多糖颗粒疫苗的制作方法

专利名称：多糖颗粒疫苗的制作方法
多糖颗粒疫苗
背景技术：
缀合疫苗通常通过将抗原与载体蛋白共价连接来产生。所产生的免疫原然后经常施用于细菌多糖用于预防细菌疾病。使用缀合疫苗的一个缺点是抗原与蛋白化学缀合有困难。因此，不需要蛋白与碳水化合物直接缀合的实质缀合疫苗将是高度合意的，其中抗原和蛋白以与目标细胞紧密缔合的方式存在。通过PRINT 技术(Liquidia Technologies, North Carolina)制造的微粒和纳米粒提供控制其化学组成、粒径、颗粒形状、表面官能度以及其他物理和化学特性的微粒和纳米粒。在本发明中使用该技术使得抗原与载体蛋白能够共包装以刺激免疫反应。PRINT 颗粒之前已被描述于，例如 US 2009-0028910,WO 2008/11886UW0 2009/111588,US2009-0165320、US 2007-0275193、US 2007-0264481、US 2008-0131692、WO 2008/127455、US 2008-0181958、US 2009-0098380 和 WO 2009/132206 ;每一篇通过引用以其整体结合到本文中。本文进一步描述PRINT 颗粒。 发明概沭
本发明的目的之一在于制备可与多种多糖(PS) —起利用的单颗粒组合物。备选地，如果单颗粒组合物不或不能容纳选择的PS，那么另一目的是对给定适应证或靶标开发一批可容纳目标PS的颗粒组合物。本发明一个方面是一种包含含有实质上均匀组合物的模塑颗粒的免疫原性组合物，其中所述实质上均匀组合物包含免疫原性量的与多糖缔合的载体蛋白。本发明一个特定方面是一种包含含有非交联组合物的模塑颗粒的免疫原性组合物，所述非交联组合物包含约10-20 丨％的聚合物、约60-70 wt%的蛋白和约10-25 wt%的多糖。本发明另一个方面是一种优化多糖疫苗性能的方法，所述方法是通过使模塑的二维阵列颗粒的免疫原性多糖或免疫原性蛋白组分的类型或化学计量学变化和测试所述颗粒的性能。本发明另一个方面是一种用于制造多糖疫苗的系统，其包括选择与蛋白和多糖相容的基质组合物和通过在聚合物模具中模塑组合物从所述组合物形成颗粒，其中所述组合物包含约90-99. 9 wt%的蛋白和约10-0. I wt%的多糖。在一个特定实施方案中，多糖是肺炎球菌多糖。在一个特定实施方案中，载体蛋白和/或多糖呈基质的形式。在一个特定实施方案中，颗粒是非交联的或交联的。在一个特定实施方案中，免疫原性组合物另外包含选自以下的基质实质上非免疫原性蛋白、糖、聚合物和疏水物。在一个特定实施方案中，免疫原性组合物另外包含聚合物，其中所述聚合物物理上迫使载体蛋白与多糖缔合。在一个特定实施方案中，多糖或载体蛋白被吸附在颗粒表面上。在一个特定实施方案中，载体蛋白占90 wt%-99. 9 wt%,和多糖占10 wt%_0. Iwt%。在一个特定实施方案中，载体蛋白包含90 wt%-99. 9 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA，和多糖包含10 wt%-0. I wt%的肺炎球菌多糖14。在一个特定实施方案中，聚合物包含约16 wt%的PLGA。在一个特定实施方案中，蛋白包含约66 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA。
在一个特定实施方案中，多糖包含约18 wt%的肺炎球菌多糖14。在一个特定实施方案中，基质组合物包含不降低蛋白或多糖免疫原性的组分和处理。发明详沭
如本文所述，已制造和/或预期多种颗粒组合物以形成实质缀合PS疫苗颗粒。制造的颗粒通常包含由载体蛋白与目标PS的组合组成的颗粒，其中用交联剂处理该组合。在一个例示性实施方案中，在自收获阵列收获颗粒之前发生交联剂处理。在另一个例示性实施方案中，在自阵列收获颗粒之后发生交联剂处理。在另一个例示性实施方案中，将添加剂加入颗粒基质中，而不是共价交联颗粒，该添加剂提供足以将载体蛋白与PS的缔合保持所需时间的结合力(例如但不限于电荷-电荷相互作用、吸附、疏水相互作用、相分离、聚合物等)。在另一个例示性实施方案中，用包被步骤处理蛋白和PS的颗粒以包装蛋白和PS。在又一个例示性实施方案中，颗粒由非抗原或免疫原性(本文亦称为无活性)多糖或蛋白物质(例如聚合物)组成，且表面吸附有蛋白和目标PS。可在必要时任选向颗粒基质中引入添加剂，以维持蛋白、PS或完整蛋白/PS颗粒，添加剂例如但不限于脂质、氨基酸、疏水物、聚合物、小分子、脂肪酸、表面活性剂等。用于本发明的颗粒的其他多糖和/或蛋白混合物技术和复合物可发现于“Formation andcharacterization of amphiphilic conjugates of whey protein isolate (WPI)/xanthan to improve surface activity (形成和表征乳清蛋白分离物(WPI)/黄原胶的两亲性缀合物以改善表面活性)，”A. Benichou等，Food Hydrocolloids 21 (2007)379 - 391，其通过引用以其整体结合到本文中。颗粒制造 PRINT 颗粒
