一种诱导多功能干细胞的抑制剂、其诱导方法和用途的制作方法

专利名称：一种诱导多功能干细胞的抑制剂、其诱导方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物工程领域。概括地说，本发明涉及一种miciORNA-421抑制齐U，该抑制剂在体外诱导多功能干细胞的用途，一种用上述抑制剂诱导多功能干细胞的制备方法，该方法所制成的干细胞、所述的干细胞在制备用于治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，以及所述的抑制剂在制备用于治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，同时还涉及上述的用于治疗心脏疾病的药物制剂或试剂盒。
背景技术：
一、心血管疾病概述心血管疾病是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年约有一千七百万人死于心血管疾病，其中有一半以上死于急性心肌梗死，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。
在我国，随着经济的迅速发展，人民生活水平和医疗保健水平明显提高，人均寿命已大大延长，然而心血管疾病却日益成为危害我国人民健康的严重问题，其中心肌梗死及心力衰竭、冠心病已成为中国三大主要疾病之一。心血管疾病的死亡率呈明显上升趋势，目前已超过癌症成为第一大致死因素，严重影响人民生活质量和身体健康，很大程度上降低了整个社会的经济效益。据预测，今后10年我国中年人群心血管发病率还将显著增加。为了保证人民健康和国民经济的可持续发展，开展心血管疾病的研究和防治工作刻不容缓。二、多功能性干细胞2006年8月，日本科学家Shinya Yamanaka等成功诱导出小鼠诱导多功能干细胞(induced Pluripotent Stem cell, iPS cell)后，短时间内iPS相关研究已经成为国际疾病研究的热点。目前，iPS的相关研究已经由体细胞诱导技术转向再生医学的研究。iPS技术的成熟后，其多功能性逐渐被应用于再生医学领域治疗人类损伤性或缺陷性疾病的研究中。一方面，利用产生的iPS细胞或组织器官对损伤或缺陷部位修复，将会大大降低一些器官移植等手术的费用，甚至将可能通过合成药物来有效治疗这些疾病；另一方面，将会很大程度上造福于人类和社会，间接促进社会经济的发展，提高社会效益。目前，iPS细胞诱导方法有逆转录病毒诱导法、慢病毒诱导法、小分子复合物诱导法、小分子蛋白复合物诱导法、PiggyBac转座子诱导法。但是，目前，这些诱导方法分别存在致癌、致瘤风险以及诱导过程复杂等缺点。iPS研究技术仍需进一步深入，以拓深其在再生医学领域的研究，并推广其应用。三、诱导多功能干细胞治疗心肌梗死的研究进展心肌梗塞是心血管疾病的常发病，心肌梗塞的患者呈逐年增加趋势，严重威胁着人类健康，目前其死亡率超过所有癌症死亡率的总和。由于成年个体的心肌细胞通常不能再生，心脏移植成为治疗重型心肌坏死的惟一有效途径。但是由于供体心脏的严重匮乏，致使成千上万的心肌梗死患者在等待中死亡。因此心脏相关疾病的研究与治疗是当代生物医学领域的研究热点之一。
心脏主要是由处于终末分化状态的心肌细胞组成的，心肌细胞不能分裂和增殖。这意味着心肌细胞的损伤和凋亡后不能够通过有效的心肌细胞分裂和增殖来弥补。许多心脏病都与心肌细胞数目减少相关，如心肌梗死、心力衰竭、原发性心肌病、心肌肥厚、蒽环霉素诱导的心肌中毒等。因此，要想维持心肌细胞数目的恒定，进而维持心脏在结构和功能上的完整性，最重要、最有效的途径之一就是通过向心脏中移植干细胞，定向诱导其分化为心肌细胞，来治疗心肌缺损。胚胎干细胞和成体干细胞、诱导多功能干细胞均能分化成多种器官和组织细胞，被称为“万能细胞”，均可用来诱导分化为心肌细胞来治疗心脏相关疾病。目前为止，胚胎干细胞和成体干细胞应用于心脏相关疾病治疗的研究已比较深入，临床上也有成功应用案例；但胚胎干细胞和成体干细胞应用上仍分 别存在伦理、道德问题和诱导分化率低、难于鉴定、纯化的问题。而2006年最新诱导成功的iPS细胞，不涉及胚胎干细胞研究伦理道德问题以及成体干细胞定向分化效率低的问题，在再生医疗领域具有更广阔的研究前景和潜在的临床应用价值。