膜和加强筋三层构成，材料全部选用可降解的聚羟基脂肪酸酯和聚乙二醇/对苯二甲酸丁二醇酯组成。三层支架的设计加大了制备工艺难度。采用盐析法制备孔内膜层时使用了大量的食盐颗粒、蔗糖颗粒等不溶于有机溶剂的颗粒状物质做为致孔剂，低温处理并冷冻干燥后，将支架浸泡在水中溶解包埋在内部的食盐颗粒或蔗糖颗粒，如果颗粒分布稀疏，颗粒被完全孤立在高分子材料内部，使外部的水没有通道进入颗粒所在位置；或者在水中经泡时间不足，上述问题都可能导致在细胞培养阶段，残余的颗粒再次进入培养基导致细胞死亡。同时，三层支架的设计差异很大的三种材料(混合材料)构成，体内材料降解不同步可能导致血管畸形或血栓。制备过程中需要大量的水浸泡支架，其时间也较长一般为一周以上，加大制备成本。
同时也有另一种血管支架采用溶剂挥发法来制备。支架全部只有高分子材料聚羟基脂肪酸酯一类材料组成，材料较为单一，其制备的血管支架的抗压，拉伸，抗扭曲及体内降解能力可控性不大；采用毒性很强的笨作为有机溶剂，操作危险；将高分子材料加热溶解于笨中，需要倒入专用的模具中，低温冷却后再进行冷冻干燥处理；最终得到的血管支架为多孔的管状结构，但没有多层结构，支架内外表面均为孔状结构，与血细胞接触的一面，可能出现血细胞在流动时候停留甚至支架内的现象，导致血栓。目前需要一种能起到支撑血管空间的能力又能具有多孔结构提供合理的三维空间便于血管组织相关的细胞的种植和增殖。
发明内容
本发明目的是提供一种生物可降解的高分子制备的血管支架，用于解决血管组织工程领域中的血管修复这一难题。本发明的另一目的是提供上述血管支架的制备方法。本发明提供一种生物可降解高分子血管支架，其特征在于，所述血管支架分成内外两层独立的结构，其外层结构具有多孔的三维结构，微孔为不规则变化分布，孔径大小为20-400 μ m,可种植细胞，有良好的生物相容性，内层支架能承受具有强大的扩张力，挤压时候有助于支架形状的恢复 。支架的内层和外层全由生物可完全降解的高分子材料制备。所述的血管支架内层材料为乳酸己内酯共聚物。所述的血管支架外层材料为聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物、羟基丁酸-羟基戊酸共聚物中的一种或其组合。本发明提供一种生物可降解高分子血管支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
(1)制备血管支架内层:乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解溶解，形成有机相I，用玻璃棒插入到有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温下风干；
(2)制备血管支架外层:碳酸氢铵溶解于水中，常温溶解，形成水相。称取一定量的聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物或者羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解，形成有机相II ;
将水相和有机相II进行匀浆混合处理，形成乳化液；
将步骤(I)中风干的玻璃棒插入(2)中乳化液中，适度搅拌后马上抽出并常温自然风干，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到生物可降解高分子血管支架。步骤(2)所述有机相I中高分子材料的浓度为10-20% (g/100ml)。步骤(2)所述有机相II中高分子材料的浓度为5-40% (g/100ml)。步骤(2)所述水相中致孔剂碳酸氢铵溶液浓度为5-20% (g/100ml)。步骤(2)所述水相和有机相II混合的体积比为1:3 1:4.5。为了获得血管支架所需的厚度，制备内层和外层时，模具插入有机相I或乳化液可分别重复1-5次，每次应间隔5-15分钟风干处理。本发明制备的血管支架具有以下优点:
(1)血管支架所用的材料为生物可完全降解的高分子材料制备，具有良好的生物相容
性；
(2)血管支架具有独立的内外两层结构，外层结构具有多孔的三维立体支架结构，可以种细胞；
(3)血管支架成品没有其他杂志和有机溶剂的残留；(4)其制备工艺简单，设备要求低，制备的成本低廉，制备时间短。
图1为本发明制备的血管支架的结构示意图。I为血管支架壁厚，2为血管支架内径，3为血管支架内层，4为血管支架外层。图2为血管支架内层的平滑结构的示意图。图3为血管支架外层的多孔结构的示意图。图4为本发明制备的血管支架的微观结构的扫描电子显微镜图。
具体实施例方式实施例1:
制备内直径为3mm，外层微观多孔结构的平均孔径大小为100-200 μ m的乳酸己内酯共聚物(70:30)/ (聚乳酸/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物)血管支架。制备的步骤如下:
(1)称取2g乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于20ml的三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时溶解，形成有机相I，用直径为3mm的不锈钢棒插入上述的有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温挥发6小时；
(2)称取20g碳酸氢铵溶解于IOOml 水中，常温溶解I小时，形成水相。称取4g聚乳酸和2g羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于20ml 二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时，形成有机相II。随后将水相和有机相II按照体积比1:3的比例进行匀浆混合处理，形成乳化液。(3)将(I)中的不锈钢棒插入(2)中乳化液中，马上抽出并常温干燥6小时，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到高分子血管支架。所得的高分子血管支架具有韧性和刚性，可以卷曲对折而不断裂，挤压后可以形变回复到原先状态。高分子血管支架结构分成为内层和外层，内层为平滑的乳酸己内酯共聚物(70:30)层，外层为多孔状的聚乳酸/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物层。利用游标卡尺测量高分子血管支架的内直径和厚度，分别测量4次并取平均值。利用扫描电镜观察血管支架外层微观多孔结构并测量孔径大小，随机记录1000个孔径，并求得平均值。高分子血管支架结构的平均内直径为3.1lmm,支架的平均厚度为602 μ m,外层微观多孔结构的平均孔径大小为193.63 μ m。生物学活性或毒性反应分级评价为I级，具体的细胞相对增殖率(relative growth rate, RGR)见表I。实施例2:
制备内直径为3mm，外层微观多孔结构的平均孔径大小为200-500 μ m的乳酸己内酯共聚物(70:30)-(聚乳酸/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物)血管支架。制备的步骤如下:
(I)称取2g乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于20ml的三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时溶解，形成有机相I，用直径为3mm的玻璃棒插入上述的有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温挥发6小时；
(2)称取20g碳酸氢铵溶解于IOOml水中，常温溶解I小时，形成水相。称取4g聚乳酸和2g羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于20ml 二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时，形成有机相II。随后将水相和有机相II按照体积比1:2.5的比例进行匀浆混合处理，形成乳化液。(3)将(I)中的玻璃棒插入(2)中乳化液中，马上抽出并常温干燥6小时，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到高分子血管支架。所得的高分子血管支架具有韧性和刚性，可以卷曲对折而不断裂，挤压后可以形变回复到原先状态。高分子血管支架结构分成为内层和外层，内层为平滑的乳酸己内酯共聚物(70:30)层，外层为多孔状的聚乳酸/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物层。利用游标卡尺测量高分子血管支架的内直径和厚度，分别测量4次并取平均值。利用扫描电镜观察血管支架外层微观多孔结构并测量孔径大小，随机记录1000个孔径，并求得平均值。高分子血管支架结构的平均内直径为3.43mm,支架的平均厚度为759 μ m,外层微观多孔结构的平均孔径大小为301.22 μ m。生物学活性或毒性反应分级评价为I级，具体的细胞相对增殖率见表I。实施例3:
制备内直径为4mm，外层微观多孔结构的平均孔径大小为100-200 μ m的乳酸己内酯共聚物(70:30)-(聚乳酸/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物)血管支架。制备的步骤如下:
(1)称取2g乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于20ml的三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时溶解，形成有机相I，用直径为4mm的玻璃棒插入上述的有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温挥发6小时；
(2)称取5g碳酸氢铵溶解于IOOml水中，常温溶解I小时，形成水相。称取4g聚乳酸和2g羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于20ml 二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时，形成有机相II。随后将水相和有机相II按照体积比1:4的比例进行匀浆混合处理，形成乳化液。(3)将(I)中的玻璃棒插入(2)中乳化液中，马上抽出并常温干燥6小时，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到高分子血管支架。所得的高分子血管支架具有韧性和刚性，可以卷曲对折而不断裂，挤压后可以形变回复到原先状态。高分子血管支架结构分成为内层和外层，内层为平滑的乳酸己内酯共聚物(70:30)层，外层为多孔状的聚乳酸/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物层。利用游标卡尺测量高分子血管支架的内直径和厚度，分别测量4次并取平均值。利用扫描电镜观察血管支架外层微观多孔结构并测量孔径大小，随机记录1000个孔径，并求得平均值。 高分子血管支架结构的平均内直径为4.31mm，支架的平均厚度为901 μ m，外层微观多孔结构的平均孔径大小为153.05 μ m。生物学活性或毒性反应分级评价为I级，具体的细胞相对增殖率见表I。实施例4:
制备内直径为4mm，外层微观多孔结构的平均孔径大小为200-500 μ m的乳酸己内酯共聚物(70:30)-(聚乳酸/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物)血管支架。制备的步骤如下:
(1)称取2g乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于20ml的三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时溶解，形成有机相I，用直径为4mm的玻璃棒插入上述的有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温挥发6小时；