在例示性实施方案中，可在PRINT 颗粒中包含合成的生物相容性聚合物。根据这样的实施方案，一些实例包括但不限于包含一个或多个可交联的半胱氨酸残基的合成多肽、包含一个或多个二硫基的合成多肽、直链或支链聚亚烷基二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙交酯/乙交酯、其组合等。根据另外的例示性实施方案，可与本发明的颗粒组合使用的合成聚合物包括但不限于包含半胱氨酸残基的合成多氨基酸、包含二硫基的合成多氨基酸、修饰以包含游离巯基的聚乙烯醇、修饰以包含游离二硫基的聚乙烯醇、修饰以包含游离巯基的聚甲基丙烯酸羟乙酯、修饰以包含游离二硫基的聚甲基丙烯酸羟乙酯、修饰以包含游离巯基的聚丙烯酸、修饰以包含游离二硫基的聚丙烯酸、修饰以包含游离巯基的聚乙基噁唑啉、修饰以包含游离二硫基的聚乙基噁唑啉、修饰以包含游离巯基的聚丙烯酰胺、修饰以包含游离二硫基的聚丙烯酰胺、修饰以包含游离巯基的聚乙烯吡咯烷酮、修饰以包含游离二硫基的聚乙烯吡咯烷酮、修饰以包含游离巯基的聚亚烷基二醇、修饰以包含游离二硫基的聚亚烷基二醇、其组合等。生物相容性材料/聚合物可为生物可降解的。在一个例示性实施方案中，本发明的免疫细胞靶向的微粒和/或纳米粒的预定几何学包括实质上球形的、实质上非球形的、实质上病毒状的、实质上细菌状的、实质上蛋白状的、实质上细胞状的、实质上棒状的、实质上手性状的、实质上直角三角形、实质上平碟状的等。在一个例示性实施方案中，颗粒具有小于约100微米的最宽尺寸，例如约I nm-约50微米，例如约50 nm-约10微米、例如约100 nm-约I微米、例如约100 nm-约500 nm。在其他实施方案中，颗粒可具有预定的几何学特性。根据一些例示性实施方案，几何学特性包括具有两个实质上平直和实质上平行的边的形状、预定的曲率半径、两边之间的预定角度、具有预定宽度的实质上的平面、两个实质上的平面、实质上平行的两个实质上的平面、实质上平行且配置为离开受控间距的两个实质上的平面、其中两个实质上的平面以预定角度邻接的两个实质上的平面等。在更另外的例示性实施方案中，颗粒被配置为球形、球体样或球形化的形状。根据这样的实施方案，当在模腔中时、从模腔收获后并在收获阵列上时、或者从模腔收获后并在收集或溶液中时，颗粒在给定温度或之上可自发球形化(包含生物或敏 感组成的组合物的相对低的熔点)。在一些实施方案中，颗粒的形状没有控制颗粒化学组成、PS比、载体蛋白比或第三方基质组成比关键。PRINT 技术通常使用由材料(例如硅酮、基于全氟聚醚的弹性体(PFPE)或其他基于烃的材料)制备的低表面能模具，以在主模板上复制微米级或纳米级结构。PRINT 模具中使用的聚合物在室温通常为液体，并通常光化学交联为能够高分辨复制微米级或纳米级结构的弹性体固体。然后当与主模板接触时，液体聚合物被“固化”，藉此在主模板上形成该结构的复制映像。通过固化(热或光化学)或通过玻璃化和或结晶冷却，可发生与主模板接触的模具的固化。当自主模板移除聚合物模具，聚合物形成包含主模板的微米级或纳米级特征的腔或凹陷复制的有图案模板，固化液体聚合物中的微米级或纳米级腔可用于高分辨微粒或纳米粒制造。PRINT 技术能够制造同时控制结构(例如，形状、尺寸和组成)和功能(例如，表面结构)的单分散有机和无机纳米粒。PRINT 技术是能够形成以下颗粒的第一种常规独特方法i)尺寸单分散且形状均匀；ii)可被模塑为任何形状；iii)可基本上由任何基质材料组成；iv)可在极其温和的条件下形成(与易碎载物相容)；v)顺应功能化后化学(例如，生物缀合活性物质和/或靶向组分)；和“)其最早在可访问的2-D阵列中制造颗粒(其开创组合方法，因为颗粒可被“条形码化”)。在形成顺应本文所列的PRINT 方法的预聚物混合物中，当设计PRINT 纳米粒载体系统时，待考虑的技术方面包括1)颗粒载物或基质材料与聚合物PRINT 模具材料的相容性，2)载物释放所需的颗粒降解概况，3)靶向方法，4)颗粒模量和5)第1-4点的组合。可通过经由合理选择单体来调节预聚物基质的亲水性以匹配载物的亲水性，解决载物/预聚物基质相容性。本文讨论颗粒降解和靶向。可通过改变颗粒内的交联程度和/或引起其物理缠结的颗粒成分，调节颗粒的模量和稳健性(robustness)。最后,视需要,可通过加入共单体或共溶剂以改变单体溶液的物理性质，优化用于PRINT 制造的颗粒配方。在一个例示性实施方案中，本发明的颗粒包含蛋白基质和PS，其中颗粒可为交联的。在一些特定实施方案中，当在收犹阵列中时或在颗粒制造后的溶液中收集后，使蛋白和PS颗粒组合物经受交联。在一个特定实施方案中，蛋白基质是颗粒组合物中的主要组分。在另一个特定实施方案中，PS基质是颗粒组合物中的主要组分。在另一个特定实施方案中，颗粒组合物中包含聚合物以物理保持多糖与蛋白缔合。在又一个特定实施方案中，聚合物组分是颗粒的主要组分，且蛋白和多糖被吸附到聚合物颗粒的表面。在另一个特定实施方案中，蛋白组分是颗粒的主要组分，且多糖被吸附到蛋白颗粒的表面。在另一个特定实施方案中，PS组分是颗粒的主要组分，且蛋白被吸附到PS颗粒的表面。在另一个例示性实施方案中，本发明的颗粒包含蛋白、PS和其他第三方基质组分，其中该组分不限于蛋白、非免疫原性蛋白、非抗原、糖、聚合物、疏水分子、小分子、盐等。在一个特定实施方案中，颗粒是共价交联的，而在另一个特定实施方案中，颗粒不是共价交联的。在另一个例示性实施方案中，本发明的颗粒包含核心，核心包括但不限于载体蛋白或者载体蛋白与第三方基质组分的混合物，其中颗粒的表面已被修饰以降低溶解度，并在表面上亦包含一种或多种目标多糖。表面修饰可包括但不限于颗粒制造后用例如PS和疏水分子的混合物包被颗粒表面。
