专利名称：用于治疗其中涉及金属蛋白酶的病变的舒洛地昔的制作方法
用于治疗其中涉及金属蛋白酶的病变的舒洛地昔本发明公开了用于减少循环的基质金属蛋白酶(MMP)尤其是MMP-9的舒洛地昔，或至少其组分之一。舒洛地昔及其组合物可用于治疗其中涉及MMP的病变，诸如心血管疾病、由糖尿病引起的心血管疾病、静脉曲张、慢性静脉功能不全(CVI)、胃肠溃疡、肺部疾病以及肿瘤病变。
背景技术：
最近的研究证实了属于基质蛋白(matrixin)家族的、称为基质金属蛋白酶(MMP)的一组锌依赖性内肽酶参与心血管病理情况的血管改变。
静脉高血压是与大循环及微循环病症相关的多种病理的基础，并且引起内皮中白细胞的浸润、心瓣膜退化且最终导致静脉壁的重塑/重排，这可能导致回流、或静脉曲张及皮肤病变形成，如Bergam J.等人在Ann. Vase. Surg. 21 (2007), 260-266中描述的那样。Raffetto JD.等在Thromb. Res. 123 (2009) S66-S71中描述，在慢性静脉病变进展期间观察到的改变可能与基质金属蛋白酶(MMP)水平及它们的组织抑制剂( ΜΡ)之间的血液平衡的改变相关。MMP和 ΜΡ均参与了细胞外基质的生理重塑，它们还在细胞通讯中起着重要作用。已在不同的病变中发现了高MMP浓度,如Mannello F.等在Curr. Cancer DrugTargets 5 (2005)，285-298 中报道的那样。在 MMP 中，MMP-9 (明胶酶 B，92、130 和 225KDa 的EC3. 4. 24. 35)参与多种病变，包括肿瘤病变，提示它们作为循环酶存在，以及它们的升高与不同类型的癌症诸如乳腺癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌以及黑色素瘤的进展相关，如RahkoE.等在 Tumor Biol. , 30 (5-6) (2009)，574-64 中所描述。在血管病变情况中，以及由糖尿病引起的那些，清楚地显示了 MMP的致病作用。Galis Z.S.等人在 Circ. Res. 90(2002)，251-262，KadoglouN. P.等人在 Angiology56(2005), 173-189, Derosa G.等人在 Diabetes Metab. 33 (2007)，129-134 以及 Tayeb j eeΜ. H.等人在Diabetes Care 27 (2004)，2049-2051中描述了糖尿病患者中循环MMP水平的升高。Raffetto JD.等人在 Biochem. Pharmacol. 75 (2008), 346-359 中证实了 MMP 在血管疾病中的重要性，报道了静脉壁中升高的细胞外基质降解(ECM)参与了静脉松弛、静脉曲张形成、皮肤改变的早期步骤，并最终导致静脉性溃疡的形成。在与MMP表达升高相关的多种病理机制中，白细胞-内皮相互作用非常重要并且代表了药理治疗的可能目标。Mannello F.等人在Arterioscler. Thromb. Vasc.Biol. 28(2008)，611-614中描述了白细胞和血小板含有较高量的MMP，其可在白细胞活化/脱粒之后或在血小板聚集期间被释放至细胞外环境中。此外，MMP-9在刺激作用(诸如由凝结过程诱导的反应)后从血小板和白细胞中释放。已知在凝集相期间被活化的纤溶酶成为MMP活化剂。在存在于人类壁中并且可能与癌侵入有关的蛋白水解酶之中，已证实MMP涉及降解间质基质和基底膜的几乎所有蛋白的能力，使得细胞扩散并浸润入相邻的壁。多种化合物，诸如细胞粘附分子(adhesion cellular molecules)的生长因子受体、趋化因子、细胞因子、细胞凋亡配体以及血管生成因子可能与MMP相互作用，改变其表达和活性。这些蛋白水解酶作用于许多参与肿瘤形成步骤的生物活性底物，所述肿瘤形成步骤诸如原发肿瘤的生长；血管发生；肿瘤细胞的外渗或内渗；转移细胞迁移、侵入到继发器官中；肿瘤生长的开始和维持。已在动物和人肿瘤模型中进行了多种临床研究，以评估循环基质金属蛋白酶减少的重要性。得到的结果导致了开发合成抑制剂，如Ramnath N.等在Curr. Oncol.Rep. 6(2004) ,96-102 中描述的那样。
