专利名称：预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟的二联疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟的二联疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗领域。
背景技术：
猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome,简称PRRS)，是一种危害养猪业的病毒性传染病，该病以妊娠母猪流产、死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄段猪的呼吸道疾病和高死亡率为特征。2006年夏秋季，我国南方部分省份发生猪“高热病”疫情，农业部积极组织科研人员联合攻关，确定猪蓝耳病变异病毒为主要病原，定名为“高致病性猪蓝耳病”。直至今日，疫病形势依然严峻，同其他病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于蓝耳病的治疗，免疫接种是防制该病的最有效方法。·猪痕(ClassicalSwine fever,简称 CSF)又称为猪霍乱(Hog cholera)或欧洲型猪痕(European swine fever),是一种猪只急性或超急性发热的病毒传染性疾病，临床上的特征是散播迅速、发烧，解剖检验时可看到典型的出血病变。猪瘟可感染各种年龄的猪只，一年四季流行，发病率和死亡率均高，对猪只危害极大。本病是威胁养猪业最重要的传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为A类16种法定传染病之一，中国则定为一类烈性传染病。目前，仅有猪蓝耳病和猪瘟的单价疫苗，需要单独分别注射，不仅免疫工作量大，成本很高，而且多次免疫对猪机体造成更大的应激反应，需要间隔免疫。然而，一直以来尚未见到猪蓝耳病和猪瘟的二联疫苗制备成功，本发明二联疫苗能实现一针两防，减少免疫刺激，促使机体能够产生更好的免疫应答。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟的二联疫苗，以实现同时预防和治疗猪蓝耳病和猪瘟病。技术方案—种预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟的二联疫苗，包含以下成分猪蓝耳病抗原成分、猪瘟抗原成分及疫苗冻干保护剂。优选地，本发明所述猪蓝耳病抗原含量至少为IO5TCID5tl/头份，更优选地，本发明所述猪蓝耳病抗原含量为IO6TCID5tl/头份。优选地，本发明猪瘟抗原含量至少为7500个家兔感染量/头份，优选地，每头份应含有0.015ml细胞毒液。优选地,本发明所述猪痕抗原含量为9000个家兔感染量/头份,优选地,每头份应含有0. Olml细胞毒液。上述预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟二联疫苗的制备方法，包括以下步骤使用传代细胞培养猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒，以获得猪蓝耳病抗原和猪瘟抗原，按比例混合二种抗原成分，辅以冻干保护剂制备成冻干疫苗。优选地，本发明上述方法中，所述猪蓝耳病抗原含量至少为IO5TCID5tl/头份；优选地，本发明上述方法中，所述猪蓝耳病抗原含量至少为IO6TCID5tl/头份；优选地，本发明上述方法中，所述猪瘟抗原含量至少为7500个家兔感染量/头份。优选地，本发明上述方法中，所述猪瘟抗原含量为9000个家兔感染量/头份。优选地，本发明上述方法中，所述抗原混合体积比例为猪蓝耳病抗原猪瘟抗原体积比为I : 5 I : 10。即，通过按比例混合二种抗原成分，使二联疫苗中的猪蓝耳病抗原含量至少为IO5TCID5tl/头份，更优选地，猪蓝耳病抗原含量为IO6TCID5tl/头份；使得猪瘟抗原含量至少为7500个家兔感染量/头份，每头份应含有0. 015ml细胞毒液；最优选地，猪瘟 抗原含量为9000个家兔感染量/头份，每头份应含有0. Olml细胞毒液。本发明的另一目的在于提供一种如上所述的二联疫苗在预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟方面的用途。由上可见，本发明的二联疫苗中，通过使两种抗原达到合适配比，使得两种抗原互相没有干扰，疫苗效力至少达到或超出原有单苗的效力。其次，本发明的二联疫苗制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上两种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。
具体实施例方式本发明的二联疫苗中所述猪蓝耳病病毒为JXAl-R株，公开于中国专利CN101307305A，保藏号CGMCCNo. 2467，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。本发明的二联疫苗中所述的猪瘟病毒为猪瘟兔化弱毒株，购自中国兽医药品监察所，菌株保藏编号CVCC AV1412。本发明实施例二联疫苗中优选冻干前蓝耳病病毒含量为109TCID5(l/ml ;猪瘟病毒冻干前含量为90万个家兔感染量/ml。本发明实施例中可以通过调整冻干前蓝耳病病毒液与猪瘟病毒液比例至I : 5 I 10体积，可以获得使二联疫苗中的猪蓝耳病抗原含量至少为IO5TCID5tl/头份，更优选地，猪蓝耳病抗原含量为IO6TCID5tl/头份；使得猪瘟抗原含量至少为7500个家兔感染量/头份，每头份应含有0. 015ml细胞毒液；最优选地，猪瘟抗原含量为9000个家兔感染量/头份，每头份应含有0.01ml细胞毒液。其中，本发明实施例中优选调整冻干前蓝耳病病毒与猪瘟病毒比例为I : 5体积比，获得的二联疫苗每头份含蓝耳病病毒为IO6TCID5tl、猪瘟病毒为9000个家兔感染量。实施例I、猪蓝耳病与猪瘟二联活疫苗的制备I.