在另一个例示性实施方案中，本发明的颗粒包含核心，核心包括但不限于载体蛋白和PS或者载体蛋白或蛋白、PS与第三方基质组分的混合物，其中颗粒的表面已被修饰以降低溶解度。表面修饰可包括但不限于颗粒制造后包被颗粒表面，并亦可包含设计用以递送颗粒至特异性B细胞群的组分。在另一个例示性实施方案中，本发明的颗粒包含含有PS和流感血凝素蛋白的颗粒，其溶解度是通过包含具有与血凝素蛋白结合的唾液酸表位的基质组分降低的。作为共价结合的有利备选，PS和载体蛋白与颗粒的非共价缔合可用于本发明。例示性实施方案包括但不限于以下情况其中蛋白和PS通过离子相互作用、吸附、疏水相互作用、相分离、物理缠结等与颗粒缔合、结合或连接。在一个例示性实施方案中，颗粒包含PS、物质(例如脂质或聚合物)和吸附于颗粒表面的载体蛋白。本文使用的第三方基质指添加剂、修饰剂、乳化剂、粘合剂或配体，其可被掺入颗粒组合物中以给予独特和/或有利性质，性质例如稳定性(热/pH)、同质性、均匀包装密度、多孔性、表面性质和电荷。例示性第三方基质组分包括但不限于PLGA、PLA、聚酐、PLGA-b-PEG、聚己酸内酯、壳聚糖、GRAS材料(例如阿拉伯半乳聚糖)、山嵛酸、氨基酸(例如L-精氨酸或亮氨酸)、非免疫原性蛋白(例如人血清白蛋白或明胶)或聚离子性(生物)聚合物(聚丙烯酸、壳聚糖、肝素、透明质酸(hylaronic acid)),其中PS和载体蛋白与这样的组分预混合。这样的组分可促进蛋白-多糖的包封。掺入的低分子量乳化剂(例如在食品中使用的那些)可与聚合物(例如PLGA或PLGA样聚合物)组合使用。例示性低分子量乳化剂包括但不限于大豆卵磷脂、甘油脂肪酸酯、蔗糖、脂肪酸酯和疏水氨基酸(例如亮氨酸)。在脂肪酸的情况下，脂肪酸(酯化和非酯化)对蛋白(例如卵白蛋白、HSA等)的亲和力来源于氨基酸侧链和脂肪酸羧基碳之间存在的不同离子和/或氢键合相互作用。这些相互作用可另外受脂肪酸链的大小调节。例如，油酸酯比棕榈酸酯更紧密地结合人和鼠白蛋白，而对牛白蛋白证明为相反。此外，载体蛋白的三级结构通常通过非局部相互作用来稳定-最常见的是形成疏水核心(除此之外还有例如盐桥、氢键、二硫键、和甚至翻译后修饰)。该三级结构似乎充当蛋白基本功能的基础。天然疏水的小分子氨基酸能够适应蛋白支架的内部疏水结合口袋，因此给予结构和化学稳定性和性质。亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸是可在用于吸入的喷雾干燥粉末中用作“分散性增强剂”的例示性氨基酸，并已知其修饰喷雾干燥颗粒的雾化特性。此外，配体疏水性与蛋白稳定之间有关联已知最疏水的配体异亮氨酸引起LIV蛋白的最显著稳定化。在一个例不性实施方案中，交联剂和带电分子亦是第三方基质的一部分。在一个例示性实施方案中，颗粒呈多糖和蛋白的基质的形式，其中多糖蛋白比范围是约1:99-约99: I。在备选的实施方案中，多糖:蛋白比是约2:98、3:97、4:96、5:95、6:94,7:93,8:92,9:91或10:90。在其他实施方案中，多糖蛋白比范围是约10:90-约 90:10，分别例如约15:85、例如约20:80、例如约30:70、例如约40:60、例如约50:50、例如约60:40、例如约70:30或例如约80:20。在一个例示性实施方案中，PVP/PEG的高分子量溶液用于收获和交联以保持蛋白颗粒对水性加工步骤不溶。在其他例示性实施方案中，溶解抑制技术包括使用交联剂(例如但不限于戊二醛、谷氨酸、同型双官能NHS和酰亚胺酯)、疏水分子(例如但不限于亮氨酸、脂质和脂肪酸)、选择的颗粒包被聚合物(例如但不限于GRAS、PLGA等)、脂质和非共价相互作用(例如但不限于电荷、白蛋白和疏水物)。用于本发明的合适多糖包括细菌多糖以及癌细胞的碳水化合物或者其他非自身或靶细胞碳水化合物。在单独特定的实施方案中，多糖是肺炎球菌多糖(PnP) 4和14。在多种例示性实施方案中，其他PNP和多糖选自纽莫法raz)、脑膜炎球菌(MeningococcaD、伤寒、细胞表面糖脂、糖蛋白、b型流感嗜血菌{Haemophilusinfluenzae) (HiB)、葡萄球菌属、衣原体、B型脑膜炎球菌(Mening B)、艰难梭菌{C. Difficile)、假单孢菌属iPseudomonas)、A和B型链球菌、肠产毒性大肠杆菌iBscherichia coli) (ETEC)、结核(TB)、志贺氏菌属{Shigella、、伤寒沙门氏菌{Salmonella肉毒杆菌、痕疫、伯克氏菌属(Jkirkholderia)等。例不性多糖包括但不限于肺炎链球菌^Streptococcus pneumoniae)的PnP4、PnP6B、PnP9V、PnP 14、PnP 18C、PnP 19F、PnP23F、PnPl、PnP3、PnP5、PnP6A、PnP7F 和 PnP 19A。用于本发明的合适载体蛋白包括但不限于CRM 197、破伤风类毒素、白喉类毒素、血凝素、脑膜炎球菌表面蛋白和荚膜蛋白。CRM197是来源于白喉毒素(DT)的无毒、突变蛋白的实例，其早就被识别为无毒蛋白并常被用作缀合疫苗的载体。基于其无毒特征，该蛋白已被用于多种目的，包括作为肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)的抑制剂和作为疫苗的免疫佐剂。