短短几年内iPS相关研究已经成为国际疾病研究的热点。培育人类iPS细胞系可为许多退行性或损伤性疾病患者提供“个性化”的自体干细胞，也为治疗带来新的希望，对于相关疾病的药物研发也有帮助。例如利用iPS细胞分化产生的心肌细胞或培育出新的心脏器官，通过细胞注射或器官移植来治疗一些心脏病，将给广大心血管疾病患者带来希望，造福于人类社会，间接促进社会经济的发展。iPS细胞来源的干细胞的优势如下1)因心脏病发作导致损伤后，iPS能够使心肌性能得到恢复。2)终止心脏结构的进一步损伤。3)在心脏损伤位置组织再生。iPS细胞的成功获得，为许多重大疾病的治疗和再生医学发展提供了一个诱人的前景。iPS细胞诱导技术可以用于心肌梗死等心脏中组织缺损疾病的治疗。2009年7月，研究人员利用普通的成纤维细胞重新诱导将其转化为干细胞，治疗心肌梗死造成的损伤，首次将诱导干细胞技术应用于心脏疾病治疗上。近期，以色列研究人员将皮肤细胞重新编码后诱导成多功能干细胞，培育出可以跳动的心肌细胞。此外，哈佛大学干细胞研究所研究人员试图通过两种方法来治疗心肌损伤相关疾病“其一是用一层心室肌肉细胞覆盖心脏破损区域，让它们逐渐生长成为能正常工作的心脏组织；其二是把细胞注射进破损区域，然后让它们自行生长。”同时，他们计划一年内在不同动物身上进行这类实验，并预计五年内应用于临床。但是，目前所使用的逆转录病毒、慢病毒等方法诱导产生的iPS细胞具有致癌风险。这一点极大地增加了 iPS的临床应用风险，并限制了 iPS在再生医学领域的应用，并可能产生严重的并发症状。

发明内容
如本文中所使用地，术语“iPS”与“诱导多功能干细胞”可互换地使用，二者具有相同的含义。如本文中所使用地，术语“miRNA”与“microRNA”可互换地使用，二者具有相同的含义。本发明的一个目的在于，提供一种microRNA-421抑制剂。
本发明的又一个目的在于，提供一种采用microRNA-421抑制剂制备多功能干细胞的方法。本发明的又一个目的在于，提供miciORNA-421抑制剂在制备用于治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。 本发明的目的还在于，提供用于治疗心脏疾病的新的药物制剂或试剂盒。本发明的目的还在于提供microRNA-421抑制剂在体外诱导多功能干细胞中的用途。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。在本发明的一个方面，本发明提供了一种microRNA-421抑制剂，所述mi croRNA-421抑制剂为包含mi croRNA-421反义核酸序列的核酸链或者其生物活性功能片段或变体，其核酸链碱基结构中的核糖是2’ -甲氧基修饰的，并且其中所述的·microRNA-421反义核酸序列是5’ -GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU-3，。在本发明的一个优选的方面，所述的核酸链的序列为5’ -GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU-3，。在本发明的另一个方面，本发明提供了一种制备多功能干细胞的方法，所述方法包括使用上述microRNA-421抑制剂诱导心肌成纤维细胞。在本发明一个优选的方面，所述microRNA-421抑制剂的浓度为120 200nM，优选地为160nM。在本发明一个优选的方面，所述microRNA-421抑制剂同时调控0CT4、KLF4、S0X2和C-MYC四种转录因子。在本发明的另一方面，本发明提供了由上述方法制备的多功能干细胞。在本发明的另一方面，本发明还提供了上述多功能干细胞在制备用于治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。优选地，所述心脏疾病是有心肌细胞坏死或心脏组织缺损症状的心脏疾病，优选地，所述的心脏疾病选自心肌梗死和心力衰竭疾病。在本发明的另一个方面，本发明还提供了上述的microRNA-421抑制剂在制备用于治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途。优选地，所述心脏疾病是有心肌细胞坏死或心脏组织缺损症状的心脏疾病；进一步优选地，所述的心脏疾病选自心肌梗死和心力衰竭疾病。