生产用毒种的制备猪蓝耳病毒种的制备取生长良好的Marc-145细胞(购自中国兽医药品监察所)，用胰酶消化，并接种于细胞瓶内，同时将毒种用含1% v/v胎牛血清(PAA公司生产)的MEM (Invitrogen公司生产)维持液作10倍稀释，按5%体积接种量接种病毒，37°C培养，每日观察细胞病变(CPE)，当70%以上细胞出现CPE时收毒，冻融3次，收获病毒，病毒滴度为每Iml病毒含量为109_ 5TCID5qij猪瘟病毒种的制备用含1% v/v胎牛血清(PAA公司生产)的a -MEM(Invitrogen公司生产)细胞维持液，将毒种制成0. 3 % v/v的病毒悬液，接种生长良好的ST细胞(购自中国典型培养物保藏中心)单层，置37°C继续培养。每隔2日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种。细胞毒种每Iml含病毒90万个家兔感染量。2.病毒液的培养制备蓝耳病病毒液的制备取生长良好的单层覆盖率达80%以上的Marc-145细胞，弃去含5% v/v胎牛血清的MEM生长液，同时将毒种用含1% v/v胎牛血清的MEM维持液作10倍稀释，按5% v/v接种量接种病毒，37°C培养。在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变(CPE)，直至CPE达到80% -90%时收获细胞培养物，反复冻融3次，收获病毒，病毒滴度为每Iml病毒含量为IO9TCID5tlt5
猪瘟病毒液的制备取已形成良好单层的ST细胞，接种含3% v/v生产用细胞毒种的维持液(维持液为含I % v/v胎牛血清的a -MEM培养液)，置37°C继续培养。接毒后第3日作第一次收获换液，以后每隔2日收获换液一次,收获3次,收获的病毒液置于_20°C以下保存。病毒液每Iml含病毒90万个家兔感染量。3.病毒含量测定蓝耳病病毒液病毒含量测定将收获的病毒液用无血清的MEM培养基10倍系列稀释，取lo'io'io'io'io-'io—ne个稀释度，分别接种于96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔0. 1ml，在含5% CO2、37 °C下培养箱培养观察3-5日，根据Reed-Muench法计算TCID50 0 每 Iml 病毒含量为 IO9TCID500猪瘟病毒液病毒含量测定将收获的病毒液取Iml用无菌生理盐水倍比系列稀释，取6X IO5倍、7X IO5倍、8X IO5倍、9X IO5倍、IO6倍、I. I X IO6倍6个稀释度，耳静脉注射体重为I. 5-3kg家兔两只，每只1ml。家兔接种后，上下午个测体温I次，48小时后，每隔6小时测体温I次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。每Iml病毒含量为90万个家兔感染量。4.配苗、分装及冻干将检验合格的猪蓝耳病、猪瘟病病毒液，以I : 5的体积比例混合，混合于同一容器内，加入冻干保护剂，充分摇匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥后即得成品。连续生产三批疫苗1001、1002和1003，1001批每头份蓝耳病病毒含量为IO6 5TCID5tl、猪瘟病毒含量为9000个家兔感染量；1002批每头份蓝耳病病毒含量为IO6 2TCID5tl、猪瘟病毒含量为9000个家兔感染量；1003批每头份蓝耳病病毒含量为106_3TCID5tl、猪瘟病毒含量为9000个家兔感染量。5.疫苗的安全及效力检验安全性检验蓝耳病部分，将三批疫苗分别用生理盐水做适当稀释(10头份/ml)，用3-4周龄猪蓝耳病病毒抗原、抗体阴性仔猪15头。每批疫苗用5头，各肌肉注射稀释好的疫苗lml，逐日测量体温，观察21日，均没有出现由疫苗引起的任何局部和全身反应。同时，选用经中和试验方法检测无猪瘟抗体的健康易感断奶猪12头(注苗前观察5-7日，每日上下午各测体温I次。挑选体温、精神、食欲正常者使用)。每批冻干疫苗样品等量混合，按瓶签注明的头份用灭菌生理盐水稀释成每Iml含6头份疫苗，肌肉注射猪4头，每头5ml (含30个使用剂量)。注苗后，每日上、下午各观察并测体温I次，观察21日。体温、精神、食欲与注苗前相比没有明显变化，疫苗判为合格。效力检验蓝耳病部分，用4-6周龄猪蓝耳病病毒抗原、抗体阴性猪30头，每批疫苗10头，其中5头肌肉注射疫苗I头份，另5头作为对照，同等条件下隔离饲养。28日后，所有猪肌肉注射检验用强毒NVDC-JXAl株的病毒培养液(彡104 5TCID5(l/ml) 3ml，每日测温并观察21日。对照猪5头均发病，且3头死亡，免疫猪5头全保护。猪瘟部分，每批按瓶签注明头份用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释9000倍，耳静脉注射体重为I. 5-3kg家兔2只，每只lml。家兔接种后，上下午各测体温I次，48小时后，每隔6小时测体温I次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。①家兔接种疫苗后，体温反应标准如下定型热反应(++)潜伏期48 96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次超过常温1°C以上，并稽留18 36小时。如稽留42小时以上，必须攻毒，攻毒后无反应可判 为定型热。轻热反应(+)潜伏期48 96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过常温0. 50C以上，并稽留12 36小时。可疑反应(±)潜伏期48 96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应。体温反应呈二次高峰,有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔热反应可判为定型热或轻热反应。无反应(_)体温正常。