其他合适载体蛋白包括但不限于肺炎球菌=PcsB-(B型链球菌的细胞壁分离所需的蛋白)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(StkP) (Intercell);金黄色葡萄球菌{S. Aureus)凝集素样序列(Als)，包括促进黏附于内皮细胞的Als3 (亦用于念珠菌属{Candida)的抗原)(Novadigm)、聚集因子A (ClfA) (Wyeth/Pfizer)、聚集因子B (ClfB)、铁表面决定簇B (IsdB)、Cna-FnBP融合蛋白、聚-N-乙酰葡萄糖胺；脑膜炎B :GNA1870，亦命名为因子H结合蛋白(fHbp)或rLP-2086 (Novartis) ;B型链球菌蛋白抗原C、R和X。不同PS之间在化学和/或物理结构中的变化可能需要颗粒制造化学、组成、添加齐U、设计等形式的不同处理，以维持、优化或容纳特定PS的官能度、相互作用或呈递。例如，本文所述的Prevnar 的7个PS中的数个包括反应基(例如羧酸基、胺基)、磷酸酯/磷酸化糖等，其可为交联或另外反应并改变PS的识别、呈递、功能等的位点。此外，在备选的实施方案中，本发明提供颗粒组成、尺寸和形状可调性以容纳多糖的备选构象表位，其可在这种表位或多糖的免疫原性和生物反应性中起作用。在一个例示性实施方案中，蛋白和多糖经由技术(例如喷雾干燥、超滤、乳化等)吸附于“其他”颗粒。本发明中可使用的组合物、组分、物质、技术和化学另外公开于例如US20080009606 ；uTheoretical stability maps for guiding preparation of emulsionsstabilized by protein-poly saccharide interfacial complexes (用于指导制备为蛋白-多糖界面复合物所稳定的乳剂的理论稳定性图)”，Cho YH等，Lan咖uir, 2009年6月16日；25 (12):6649-57 ；US 7,601, 381 ；US 20090238885 ;“Gel particles from spray-drieddisordered polysaccharide (来自喷雾干燥的无序多糖的凝胶颗粒)”，Paulomi Burey等，Carbohydrate Polymers,第 76 卷,第 2 期,2009 年 3 月 17 日，第 206-213 页；每一篇通过引用以其整体结合到本文中。在一个例示性实施方案中，多糖吸附于PRINT 颗粒的表面，例如通过将基质组合 物引入包被/包封颗粒的收获阵列中或上存在的多糖中。在一个特定实施方案中，待处理的颗粒是PLGA-DC-胆固醇颗粒，其产生多糖包被的PLGA-DC-Chol纳米粒/微粒。在另一个实施方案中，多糖可另外与聚合物(例如Pv0H、PvP、Luvitec等)混合。换句话说，可将无活性组合物的颗粒收获到活性组合物(例如抗原)的或包含其的收获层上。在这样的一个实施方案中，颗粒在收获层中与活性物质吸附、结合、进行电荷相互作用、化学连接、物理连接或另外缔合并形成疫苗。在一个例示性实施方案中，从DC-胆固醇/PLGA制造PRINT 颗粒并收获在多糖薄膜上，有或没有蛋白或者蛋白的次级吸附。收获聚合物稀释剂；存在具有多包被收获层(例如，在PV0H、透明质酸、葡聚糖、黄原胶的薄膜之上的多糖)的选择；和基质添加剂筛查。第三方基质代表另一例示性实施方案，其中其他蛋白基质充当吸附于颗粒表面的多糖/蛋白的载体。合适的基质包括但不限于有或没有糖的MSA/HSA/明胶，其中MSA是小鼠血清白蛋白，HAS是人血清白蛋白。其他载体多糖基质包括，例如透明质酸或任何粘合剂材料例如胶(例如瓜尔胶)天然粘合剂以及衍生物例如海藻酸盐、壳聚糖、明胶和明胶衍生物。胶和葡聚糖代表亦可使用的特定实施方案。在一个例示性实施方案中，这些材料是除了(多糖和蛋白)共混物外的基质的一部分。在另一个例示性实施方案中，这些材料是收获层的一部分。在又一个实施方案中，这些材料与PLGA或PLGA样聚合物(亲水-疏水基质)以特定百分比作为共混物联合使用。可在不涉及共价交联的颗粒基质组合物中起必要作用的聚合物包括但不限于疏水聚合物(例如PLGA、PLA、PLLA)、聚己酸内酯、明胶、琼脂糖、琼脂胶、琼脂、脂质、可降解的PEG、人工蛋白和聚酐。该看法的原理在于，预混合特定量的PLGA与(蛋白和多糖)共混物可使颗粒保持在一起，而不需要化学交联主要组分(载体蛋白和多糖)。PEG亦可用作粘合剂和基质形成剂。疏水聚合物例如但不限于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚维酮通常在形成模塑微粒和纳米粒中被用作收获层。已知合成聚合物(例如Luvitec/聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丙烯酸衍生物(例如Eudragit、Carbopol))能够使得显著的膜形成、起始粘着和粘附于不同材料、复合物形成的能力高、稳定和溶解能力好、对pH变化不敏感、易被辐射诱导的交联性以及生物相容性好。蛋白变性是水性溶液的温度和pH的函数。虽然较高的温度通常可加速缀合反应，但是较高的温度亦可引起蛋白的热变性。