在本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于治疗心脏疾病的药物制剂或试剂盒，其中包含治疗有效量的上述多功能干细胞；优选地，所述的药物制剂或试剂盒中，多功能干细胞的含量为I X IO6 I X IO8个，优选地为I X IO6个。此外，本发明提供了上述microRNA-421抑制剂在体外诱导多功能干细胞中的用途。本发明通过实验证实将microRNA-421抑制剂在注射至心肌梗死部位,研究结果发现细胞梗死面积明显减少，部分心肌功能得以恢复。microRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，其参与转录后基因表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有4361个miRNA分子(Release 910，0ctober2006)。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中(Lagos-Quintana et al, 2001 ；Lau et al, 2001)。本发明从一个全新的角度出发，利用Target scan、RNA22、RNA hybrids RNA base等软件与数据库，分析出同时调控于小鼠诱导多功能干细胞四种全能性因子0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC的microRNA(见图2B中的荧光素酶检测的结果)即当加入microRNA-421抑制剂时，四种因子在细胞中的表达量上升，导致细胞发生重编程过程。心脏中细胞分为心肌细胞和非心肌细胞。而心肌成纤维细胞在非心肌细胞中占大部分。因此，我们利用microRNA-421抑制剂将心肌成纤维细胞诱导成多功能干细胞，以此实现治疗心肌梗死和心力衰竭疾病的目的。本实验是通过将心肌成纤维细胞体外诱导成诱导性多功能干细胞，直接注射至心脏梗死的部位。诱导多功能性干细胞是将体细胞诱导成多功能干细胞,理论上,通过添加microRNA-抑制剂后会使体细胞中四种全能性因子0CT4、S0X2、KLF4、C-MYC的表达量提高，出现重编程的过程。首先，本发明先利用miciORNA-421抑制剂将成年小鼠心肌成纤维细胞诱导成多功能干细胞，避免了 iPS细胞移植至体内致癌、致瘤的风险。
其次，本发明将miciORNA-421抑制剂注射至小鼠心肌梗死的部位，发现小鼠心肌梗死面积减少。取6周大成年小鼠,制备心梗模型。注射microRNA-421抑制剂,每天注射一次，每次注射量为64mg/kg (按照小鼠重量注射)。注射三天后，首先，进行超声心动检测，测定小鼠心脏功能恢复程度。其次，取心脏，制备组织切片，计算小鼠心肌梗死面积变化。以上两方面是本发明的重大创新之处，本发明提供的诱导多功能干细胞对心肌梗死的治疗效果明显提高。此外，本发明的microRNA-421抑制剂具有良好稳定性及穿透细胞膜的特性，利用microRNA-421抑制剂治疗心肌梗死疾病也具有明显的疗效，在临床疾病治疗上具有潜在的应用价值。具体而言，本发明还包括以下几方面的内容I.利用miciORNA-421抑制剂将心肌成纤维细胞诱导成iPS细胞将分离得到成年小鼠的心肌成纤维细胞传代至24孔板中，每孔加入120-200nM，优选地160nM的microRNA-421抑制剂，诱导iPS细胞。实验步骤参考四种因子诱导iPS细胞的步骤(Kazutoshi Takahashi 等人，2007, Nature protocols, 2 (12) :3081-3089)。通过对照实验发现，miciORNA-421抑制剂诱导的iPS细胞克隆数比四种因子的逆转录病毒诱导得到的iPS细胞克隆数明显提高。2. microRNA-421抑制剂同时调控四种全能性因子0CT4、S0X2、KLF4、C_MYC来治疗心肌梗死本发明具有以下的意义I)在临床上具有巨大的应用价值，可以通过将microRNA-421抑制剂制备成药物来治疗心肌梗死和心力衰竭等疾病。2)使用microRNA-421抑制剂诱导产生多功能干细胞，不但避免了 iPS细胞的致癌、致瘤风险，同时使得诱导效率也明显提高。四种因子病毒诱导得到的iPS细胞中，由于将四种外源的病毒介导入细胞，使四种因子在整合在宿主的基因组中，稳定长时间表达，达到重编程的目的。3)本实验中，microRNA-421抑制剂是通过调控体内的四种因子的表达量增高，避免了病毒对细胞的致癌、致瘤风险。4)本发明所使用的microRNA-421抑制剂具有良好的结构稳定性及穿过细胞膜的能力，因此适用于注射等方式给药。与一般的干细胞诱导剂相比，其可以在较低的给予量下，有效地达到干细胞诱导的效果。