所研究的主要抑制剂包括胶原、四环素类和双膦酸盐衍生物的模拟肽和非模拟肽。用可获得的化合物进行的临床试验显示长期的治疗导致骨骼肌疼痛和炎症。尽管这些事件显示是可逆的，并且患者在短暂的中止期后重新开始治疗，但这些意外的不良事件限制了施用剂量。此外，当将用于治疗肿瘤疾病的临床试验扩展至更大数量的患者时，除了由于细胞抑制作用导致的系列毒理学问题之外，没有观察到显著的治疗益处，如Mannello F.等人在 Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005), 285-298 中描述所描述。在临床试验中研究的一些MMP抑制剂是巴马司他、马立马司他、普啉司他、BAY12-9566、CGS27023A以及四环素衍生物。巴马司他，即BB_94(W0 90057191)，是异羟肟酸衍生物，其模拟天然底物的肽结构。巴马司他是MMP的强抑制剂，并且是用于临床试验的首个MMP抑制剂，但其显示出由于低溶解性和吸收导致的低选择性。此外，巴马司他具有较低的顺应性，仅能通过注射入胸膜腔或腹腔施用。由于严重的副作用诸如强的局部炎性组织反应、恶心、腹部疼痛，III期临床试验几乎立即被中止，如Tu G.等人在Curr. Med. Chem. 15 (2008)，1388-1395中所报道。马立马司他，即BB-2516(W0 9402447)，是与巴马司他具有类似结构的异羟肟酸衍生物，但其具有更高的溶解度并更容易通过口服施用吸收。马立马司他与巴马司他一样具有低特异性，并且其在约30%的所有受治疗患者中具有毒性，显示出骨骼肌疼痛以及僵硬，其从小的手关节开始，并且上移至手臂和肩，尤其是腱插入点周围；踝及膝关节周围壁的纤维化和坏死以及与体重减轻相关的胃病，如Vihinen等在Int. J. Cancer 99 (2002),157-166中所描述。普啉司他，即AG3340 (W0 90720824)，是异羟肟酸衍生物，其选择性地对抗一些参与肿瘤侵入和转移的MMP。在临床试验期间，在肩、膝和手的关节处发生副作用，立即中止治疗，如 Ramnath N.等在 Curr. Oncol. Rep. 6 (2004), 96-102 中所描述。BAY 12-9566 (US 4，705，798)是丁酸衍生物，并且在多个临床试验中其显示出毒性，表现为血小板减少、贫血、肝酶和胆红素升高、恶心、疲劳以及头疼，如Nelson A.等在J. Clin. Oncol. 18(2000)，1135-1149 中所描述。已报道CGS27023A(US 5，455，258)具有广泛的皮肤刺激、肌痛和关节痛的毒性作用。
四环素衍生物在临床试验期间也显示出严重的副作用，诸如疲劳、精神错乱、恶心、呕吐、皮肤光毒性、胰酶升高，其限制了施用剂量，如HidalgoM.等人在J. Natl. CancerInst. 93 (2001)，178-193 中所描述。酶谱法和反向酶谱法是当前用于生物样品中MMP和TIMP分析的技术。所有类型的底物酶谱法均源自明胶酶谱法。该技术是相同的，除了底物根据MMP或TIMP的类型而不同之外。在这些技术中，在变性、非还原条件下、在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下通过电泳分离蛋白质。明胶-酶谱法是主要用于明胶酶MMP测定的技术，并且其对检测数皮克浓度的MMP-2和MMP-9极其敏感。还应当考虑，其他MMP，诸如MMP-1、MMP-8和MMP-13也能降解该底物。该技术基于在具有特定底物的聚丙烯酰胺凝胶中的电泳分离；SDS变性MMP，使其失活，电泳迁移之后，在合适缓冲剂中将SDS从凝胶中移除，所述缓冲剂能恢复MMP的结构和功能。