虽然在PRINT 颗粒制造期间这可能是真的，但是以升高的浓度加入一些上文提及的这些粘合剂或添加剂(例如多糖或PLGA)可保护蛋白免受热变性。此外，多糖(作为粘合剂)/聚合物(PLGA样)亦可在防止过多蛋白变性和/或聚集中充当保护试剂。本发明的多种例示性实施方案涉及用戊二醛交联的颗粒的备选组合物。颗粒用或通过离子相互作用保持在一起。在一个特定实施方案中，颗粒组合物包含下述组分卵白蛋白、多糖、甘油、氨基胍、稀释剂H20:IPA 7:3。在另一个特定实施方案中，组分具有下述比卵白蛋白(10%)、多糖(2.5%)、甘油(10%)、氨基胍(10%)、稀释剂H20:IPA 7:3。在一个例示性实施方案中，颗粒通过与颗粒的基质组合的同型双官能交联剂保持 在一起。在一个特定实施方案中，颗粒具有下述组成卵白蛋白、多糖、甘油、酰亚胺酯接头和稀释剂H20:IPA 7:3。在另一个特定实施方案中，组分具有下述比卵白蛋白(10%)、多糖(2.5%)、甘油(10%)、酰亚胺酯接头(10%)和稀释剂H20:IPA 7:3。在本发明的其他特定实施方案中，颗粒具有下述组成与卵白蛋白组合的PLGA-葡聚糖共混物、多糖、甘油和稀释剂H20:IPA 7:3。在另一个特定实施方案中，颗粒具有呈下述比的下述组成与卵白蛋白(10%)组合的PLGA (1%)-葡聚糖(2. 5%)共混物、多糖(2.5%)、甘油(10%)和稀释剂H20:IPA 7:3。在本发明的其他特定实施方案中，颗粒具有下述组成与卵白蛋白组合的PLGA-黄原胶共混物、多糖、甘油、稀释剂H20: IPA 7:3。在另一个特定实施方案中，颗粒具有呈下述比的下述组成与卵白蛋白(10%)组合的PLGA (1%)-黄原胶(0. 625%)共混物、多糖(2.5%)、甘油(10%)、稀释剂H20:IPA 7:3。本发明的免疫原性组合物可包含其他物质、赋形剂或稳定剂。例如，为了通过增加纳米粒的负(电位来增加稳定性或降低非特异性摄取，可加入某些带负电荷的组分。这种带负电荷的组分包括但不限于由甘胆酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、牛磺胆酸、鹅脱氧甘胆酸、鹅脱氧牛磺胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸、脱氢胆酸等组成的各种胆汁酸的胆汁盐；包含基于卵磷脂(蛋黄)的磷脂的磷脂，其包括下述磷脂酰胆碱棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰二十烷酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰胆碱。其他磷脂包括L-a-二肉豆蘧酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和其他相关化合物。带负电荷的表面活性剂或乳化剂亦适合作为添加剂，例如胆固醇硫酸酯钠等。类似地，可通过加入带正电荷的组分来改变纳米粒的正(电位。适合口服给药的制剂的组成可为(a)液体溶液剂，例如在稀释剂(例如水、盐水、果汁、橙汁等)中溶解有效量的颗粒，(b)胶囊剂、囊剂或片剂，各包含预定量的颗粒作为固体或颗粒，(C)合适液体中的混悬剂和(d)合适的乳剂。片剂形式可包含乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维、阿拉伯树胶、明胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂以及药理学相容的赋形剂中的一种或多种。糖锭剂形式可包含香料(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或西黄蓍胶)中的颗粒，以及包含活性成分在惰性基质(例如明胶和甘油，或者蔗糖和阿拉伯树胶)中的锭剂，除了活性成分外还包含这样的赋形剂的乳剂、凝胶剂等是本领域已知的。合适的药学载体、赋形剂和稀释剂的实例包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯卩比咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、糖浆、甲基纤维素、甲基羟苯酸酯和丙基羟苯酸酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。制剂可另外包含润滑剂、润湿剂、乳化剂和助悬剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂。适合胃肠外给药的免疫原性制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液(其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与目标受体的血液相容的溶质)和水性和非水性无菌混悬剂(其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。制剂可存在于单剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中，并可在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在临使用前仅需加入无菌液体赋形剂，例如注射用水。