以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图I为利用microRNA-421抑制剂将心肌成纤维细胞的细胞诱导成为iPS细胞的图片。图IA为对照组，未加入microRNA-421抑制剂。图IB为加入microRNA-421抑制剂诱导后的细胞用碱性磷酸酶染色结果(显蓝色)。
图2A为利用microRNA-421抑制剂诱导的iPS细胞克隆数与四种病毒因子诱导的iPS细胞克隆数的比较(6孔培养板)，其中I表示利用microRNA-421抑制剂诱导iPS细胞的试验组，2表示利用四种病毒因子诱导iPS细胞的试验组。图2B为荧光素酶检测实验检测microRNA-421调控四种因子的3’ -UTR区，图中I为空白对照组，加入了 microRNA-421表达载体、pRL-tk内参质粒(购买自PiOmega公司，货号E2241)，萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值很低；图2为阴性对照组，加入了 microRNA-421表达载体、pRL-tk内参质粒和PGL3空载体后，萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值(未加入四种因子)；图中3表示加入了 pRL-tk内参质粒、mi croRNA-421表达载体和pGL3_0CT4载体的实验组；图中4表示加入了 pRL-tk内参质粒、mi croRNA-421表达载体和pGL3_KLF4载体的实验组；图中5表示加入了 pRL-tk内参质粒、mi croRNA-421表达载体和pGL3_S0X2载体的实验组；图中6表示加入了 pRL-tk内参质粒、microRNA-421表达载体和pGL3_C_MYC载体的实验组。图3是反映了 mi-iPS细胞(microRNA诱导的iPS细胞)治疗心肌梗死的能力的图，其中图中给出了 mi-iPS细胞治疗小鼠心肌梗死疾病的FS(% )值。其中，“I/R”为缺血后再灌注，制备小鼠心肌梗死模型的方法。实验设有两个组，注射NC(阴性对照组，即Negative control)和注射mi_iPS细胞组，“Pre-1/R”组为制备缺血再灌模型前,两组小鼠左心室短轴缩短率值，属于正常范围；“Post-I/R”表示，制备小鼠缺血再灌模型后，注射NC (阴性对照组)和注射mi-iPS细胞后，两组小鼠的左心室短轴缩短率值，结果显示，注射mi-iPS细胞实验组的小鼠左室短轴缩短率明显高于阴性对照组(NC组)，说明注射mi-iPS细胞可显著修复由心肌梗死导致的小鼠心肌损伤，提高小鼠心脏功能。图4是反映了 microRNA-421抑制剂治疗小鼠心肌梗死能力的图。其中图4a显示小鼠心脏左室舒张末期内径(LVIDd)，心梗建模后，注射抑制剂的实验组比对照未注射抑制剂的对照组的LVIDd值小，说明心肌梗死一定程度上被microRNA抑制剂修复；图4b显示了心梗建模后，注射抑制剂的实验组比对照未注射抑制剂的对照组的小鼠左室收缩末期内径值变小，显示小鼠心脏功能得以修复；图4c显示心梗建模后，加入抑制剂实验组比对照组的心脏左室短轴缩短率FS%升高，心脏功能较对照组有明显改善。其中，“I/R”为缺血后再灌注，制备小鼠心肌梗死模型的方法。实验设有两个组，注射NC(阴性对照组)和miR-421抑制剂组，“Pre_I/R”组为制备缺血再灌模型前，两实验组正常小鼠左心室短轴缩短率值；“Post-I/R”表示，制备小鼠缺血再灌模型后，分别注射NC和miR-421抑制剂对小鼠心肌梗死修复后的左心室短轴缩短率值。图中结果显示，加入miR-421抑制剂的实验组小鼠左室短轴缩短率明显高于阴性对照组(NC组中小鼠的心肌明显损伤，FS%< 25% )，说明miR-421抑制剂可以明显修复由心肌梗死导致的小鼠心肌损伤，提闻左室心肌收缩功能。