此后，如果温育该凝胶，则激活的明胶酶消化明胶，使其转化为低分子量肽，通过洗涤将其移除，如 Mannello F.等在 Clin. Chem. 49 (2003)，339-34 中所描述。 将凝胶置于显影溶液中，该溶液例如包含考马斯(Coomassie)，然后用包含甲醇或乙醇和乙酸的溶液脱色。凝胶的染色区域是由于存在未降解的明胶，而未染色的区域则是由于MMP的酶活性。酶活性与清晰条带的延展(extension)成比例，因此可用装备有图像分析仪的密度计仪器分析和定量。酶谱提供了 MMP尤其是MMP-2和MMP-9的具体并且独特的信息，因为该两种酶能够基于不同电泳迁移率而分开，所述电泳迁移率取决于它们的分子量。为这一目的，在相同的凝胶中放置相应于前-MMP_272kDa，、以及前-MMP-9和MMP-9复合物(92、130及225kDa)的合适分子量标准品，用于比较。Mannello F.等人在 Clin. Biochem. 41 (2008), 1466-73 中研究了向外周血液样品中添加高分子量肝素锂的效果，用于评估HMWH对血液中MMP和 ΜΡ表达的影响。所描述的影响是HMWH具有直接和间接的改变循环MMP和TIMP的量以及增加TIMP-2的释放的作用。这一公开的内容对于描述高分子量肝素(HMWH)对血液处理(manipulation)中MMP表达的影响是非常重要的，从而在测量MMP的方法中标准化血液样品处置的操作。在这一公开中，没有关于肝素的药理学应用的提及和/或建议。此外，没有报道观察到作用的肝素锂浓度。因此，不可能知道提供所观察到的效果的肝素锂浓度是否可能在治疗上是有用的，因为已知与HMWH相关的出血高风险。不过，因为知道肝素通常通过注射施用，因此任何用于改变MMP血浆浓度的可能的肝素应用均被认为遵循相同的途径。Caenazzo I.等在 Nephrol. Dial. Transplant 2001,16,1769-75 中也报道了肝素对MMP-2和TMP-2mRNA表达的影响。因此，仍然有寻找用于药物制品的活性组分的需要，所述药物制品用于降低血液循环MMP浓度，从而用于治疗其中涉及MMP的所有病变，例如炎症、感染性疾病或肿瘤疾病或心血管疾病的发病。这些病变例如包括由糖尿病衍生的病变、静脉曲张、慢性静脉功能不全(CVI)、动脉粥样硬化心肌梗死后心脏损坏(cardiac break)、腹主动脉瘤、肺病、肿瘤的增长和进展、原发肿瘤的生长、异常血管生成、肿瘤细胞的外渗和内渗。血管疾病选自静脉曲张、人动脉粥样硬化、心肌梗死后心脏损坏、腹主动脉瘤。还需要获得这样的药物，其在治疗有效剂量下没有任何副作用或毒作用，可被患者接受并且可通过口服、肌内或静脉内注射途径施用，用于治疗其中涉及MMP的所有病变。出人意料地发现，并且其为本发明的目的，舒洛地昔、或其组分之一，尤其是由舒洛地昔获得的硫酸皮肤素(SDX-DS)或由舒洛地昔获得的肝素(SDX-HEP)，抑制和/或降低循环MMP的水平。舒洛地昔是从哺乳动物肠粘膜提取的天然糖胺聚糖(GAG)的天然混合物，如在US3，936，351中所描述，其包含平均分子量为7kD的快速移动的肝素(SDX-HEP)以及平均分子量为25kD的硫酸皮肤素(SDX-DS)的混合物。舒洛地昔中包含的其他可能的组分是软骨素、硫酸肝素。应当认为舒洛地昔是独特的活性成分，与其他糖胺聚糖不同，其包含约80%重量的SDX-HEP以及约20%重量的SDX-DS。这些组分至今仍未被分离，并且舒洛地昔的组分是用例如凝胶渗透色谱和电泳的分析方法确定的。已知舒洛地昔显示出对抗凝血酶III及肝素辅因子II的高亲合性，抑制因子Xa和凝血酶，活化组织纤溶酶原以及减少纤维蛋白原水平，如Ofosu F. A.在Semin. Thromb. Hemost. 24(1998)，127-38 以及 Ceriello A.等在 Diab. Nutr. Metab.，6 (1993)，1-4 中所描述。