可从之前描述种类的无菌散剂、颗粒剂和片剂制备临时的注射溶液和混悬剂。在一些实施方案中，药物组合物被配制为具有约4. 5-约9. 0 的pH范围，包括例如约5. 0-约8. O、约6. 5-约I. 5和约6. 5-约I. 0的任何pH范围。在一些实施方案中，药物组合物的PH被配制为不小于约6，包括例如不小于约6. 5、7或约8的任何值。亦可通过加入合适的张度调节剂(例如甘油)将免疫原性组合物制备为与血液等渗。可将本文所述的包含免疫细胞靶向的微粒和/或纳米粒的免疫原性组合物经由多种途径给予受试者(例如人)，途径例如胃肠外，包括静脉内、动脉内、腹膜内、鼻内、肺内、口服、吸入、囊内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内或经皮。例如，可通过吸入至呼吸道的靶免疫细胞给予纳米粒组合物。在一些实施方案中，静脉内给予纳米粒组合物，而在其他实施方案中，口服给予纳米粒组合物。本发明免疫原性组合物在给予时提供免疫细胞靶向的微粒和/或纳米粒的较好生物分布，并另外使得能够增加稳定性。以这种方式，在靶位点上递送了较多的活性物质。数据
已进行了两个体内研究最初的研究使用(i)作为载体蛋白的OVA (无非内毒素)和PnP4 (备选地PnP14);和(ii)基于吸附的理论与吸附有PnP4 (备选地PnP14)的聚合物颗粒。在随访研究中，再次测试OVA (无非内毒素)蛋白载体，并将研究扩大至测试无内毒素OVA以及HSA与PnP4 (备选地PnP 14)的组合。如下文所示，加强免疫前数据与加强免疫后I周和加强免疫后2周一样显示显著的IgG反应。引人关注地，用可溶性对照PnP14在初次免疫注射PRINT 颗粒后的加强免疫在加强免疫后I周和2周显不IgG反应。与Prevnar (领先的现有技术产品)相反，对于PRINT 颗粒，初次免疫后效价始终显示IgG反应。在一个颗粒组中，在初次免疫后两周，PnP14 IgG效价显示PRINT 颗粒具有是Prevnar 2倍大的IgG反应。作为对照，注射可溶性OVA与可溶性PnP14未产生可观察的抗体效价。在例示性实施方案中，颗粒组合物可包含与蛋白/多糖组合物混合的聚合物。在特定实施方案中，聚合物包括生物相容性或生物可降解聚合物，并可为O-约5 Wt %、约0. 5-约 5 wt %、约 0. 5-约 4 wt %、约 0. 5-约 3 wt %、约 0. 5-约 2 wt %、约 0. 5-约 I. 5 wt%、约1.5 wt %或约I wt %。在其他特定实施方案中,颗粒组合物中的蛋白与多糖比可为约 99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80或10:90。在一些例示性实施方案中，聚合物给颗粒增加物理稳定性并帮助维持多糖与蛋白的物理缔合。在一些实施方案中，将聚合物选择为生物相容性、生物可降解、受控降解等聚合物。本发明的另外例示性实施方案包括聚合物与蛋白和多糖组合的的颗粒。在一个特定实施方案中，颗粒是非交联的，并包含16 wt%的聚合物、66 wt%的蛋白和18 wt%的多糖。在这种的具体实施方案中，聚合物包含PLGA。在这种的具体实施方案中，多糖包含肺炎球菌多糖14。在这种的具体实施方案中，蛋白包含卵白蛋白。在一个具体实施方案中，颗粒组合物包含16 wt%的PLGA聚合物、66 wt%的卵白蛋白蛋白和18 wt%的肺炎球菌多糖14。在另一个实施方案中，本发明包括具有蛋白与多糖比为3. 5:1-3. 75:1的多糖疫苗颗粒。本发明的一个特定实施方案包括基于聚合物的多糖疫苗颗粒，其具有的卵白蛋白蛋白与肺炎球菌多糖比为3. 67:1。 在一些例示性实施方案中，颗粒的形状没有控制颗粒化学组成、PS比、载体蛋白比或第三方基质组成比关键。根据基于聚合物的多糖疫苗颗粒的若干这些实施方案，颗粒可形成为非离散颗粒或者关于三维形状不具有或不维持严格控制，因为例如聚合物是非交联的、不是重度交联的或者是热敏感的或溶剂敏感的等。本发明的另外例示性实施方案包括蛋白与多糖组合的颗粒。根据从蛋白和多糖制造的多糖疫苗颗粒，颗粒在制造期间可为交联的，或者可在颗粒制造后将交联剂引入颗粒中以便形成非缀合的多糖疫苗。在这种的一些例示性实施方案中，蛋白包含卵白蛋白、CRM或HSA。在这种的一些例示性实施方案中，蛋白包含卵白蛋白、CRM或HSA，多糖包含肺炎球菌多糖14。在本发明的多糖疫苗颗粒的一个特定实施方案中，蛋白包含范围为约90-约99.9 wt%的卵白蛋白，多糖范围是约10-0.01 wt%。在模塑这种颗粒后,颗粒可用交联剂处理。在本发明的多糖疫苗颗粒的一个特定实施方案中，蛋白包含范围为约92-约99. 9 wt%的卵白蛋白，多糖范围是约8-约0.01 wt%。在模塑这种颗粒后，颗粒可用交联剂处理。在本发明的多糖疫苗颗粒的一个特定实施方案中，蛋白包含范围为93-99. 9 wt%的卵白蛋白，多糖范围是7-0. 01 wt%。在模塑这种颗粒后，颗粒可用交联剂处理。在本发明的多糖疫苗颗粒的一个特定实施方案中，蛋白包含93. 7 wt%的卵白蛋白，多糖包含约6. 3 wt%的肺炎球菌多糖。在模塑这种颗粒后，颗粒可用交联剂处理。在本发明的多糖疫苗颗粒的一个特定实施方案中，蛋白包含约96. 4 wt%的卵白蛋白，多糖包含约3. 6 七％的肺炎球菌多糖。在模塑这种颗粒后，颗粒可用交联剂处理。