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。主要试剂与材料胎牛血清(FCS) ,DMEM培养基购于GIBCO公司；胰蛋白酶、EDTA、明胶、硫酸鱼精蛋白(Protamine sulfate)购于Sigma公司；小鼠白血病抑制因子(Mouse Lif因子)购于Millipore 公司;TUNEL 及细胞凋亡检测(Cell Death Detection) ;microRNA 抑制剂由上海吉玛生物技术有限公司合成并修饰。pRL-tk内参质粒购自Promega公司，腺病毒表达载体(pAdeasy-lTM)购于 Stratagene 公司。0CT4、KLF4、S0X2、C-MYC 四种因子的病毒载体购自Addgene生物公司。Fugene HD transfect reagent购自Roche生物公司。DAPI染色 液购买自碧云天生物技术研究所，货号C1006。碱性磷酸酶染液购自Millipore公司，货号SCR066。突光素酶检测试剂盒(Dual-luciferase reporter assay system 试剂盒)购买自Promega公司，货号为TM040。pRL-tk内参质粒购买自Promega公司，货号E2241。采用的实验动物均为成年C57/BL小鼠，得自北京维通利华实验动物技术有限公司。其余试剂均为可任意商购的分析纯。实施例I microRNA-421抑制剂诱导产生iPS细胞本实施例从小鼠心脏组织中，分离心肌成纤维细胞，采用microRNA-421抑制剂来诱导该心肌成纤维细胞产生iPS细胞。具体实验操作步骤如下取成年小鼠，在无菌条件下开胸剪取心脏3颗，将心脏用pH 7. 4的PBS漂洗三次，然后，置于冰上，加入ImL的O. 08%胰酶和I %胶原酶的DMEM消化液，50mL的DMEM消化液包含2mL的O. 08%胰酶和2mL的1%胶原酶II (胰酶和胶原酶II分别订购自北京欣经科生物技术公司及sigma公司)先用剪刀和刀片将组织切碎成l_2mm的小块。然后加入5mL消化液(50mL的DMEM消化液包含2mL的O. 08%胰酶和2mL的I %胶原酶II)消化，37°C下，在摇床中恒温消化4-6分钟(摇床转速为60r/min),然后用枪头勻速反复轻微吹打两次,室温静置2min，将上清移至新的50mL离心管中(预先加入2mL的FBS)，再按相同的方法将剩余的组织块消化完，收集并合并所有的上清，800rpm/min离心10分钟，弃上清，用20% FBS的DMEM培养液洗涤一次，离心后，去上清，用适量8-10mL含20 % FBS的DMEM培养液重新悬浮细胞，200目的细胞筛筛选后，混匀铺至IOcm培养皿上，置于含37°C培养箱中在5% CO2下培养。2小时后，换液此时，成纤维细胞由于贴壁较快，心肌细胞贴壁慢，换液后，培养皿中主要是心肌成纤维细胞，然后过夜培养，至3-4天细胞长满后，用于做诱导实验。准备好6孔板，铺O. 1%的明胶(称取O. Ig的明胶，溶解于IOOmL的水中，0.25 μ m的细胞滤膜过滤后使用)于6孔细胞培养板上，置于超净台中吹干，再将心肌成纤维细胞细胞传代至6孔板中，使用20 %的DMEM培养基，置于5 % CO2的37°C培养箱中培养36h，每孔加入 160nM 的 microRNA-421 抑制剂(序列为 5’-GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU_3’，碱基的核糖是2’-甲氧基化修饰的，委托上海吉玛制药技术有限公司合成)。诱导iPS细胞的产生，具体实验步骤参见 Kazutoshi Takahashi 等人，2007, Nature protocols, 2 (12) :3081-3089 诱导多功能性干细胞即mi-iPS细胞产生，该组为实验组(实验结果见图1B)，对照组中为加入 microRNA-421 抑制剂的阴性对照(negative control)(见图 1A)。图2A为利用microRNA-421抑制剂诱导的iPS细胞克隆数与四种病毒因子诱导的iPS细胞克隆数的比较；图中I为四种因子诱导的iPSC克隆数四种因子诱导iPSC是通过加入0CT4、KLF4、S0X2、C-MYC四种因子的病毒(病毒为载体包装所得，步骤如下。