②结果判定注苗后，当2只家兔均呈定型热反应(++)，或I只兔呈定型热反应(++)、另I只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。注苗后，当I只家兔呈定型热反应(++)或轻热反应(+)，另I只兔呈可疑反应(±);或2只兔均呈轻热反应(+)时，可在注苗后7 10日攻毒(接种新鲜脾淋毒或冻干毒)。攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为50 100倍乳剂。每兔耳静脉注射lml。攻毒后的体温反应标准如下热反应⑴潜伏期24 72小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1°C以上，稽留12 36小时。可疑反应(±)潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时或超过36小时而不下降。无反应(_)体温正常。攻毒后，当2只对照兔均呈定型热反应(++)，或I只兔呈定型热反应(++)，另I只兔呈轻热反应(+)，而2只注苗兔均无反应(_)，疫苗判合格。注苗后，如有I只兔呈定型热(++)或轻热反应(+)，另I只兔呈可疑反应(±)或无热反应(_)，可对可疑反应兔或无反应兔采用剖杀或采心血分离病毒的方法，判明是否隐性感染；或注苗后，2只兔均呈轻热反应，亦可对其中I只兔分离病毒。方法是接种疫苗后96 120小时之间，将兔剖杀，采取脾脏，用生理盐水制成50倍稀释乳剂(脾乳剂应无菌)，或采取心血(全血)，接种2只家兔，每只兔耳静脉注射lml。凡有I只兔潜伏期24 72小时出现定型热反应(++)，疫苗可判为合格。结果三批疫苗注射后，每批2只家兔均呈现定型热反应(++)，或I只兔呈定型热反应(++)、另I只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。6.免疫保护试验将三批疫苗分别用生理盐水按瓶签注明的头份稀释成每Iml含I头份疫苗，选用经中和试验方法检测无猪瘟抗体，且猪蓝耳病病毒抗原、抗体阴性的健康易感断奶猪60头，每批疫苗20头，其中10头肌肉注射疫苗I头份，另10头作为对照，同等条件下隔离饲养。14日后，其中5头注苗猪及5头对照猪，注射猪瘟石门系血毒Imiao5最小致死量，购自中国兽医药品监察所，保藏编号CVCC AV1411)，观察16日。对照猪全部发病，且至少有4头死亡，免疫猪全部健活。每批另外5头注苗猪在注苗后28日，连同剩余5头对照猪肌肉注射检验用强毒NVDC-JXAl株(公开于CN 101045917A，保藏号为CGMCCN0. 1964)的病毒培养液(彡104 5TCID5(l/ml)3ml，每日测温并观察21日。对照猪5头均发病，且至少4头死亡，免疫猪5头全保护。具体结果见表I。·表I 二联苗免疫保护试验
权利要求
1.一种预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟的二联疫苗，其特征在于，包含以下成分猪蓝耳病抗原成分、猪瘟抗原成分及疫苗冻干保护剂。
2.根据权利要求I所述的二联疫苗，其特征在于，所述猪蓝耳病抗原含量至少为IO5TCID50/ 头份。
3.根据权利要求I所述的二联疫苗，其特征在于，所述猪瘟抗原含量至少为7500个家兔感染量/头份。
4.根据权利要求I所述的二联疫苗，其特征在于，所述猪瘟抗原含量为9000个家兔感染量/头份。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述的二联疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤使用传代细胞培养猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒，以获得猪蓝耳病抗原和猪瘟抗原，按比例混合二种抗原成分，辅以冻干保护剂制备成冻干疫苗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述猪蓝耳病抗原含量至少为IO5TCID5tl/头份。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述猪瘟抗原含量至少为7500个家兔感染量/头份。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述猪瘟抗原含量为9000个家兔感染量/头份。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗原混合比例为猪蓝耳病抗原猪瘟抗原为1:5。
10.一种如权利要求1-4任意一项所述的二联疫苗在预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟方面的用途。
全文摘要
本发明提供了一种预防或治疗猪蓝耳病和猪瘟的二联疫苗，包含以下成分含量至少为105TCID50/头份猪蓝耳病抗原和至少为7500个家兔感染量/头份的猪瘟抗原含量。本发明的二联疫苗制备方法为使用传代细胞培养猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒，获得猪蓝耳病抗原和猪瘟抗原后，按比例混合二种抗原成分，辅以冻干保护剂制备成的冻干疫苗。本发明首次通过使两种抗原达到合适配比，实现了二联疫苗达到或超出原有单苗的效力。其次，本发明的二联疫苗制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上两种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。
文档编号A61K39/12GK102973933SQ20111044819
公开日2013年3月20日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者张许科, 孙进忠 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司