在多糖疫苗颗粒的一个特定实施方案中，蛋白包含约99 wt%的卵白蛋白，肺炎球菌多糖约I wt%。在模塑这种颗粒后,颗粒可用交联剂处理。在本发明的多糖疫苗颗粒的一个特定实施方案中，蛋白包含约99. 7 wt%的卵白蛋白，多糖包含约0. 3 wt%的肺炎球菌多糖。在模塑这种颗粒后,颗粒可用交联剂处理。在多糖疫苗颗粒的一个特定实施方案中，蛋白包含约99. 97 wt%的卵白蛋白，多糖包含约0.03被％的肺炎球菌多糖。在模塑这种颗粒后，颗粒可用交联剂处理。在一个备选的特定实施方案中，本发明的蛋白组分包含约96. 4%的HSA蛋白，多糖组分包含3. 6 wt%。在另一个特定实施方案中，多糖疫苗颗粒的蛋白组分包含约45 wt%的CRM蛋白，多糖组分包含约55 wt%的肺炎球菌多糖14。在一些实施方案中，颗粒的形状没有控制颗粒化学组成、PS比、载体蛋白比或第三方基质组成比关键。根据基于蛋白的多糖疫苗颗粒的一些实施方案，因为例如用某溶剂配制的颗粒在移除该溶剂后剩下多孔或柔软颗粒等，颗粒可形成为非离散颗粒或者关于三维形状不具有或不维持严格控制。
实施例实施例I :小鼠研究I，交联的蛋白/多糖颗粒
通过将各组分以下述浓度溶解在水中来制备各颗粒组分的溶液2mg/mL多糖、IOmg/mLCRM197、55mg/mL甘油和55mg/mL卵白蛋白。通过混合下表中给出的每体积的单独组分溶液 来制备用于制备颗粒的溶液。这些终溶液包含3被％总固体。在所有铸膜液中，甘油为0.9wt%，卵白蛋白名义上为2 wt%和多糖(PnP4或PnP14)为0. 075 wt%。包含CRM197的溶液为
0.075 wt%的类毒素。
I ieitiSE I^IiLPS^pL TRM1^ I pL 计油! |iL OVA j pL 水^总体 fc I II <2nig/niL| (IfiiififmLl | (55ms/mL)丨(55n jjtel4 |fpL) |
I.............ovr+fiiPil............I.................ms...............'...........................I............................I......................ml.......................;....................Uiij...................j......................j...............5 ...............|
fCIVA + PnPI4 + j’ IIjjj
ICRMl4J I112,5 HS I4'IJ II4 j9S jJl |
IOVA + PnP4 + —..j' ji(ij
ICRMl1J IMJ IiJ II8 ,6j13 j25 |使用#3 Mayer杆，在5mil生PET上包被铸膜液，并立刻用冷空气吹以蒸发水并形成蛋白、多糖和甘油的薄膜。薄膜目视表现为透明和均匀。通过用薄膜层压模具然后通过加热夹[温度205° F、压力60psi、速度2fpm]，填充具有200nm X 200nm圆筒形腔的Fluorocur模具。在通过加热夹后将PET与模具分离，留下填充有薄膜组合物的模腔。然后通过再次通过加热夹[温度205° F、压力60psi、速度2fpm]，将填充的模具层压为Luvitec包被的PET收获层。冷却后，将模具从收获层剥离，结果是200nm X 200nm颗粒自模腔转移至收获层。将颗粒在收获薄板上4°C保存。戊二醛被用作模塑多糖/蛋白颗粒的交联剂。将戊二醛(70%，在水中)应用于颗粒阵列。将PET薄板放置在收获薄板之上，橡胶滚筒用于将戊二醛铺展到整个阵列(阵列交联)。10分钟后，移除PET薄板。使用聚乙烯叶片细胞刮棒将颗粒收集到70mM CNBH3Na(aq)中。通过离心3次沉淀颗粒(30分钟，11500 X g，4°C )，每次移除上清液并将颗粒重悬到ImL WFI中。注射之前将颗粒进一步稀释到无菌(0. 22Mm过滤)0. 1% PVOH 100k/5%甘露糖醇溶媒中。亦测试吸附颗粒，其中多糖单独或者CRM197与多糖两者吸附到80nm X 320nm阳离子性95% PLGA/5% pDMAEMA基础颗粒的表面。通过将PLGA/pDMAEMA组合物引入Fluorocur模具腔中、收集并在0. 1% PVOH 100K中纯化来制备基础颗粒。基础颗粒形成如下的6个不同组的吸附颗粒I.对于一组,将水中的18. 2 PnP4加入混悬液中的728吒基础颗粒中。将混合物涡旋10秒，然后在冰上孵育30分钟。注射之前将颗粒在无菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀释。给予颗粒以向各动物递送80呢颗粒和2 I^g PnP4。2.对于一组，将水中的18. 2吒PnP4加入混悬液中的1092吒基础颗粒中。将混合物涡旋10秒，然后在冰上孵育30分钟。注射之前将颗粒在无菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀释。给予颗粒以向各动物递送120呢颗粒和2 I^g PnP4。3.对于一组，将水中的18. 2吒CRM197加入混悬液中的728吒基础颗粒中。然后将水中的18. 2 PnP4加入该混合物中。将混合物涡旋10秒，然后在冰上孵育30分钟。