载体购自Addgene生物公司)诱导得到 。四种因子的病毒是在293T细胞长至90%时，用FugeneHD transfect reagent (购自Roche生物公司)将四种因子的载体和病毒包装载体分别共转染，48h后，收集病毒上清，获得四种因子的病毒(Kazutoshi Takahashi等人.2007)。图中2为microRNA-421抑制剂诱导的iPSC克隆形成。诱导试验与图IA中实验条件相同，通过两组试验中形成的iPSC克隆数目的统计，发现加入microRNA-421抑制剂的实验组中iPSC克隆数目明显提高(见图2A)。图2B为荧光素酶检测实验检测microRNA-421对四种因子的3’ -UTR区的调控(实验步骤参考 Promega 公司 Dual-luciferase reporter assay system 试剂盒，货号为TM040)。图2B其中横坐标I为对照组，加入了 microRNA-421表达载体、pRL_tk内参质粒，萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值很低；2为阴性对照组，加入了 miciORNA-421表达载体、pRL-tk内参质粒和pGL3空载体后所测得的，萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值(未加入四种因子)；图28中3表示加入了 pRL-tk内参质粒、microRNA-421表达载体和pGL3-0CT4载体的实验组；图中4表示加入了 pRL_tk内参质粒、mi croRNA-421表达载体和pGL3-KLF4载体的实验组；图中5表示加入了 pRL_tk内参质粒、mi croRNA-421表达载体和pGL3_S0X2载体的实验组；图中6表示加入了 pRL_tk内参质粒、microRNA-421表达载体和PGL3-C-MYC载体的实验组。图2B中3_6的萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值明显降低，miRNA-421通过抑制0CT4、KLF4、S0X2、C-MYC基因的3’ -UTR区而抑制四种基因的表达。实验证实miRNA-421同时调控0CT4、KLF4、S0X2、C-MYC四种全能性因子。实施例2小鼠心肌梗死模型的制备和鉴定本实施例制备并鉴定了小鼠心肌梗死模型。I)采用阻塞左冠状动脉法诱导小鼠发生心肌梗死，由此建立小鼠心肌梗死模型。小鼠麻醉后背位固定于实验用木板上。心电图监测。颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方处进针，进针深度O. 5mm ；以6/0缝线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)。以I、aVL导联ST段弓背向上抬高大于O. ImV并持续O. 5h以上作为结扎成功的标志。清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。一定时间后(本实验采用术后缺血45min再灌注)再灌注，来制备小鼠心肌梗死模型(小鼠缺血再灌模型简称I/R模型)。2)小鼠心肌梗死模型鉴定检测心脏功能的方法(I)测定心肌梗死面积切取心脏标本，将左室沿心脏纵轴均匀切成薄片(7μπι)，置于NBT液(氯化硝基四氮唑蓝0. 06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存)中37°C水浴15分钟。坏死区因无脱氢酶不染色，未坏死区因含有脱氢酶而染成蓝色。在解剖显微镜下小心将染色区与未染色区分离并分别用电子天平称重，梗死面积大小用梗死区重量与左室重量百分比表/Jn ο(2)测定心肌细胞凋亡情况运用TUNEL、细胞凋亡ELISA检测试剂盒(Cell Death Detection ELISA)检测心肌细胞凋亡。TUNEL法检测心肌细胞凋亡用蛋白酶K消化(消化样品为取自心肌梗死模型小鼠心脏的组织切片，用来观察心肌细胞凋亡情况。蛋白酶K的使用浓度20 μ g/mL,使用IOmMTris-HCl溶解，pH为7. 4-8. 