(2)称取20g碳酸氢铵溶解于IOOml水中，常温溶解I小时，形成水相。称取4g聚乳酸和2g羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于20ml 二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时，形成有机相II。随后将水相和有机相II按照体积比1:4.5的比例进行匀浆混合处理，形成乳化液。(3)将(I)中的玻璃棒插入(2)中乳化液中，马上抽出并常温干燥6小时，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到高分子血管支架。所得的高分子血管支架具有韧性和刚性，可以卷曲对折而不断裂，挤压后可以形变回复到原先状态。高分子血管支架结构分成为内层和外层，内层为平滑的乳酸己内酯共聚物(70:30)层，外层为多孔 状的聚乳酸/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物层。利用游标卡尺测量高分子血管支架的内直径和厚度，分别测量4次并取平均值。利用扫描电镜观察血管支架外层微观多孔结构并测量孔径大小，随机记录1000个孔径，并求得平均值。高分子血管支架结构的平均内直径为4.57mm,支架的平均厚度为990 μ m,外层微观多孔结构的平均孔径大小为288.10 μ m。生物学活性或毒性反应分级评价为I级，具体的细胞相对增殖率见表I。实施例5:
制备内直径为3mm，外层微观多孔结构的平均孔径大小为50-100 μ m的乳酸己内酯共聚物(70:30 )-(乳酸乙醇酸共聚物/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物)血管支架。制备的步骤如下:
(1)称取2g乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于20ml的三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时溶解，形成有机相I，用直径为3mm的玻璃棒插入上述的有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温挥发6小时；
(2)称取IOg碳酸氢铵溶解于IOOml水中，常温溶解I小时，形成水相。称取4g乳酸乙醇酸共聚物和2g羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于20ml 二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时，形成有机相II。随后将水相和有机相II按照体积比1:3的比例进行匀浆混合处理，形成乳化液。(3)将(I)中的玻璃棒插入(2)中乳化液中，马上抽出并常温干燥6小时，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到高分子血管支架。所得的高分子血管支架具有韧性和刚性，可以卷曲对折而不断裂，挤压后可以形变回复到原先状态。
高分子血管支架结构分成为内层和外层，内层为平滑的乳酸己内酯共聚物(70:30)层，外层为多孔状的乳酸乙醇酸共聚物/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物层。利用游标卡尺测量高分子血管支架的内直径和厚度，分别测量4次并取平均值。利用扫描电镜观察血管支架外层微观多孔结构并测量孔径大小，随机记录1000个孔径，并求得平均值。高分子血管支架结构的平均内直径为3.20mm，支架的平均厚度为724 μ m，外层微观多孔结构的平均孔径大小为92.55 μ m。生物学活性或毒性反应分级评价为I级，具体的细胞相对增殖率见表I。实施例6:
制备内直径为3mm，外层微观多孔结构的平均孔径大小为100-200 μ m的乳酸己内酯共聚物(70:30 )-(乳酸乙醇酸共聚物/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物)血管支架。制备的步骤如下:
(1)称取2g乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于20ml的三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时溶解，形成有机相I，用直径为3mm的玻璃棒插入上述的有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温挥发6小时；
(2)称取20g碳酸氢铵溶解于IOOml水中，常温溶解I小时，形成水相。称取4g乳酸乙醇酸共聚物和2g羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于20ml 二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时，形成有机相II。随后将水相和有机相II按照体积比1:2.5的比例进行匀浆混合处理，形成乳化液。(3)将(I)中 的玻璃棒插入(2)中乳化液中，马上抽出并常温干燥6小时，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到高分子血管支架。所得的高分子血管支架具有韧性和刚性，可以卷曲对折而不断裂，挤压后可以形变回复到原先状态。高分子血管支架结构分成为内层和外层，内层为平滑的乳酸己内酯共聚物(70:30)层，外层为多孔状的乳酸乙醇酸共聚物/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物层。利用游标卡尺测量高分子血管支架的内直径和厚度，分别测量4次并取平均值。利用扫描电镜观察血管支架外层微观多孔结构并测量孔径大小，随机记录1000个孔径，并求得平均值。高分子血管支架结构的平均内直径为3.24mm，支架的平均厚度为800 μ m，外层微观多孔结构的平均孔径大小为151.27 μ m。生物学活性或毒性反应分级评价为I级，具体的细胞相对增殖率见表I。实施例7;
制备内直径为3_，外层微观多孔结构的平均孔径大小大于200 μ m的乳酸己内酯共聚物(70:30 )-(乳酸乙醇酸共聚物/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物)血管支架。制备的步骤如下:
(1)称取2g乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于20ml的三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时溶解，形成有机相I，用直径为3mm的玻璃棒插入上述的有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温挥发6小时；
(2)称取20g碳酸氢铵溶解于IOOml水中，常温溶解I小时，形成水相。称取4g乳酸乙醇酸共聚物和2g羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于20ml 二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解I小时，形成有机相II。随后将水相和有机相II按照体积比1:2的比例进行匀浆混合处理，形成乳化液。(3)将(I)中的玻璃棒插入(2)中乳化液中，马上抽出并常温干燥6小时，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到高分子血管支架。所得的高分子血管支架具有韧性和刚性，可以卷曲对折而不断裂，挤压后可以形变回复到原先状态。高分子血管支架结构分成为内层和外层，内层为平滑的乳酸己内酯共聚物(70:30)层，外层为多孔状的乳酸乙醇酸共聚物/羟基丁酸-羟基戊酸共聚物层。利用游标卡尺测量高分子血管支架的内直径和厚度，分别测量4次并取平均值。利用扫描电镜观察血管支架外层微观多孔结构并测量孔径大小，随机记录1000个孔径，并求得平均值。高分子血管 支架结构的平均内直径为3.37mm，支架的平均厚度为841.91μπι，外层微观多孔结构的平均孔径大小为277.30 μ m。生物学活性或毒性反应分级评价为I级，具体的细胞相对增殖率见表I。实施例1-7中所制备的高分子血管支架的生物相容性研究。将实施例1-7中所制备的高分子血管支架用手术刀切成长度为0.7cm左右的小段。灭菌处理后，分别放置在24孔板中。每孔分别接种上IO5个人平滑肌细胞，细胞培养箱中培养24小时，用细胞活性试剂盒CCK-8 (天根，中国)进行细胞活性测试，在450nm波长的滤光片下的OD值反应了细胞总活性。IO5个人平滑肌细胞接种在一个孔后，没有支架的细胞培养箱中培养24小时的为对照组。计算细胞相对增殖率(RGR)用以下公式:
RGR(%)=(样品 OD/ 对照 0D) *100%
细胞相对增殖率和毒性反应分级见表1:。表1血管支架细胞相对增殖率和毒性反应分级
权利要求
1.一种生物可降解高分子血管支架，其特征在于，所述血管支架分成内外两层独立的结构，其外层结构具有多孔的三维结构，微孔为不规则变化分布，孔径大小为20-400 μ m，可种植细胞，有良好的生物相容性，内层支架能承受具有强大的扩张力，挤压时候有助于支架形状的恢复。
2.根据权利要求1所述一种生物可降解高分子血管支架，其特征在于，支架的内层和外层全由生物可完全降解的高分子材料制备。
3.根据权利要求1所述一种生物可降解高分子血管支架，其特征在于，所述的血管支架内层材料为乳酸己内酯共聚物。
4.根据权利要求1所述一种生物可降解高分子血管支架，其特征在于，所述的血管支架外层材料为聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物、羟基丁酸-羟基戊酸共聚物中的一种或其组合。
5.根据权利要求1，或2，或3，或4所述一种生物可降解高分子血管支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (1)制备血管支架内层:乳酸己内酯共聚物(70:30)溶解于三氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解溶解，形成有机相I，用玻璃棒插入到有机相I中，适度搅拌后马上竖直取出，在常温下风干； (2)制备血管支架外 层:碳酸氢铵溶解于水中，常温溶解，形成水相； 称取一定量的聚乳酸、乳酸乙醇酸共聚物或者羟基丁酸-羟基戊酸共聚物溶于二氯甲烷中，加热并冷凝回流溶解，形成有机相II ; 将水相和有机相II进行匀浆混合处理，形成乳化液； 将步骤(I)中风干的玻璃棒插入(2)中乳化液中，适度搅拌后马上抽出并常温自然风干，再将样品进行冷冻干燥处理除去有机溶剂，既得到生物可降解高分子血管支架。
6.根据权利要求5所述一种生物可降解高分子血管支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述有机相I中高分子材料的浓度为10-20% (g/100ml)。
7.根据权利要求5所述一种生物可降解高分子血管支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述有机相II中高分子材料的浓度为5-40% (g/100ml)。
8.根据权利要求5所述一种生物可降解高分子血管支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述水相中致孔剂碳酸氢铵溶液浓度为5-20% (g/100ml)。
9.根据权利要求5所述一种生物可降解高分子血管支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述水相和有机相II混合的体积比为1:3 1:4.5。
全文摘要
本发明提供一种生物可降解高分子血管支架，其特征在于，所述血管支架分成内外两层独立的结构，其外层结构具有多孔的三维结构，微孔为不规则变化分布，孔径大小为20-400μm，可种植细胞，有良好的生物相容性，内层支架能承受具有强大的扩张力，挤压时候有助于支架形状的恢复。本发明还提供一种生物可降解高分子血管支架得制备方法。该方法制备的生物可降解高分子血管支架，生物相容性更好，且更易控制支架的孔径大小，其微孔为不规则变化分布，孔径大小为20-250μm。制备工艺较简单，制备的成本较低廉。
文档编号A61L27/18GK103169555SQ20111043515
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者魏岱旭, 钟建, 闫志强, 何丹农 申请人:上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司