注射之前将颗粒在无菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀释。给予颗粒以向各动物递送80吒颗粒、2吒PnP4和2吒CRM197。4.对于一组，将水中的18. 2吒CRM197加入混悬液中的1092吒基础颗粒中。然后将水中的18. 2 PnP4加入该混合物中。将混合物涡旋10秒，然后在冰上孵育30分 钟。注射之前将颗粒在无菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀释。给予颗粒以向各动物递送120吒颗粒、2吒PnP4和2吒CRM197。5.对于一组，将水中的18. 2吒PnP14加入混悬液中的1092吒基础颗粒中。将混合物涡旋10秒，然后在冰上孵育30分钟。注射之前将颗粒在无菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀释。给予颗粒以向各动物递送120呢颗粒和2 I^g PnPH06.对于一组，将水中的18. 2吒CRM197加入混悬液中的1092吒基础颗粒中。然后将水中的18. 2 PnP14加入该混合物中。将混合物涡旋10秒，然后在冰上孵育30分钟。注射之前将颗粒在无菌0. 1% PVOH 100K/5%甘露糖醇溶媒中稀释。给予颗粒以向各动物递送120吒颗粒、2吒PnP14和2吒CRM197。与颗粒结合的CRM197由Bradford来测试。所有组被测定为具有超过84%的与基础颗粒结合的CRM197。与基础颗粒结合的多糖由HPLC来测试。所有PnP4组被测定为具有100%的多糖结合。PnP14组被测定为具有超过42%的多糖结合。来自上文颗粒的免疫原件总结:
可溶性多糖(参见结果)和无抗原吸附的裸PLGA/pDMAEMA颗粒不产生可检测的IgG反应，表明未实现T细胞依赖的抗多糖抗体反应和相关的记忆反应。卵白蛋白+ PnP14颗粒产生了可检测的IgG反应，表明诱导了 T细胞依赖的抗多糖抗体反应，引起抗体同种型转换和记忆反应的发生。卵白蛋白+ PnP14 + CRM197颗粒产生了可检测的IgG反应，表明诱导了 T细胞依赖的抗多糖抗体反应，引起抗体同种型转换和记忆反应的发生。Prevnar 产生了可检测的IgG反应,表明诱导了 T细胞依赖的抗多糖抗体反应,弓I起抗体同种型转换和记忆反应的发生。此外，单次注射后，卵白蛋白/多糖颗粒始终能够诱导产生可测量的抗多糖IgG效价(初次免疫后4周测量)。该行为未在用Prevnar (Pfizer Inc.)注射的动物中观察到，如图I所示。图I
权利要求
1.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含 含有实质上均匀组合物的模塑颗粒， 其中所述实质上均匀组合物包含免疫原性量的与多糖缔合的载体蛋白。
2.权利要求I的免疫原性组合物，其中所述多糖是肺炎球菌多糖。
3.权利要求I的免疫原性组合物，其中所述载体蛋白呈基质的形式。
4.权利要求I的免疫原性组合物,其中所述多糖呈基质的形式。
5.权利要求I的免疫原性组合物，其中所述颗粒是非交联的或交联的。
6.权利要求I的免疫原性组合物，其另外包含选自以下的基质实质上非免疫原性蛋白、糖、聚合物和疏水物。
7.权利要求I的免疫原性组合物,其另外包含聚合物,其中所述聚合物物理上迫使所述载体蛋白与所述多糖缔合。
8.权利要求I的免疫原性组合物，其另外包含聚合物，其中所述多糖或载体蛋白被吸附在颗粒的表面。
9.权利要求I的免疫原性组合物,其中所述蛋白占90wt%-99. 9 wt%，和所述多糖占10 wt%-0. I wt%0
10.权利要求I的免疫原性组合物，其中所述蛋白包含90wt%-99. 9 wt%的卵白蛋白、CRM或HSA，和所述多糖包含10 wt%-0. I wt%的肺炎球菌多糖14。
11.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含 含有非交联组合物的模塑颗粒，所述非交联组合物包含约10-20 wt%的聚合物、约60-70 wt%的蛋白和约10-25胃七％的多糖。
12.权利要求11的免疫原性组合物,其中所述聚合物包含约16wt%的PLGA。
13.权利要求11的免疫原性组合物,其中所述蛋白包含约66wt%的卵白蛋白、CRM或HSA。
14.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述多糖包含约18 1%的肺炎球菌多糖14。
15.一种优化多糖疫苗性能的方法，所述方法是通过使模塑的二维阵列颗粒的免疫原性多糖或免疫原性蛋白组分的类型或化学计量学变化和测试所述颗粒的性能。
16.一种用于制造多糖疫苗的系统，其包括选择与蛋白和多糖相容的基质组合物和通过在聚合物模具中模塑组合物从所述组合物形成颗粒，其中所述组合物包含约90-99. 9wt%的蛋白和约10-0. I wt%的多糖。
17.权利要求16的系统，其中基质组合物的相容性包含不降低所述蛋白或多糖免疫原性的组分和处理。
全文摘要
制备颗粒组合物用作多糖颗粒疫苗。
文档编号A61K39/00GK102834112SQ201180020342
公开日2012年12月19日 申请日期2011年2月22日 优先权日2010年2月22日
发明者S.M.雷勒, A.墨菲, B.胡拜 申请人:流体科技公司