0，购买自Hoffmann-La Roche有限责任公司。组织切片脱蜡后，使用蛋白酶K消化，样品置于21°C -37°C处理15min-30min即可)以暴露DNA，在末端转移酶(末端转移酶Terminal transferase, TdT (购买自碧云天生物技术研究所)，是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物)的介导下进行，其中用荧光素标记的dUTP掺入到凋亡细胞的双链或单链DNA的3’ OH末端(使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，·按照试剂盒厂商提供的产品说明来进行，所述的试剂盒用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-0H末端，并与连接辣根过氧化酶的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺反应产生很强的颜色反应，呈深棕色，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3’-0H形成，很少能够被染色。)，在荧光显微镜下观察标记了荧光素-dUTP的细胞(试验中使用的是激光共聚焦显微镜，拍摄照片的激发波长是790nm，放大100倍)。凋亡细胞核为绿色荧光，正常细胞核为蓝色荧光。计算各组细胞凋亡指数(Al)，Al =凋亡细胞数/总细胞数(每个高倍镜视野)，每张玻片取5个高倍镜视野，取其平均值。制备组织切片，然后进行TUNEL染色，使用激光共聚焦显微镜，观察并拍摄细胞凋亡状况，进行统计，根据Al =凋亡细胞数/总细胞数来计算细胞凋亡指数。(3)测定心脏功能有两种检测心脏功能的方法I.超声心动图参数的测定M-型超声心动图检查心底波群及心室波群测定左心房内径(LA)、左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、室间隔厚度(IVSd)。计算出每搏输出量(SV)、每分输出量(CO)、心脏左室射血分数(EF)及短轴缩短率(FS%，左室短轴缩短率(FS% )是左心室收缩功能指标参数)。心脏左室短轴缩短率FS%大小与心脏的左室收缩功能成正比，可以直接指示心脏的功能强弱。 FS%= [ (LVIDd-LVIDs) /LVIDd] X 1002.在心尖四腔切面上，分别将取样容积置于二尖瓣口、左室流出道口，测量二尖瓣口舒张早期血流流速E峰、舒张晚期血流流速A峰并计算出E峰/A峰比值。检测的样品是注射了 I X IO6个mi-iPS细胞/64mg/kg microRNA-421抑制剂的心肌梗死模型小鼠，用超声心动仪测量E峰与A峰。结合心电图测量左室等容舒张时间(IVRT)、左室等容收缩时间(IVCT)、左室射血时间(ET)。计算Tei指数=IVRT+IVCT/ET。计量资料连续测量3个心动周期，取平均值。Tei指数又称为心肌做功指数(Myocardial performance index,MPI),能综合反映心室收缩机舒张功能，主要用于研究扩张型心肌病左室功能的研究。
本文主要通过左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)计算出左室短轴缩短率FS%来检测给药前后小鼠心肌梗死的修复程度及心脏的功能情况。实施例3使用mi-iPS细胞治疗小鼠心肌梗死疾病，观察小鼠心肌梗死面积变化及心脏功能修复程度。选取六周大的C57小鼠，具体按照实施例2步骤(I)，制备心肌梗死模型小鼠。以五只小鼠作为对照组，以及用五只小鼠作为实验组，在模型小鼠制备24小时候，在实验组的小鼠中的心肌梗死处注射I X IO6个mi-iPS细胞。I周后及I个月后，分别小鼠心肌梗死的面积变化及使用超生心动仪检测小鼠心肌功能修复程度。一个月后小鼠心脏功能的变化(FS%{t)见图 3。图3中提供的数据是一个月后的观察结果。实施例4使用microRNA-421抑制剂来治疗心肌梗死。观察小鼠心肌梗死面积变化及心脏功能修复程度。 准备对照组和实验组六周大的C57小鼠各5只，使用超声心动仪检测对照组和实验组小鼠心脏左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、射血分数(LVEF)。将实验组小鼠制备缺血再灌心梗模型(见实施例2步骤)，24h后，将microRNA-421抑制剂(64mg/kg)注射至心脏梗死处。每天注射一次，注射三天，三周后制备切片观察小鼠心肌梗死的面积变化及使用超生心动仪检测小鼠心肌功能修复程度。通过超声心动实验检测对照组和实验组小鼠心脏左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs)、射血分数(LVEF)及短轴缩短率(FS%)，观察microRNA-421抑制剂对小鼠心肌梗死疾病的修复程度，见图4。以上所有数据均为平均值土SEM，4次独立实验。本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种microRNA-421抑制剂，所述microRNA-421抑制剂为包含microRNA-421反义核酸序列的核酸链或者其生物活性功能片段或变体，其结构中的核糖是2’ -甲氧基修饰的，并且其中所述的microRNA-421反义核酸序列是5， -GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU-3，。
2.如权利要求I所述的miciORNA-421抑制剂，其中所述的核酸链的序列为5， -GCGCCCAAUUAAUGUCUGUUGAU-3，。
3.一种制备多功能干细胞的方法，所述方法包括使用权利要求1-2任一项所述的microRNA-421抑制剂将心肌成纤维细胞诱导成多功能干细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中所加入的microRNA-421抑制剂的浓度为120 200nM，优选地为160nM。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述microRNA-421抑制剂同时调控 0CT4、KLF4、SOX2和C-MYC四种转录因子。
6.按照权利要求3-5任一所述的方法得到的多功能干细胞。
7.权利要求6所述的多功能干细胞在制备用于治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途；优选地所述心脏疾病是有心肌细胞坏死或心脏组织缺损症状的心脏疾病；进一步优选地，所述的心脏疾病选自心肌梗死和心力衰竭疾病。
8.权利要求I或2所述的miciORNA-421抑制剂在制备用于治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途；优选地，其中所述心脏疾病是有心肌细胞坏死或心脏组织缺损症状的心脏疾病；进一步优选地，所述的心脏疾病选自心肌梗死和心力衰竭疾病。
9.一种用于治疗心脏疾病的药物制剂或试剂盒，其特征在于所述药物制剂或者试剂盒包含治疗有效量的权利要求4所述的多功能干细胞；优选地，所述药物制剂或试剂盒中多功能干细胞的含量为I X IO6 I X IO8个，优选地为I X IO6个。
10.权利要求I或2所述的microRNA-421抑制剂在体外诱导多功能干细胞中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种采用microRNA-421抑制剂，利用其制备多功能干细胞的方法，其所制备的多功能干细胞，该抑制剂和干细胞在制备治疗心脏疾病的药物中的应用，以及所述抑制剂在体外诱导干细胞中的用途。本发明避免了以往利用病毒诱导iPS细胞所导致的致癌、致瘤风险；首先，使用microRNA抑制剂诱导出mi-iPS细胞，并用其治疗小鼠心肌梗死疾病，使梗死后的小鼠心脏功能得以修复，避免了以往病毒诱导的iPS细胞治疗所导致的致癌、致瘤风险。其次，本发明首次使用microRNA抑制剂来治疗小鼠心肌梗死疾病，取得了较显著的治疗效果，将microRNA抑制剂开发成药物来治疗小鼠心肌梗死疾病将在临床具有潜在的应用价值，这也是本发明的重大创新之处。
文档编号A61K35/12GK102888401SQ20111045931
公开日2013年1月23日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者李培峰, 李娜, 龙波, 王昆 申请人:中国科学院动物研究所