因为已知来自纤溶酶原的纤溶酶活化是MMP局部活化机制之一，所以舒洛地昔的已知性质使得得出结论这一化合物将升高循环MMP的浓度。本发明描述了舒洛地昔或其组分之一，尤其是SDX-DS或SDX-HEP，其抑制和/或降低参与多种疾病的循环MMP，并且尤其是MMP-9 (也称为明胶酶B)，所述疾病尤其是感染病或肿瘤疾病、由高MMP水平表征的血管疾病、胃肠溃疡、肿瘤的增长和进展、原发肿瘤的生长、改变的血管发生、肿瘤细胞的外渗和内渗，及其组合。对于由高MMP水平表征的血管疾病，本发明尤其涉及慢性静脉功能不全(CVI)、静脉曲张、心肌梗死之后的心脏损伤、腹主动脉瘤、静脉松弛、肺病以及肿瘤疾病。本发明的另一出人意料且重要的方面是从舒洛地昔中分离的硫酸皮肤素(SDX-DS)和低分子量肝素(SDX-HEP)，获得它们的方法以及它们单独或在其混合物中用于体外和体内抑制和/或降低MMP释放的用途。这一结果确实是出人意料的，因为在文献中，例如在Cell Biol. Int. 2003,27,779-84中，Isnard N.等人描述硫酸皮肤素活化MMP_2和MMP-9的表达。SDX-DS的惊奇性质已通过将其与商业硫酸皮肤素相比较而得以证实，并且结果显示于实施例2-9中。该证据使得舒洛地昔确实成为用于治疗其中涉及MMP的所有病变的独特的化合物，与可用市售的低分子量肝素和硫酸皮肤素制备的任何其他糖胺聚糖不同。本发明的另一方面是从舒洛地昔分离的SDX-DS。本发明的另一方面是从舒洛地昔分离的SDX-HEP。本发明的另一特别的方面是通过纯化方法，诸如用AT III功能化介质的亲合色谱，从舒洛地昔获得的硫酸皮肤素。本发明的另一特别的方面是通过纯化方法，诸如用AT III功能化介质的亲合色谱，从舒洛地昔获得的低分子量肝素。本发明的另一方面是包含SDX-DS或SDX-HEP的药物组合物，及它们作为药物的用途。
发明详述本发明的目标是舒洛地昔，或从舒洛地昔分离的组分之一，尤其是SDX-DS或SDX-HEP,以及它们用于其中涉及MMP的所有病变的药物的用途。具体地，本发明描述了舒洛地昔或SDX-DS或SDX-HEP用于降低和/或抑制循环MMP、尤其是可诱导形式的明胶酶MMP-9，并由此降低血液中循环MMP浓度的用途。分离的组分可以自身或以其混合物作为药物。舒洛地昔作为可从市场上获得药物以商标VESSEL 2 存在，并且其通过口服途径、肌内或静脉内注射施用，用于治疗具有血栓风险的血管病变，诸如周围动脉疾病、静脉炎后综合症，用于治疗肾病中的蛋白尿，如Harenberg J.在Med. Res. Rev. 18 (1998)，l_20eTamarin R.在 MedicalPraxis 8 (1997), I 中所描述。在本文中，舒洛地昔及其衍生物，尤其是SDX-DS和SDX-HEP，也意欲包括它们的可 药用盐、溶剂化物、水合物以及包合物。本发明的一个重要方面是确定用于抑制/降低MMP-9的舒洛地昔，MMP-9也称为明胶酶B，其参与静脉松弛、静脉曲张、慢性静脉功能不全(CVI)以及下肢溃疡。舒洛地昔或SDX-DS或SDX-HEP可在以可诱导的MMP-9的升高为特征的所有病变中用作活性组分，而对组成型MMP-2没有任何作用。舒洛地昔或其组分的优点是能够通过口服或注射途径(肌内或静脉内)施用。舒洛地昔和其组分的另一优点是能够以高剂量施用而没有副作用，如在EP1292315中所描述，其被良好地耐受至高达IOOOmg/天，以及更高。本发明描述了舒洛地昔或SDX-DS或SDX-HEP用于降低和/或抑制MMP尤其是MMP-9(明胶酶 B, EC3. 4. 24. 35di 92，130e 225kDa)浓度的新用途。本发明描述了舒洛地昔或其组分之一，尤其是SDX-DS和SDX-HEP，其用于以超过20%的量抑制或降低MMP、尤其是MMP-9。本发明描述了足以降低和/或抑制MMP-9从血液细胞中释放至血浆循环，并由此降低静脉器官中循环MMP活性以及减少静脉壁中原位酶活性的舒洛地昔或SDX-DS或SDX-HEP的量。此类效果在体外和离体情况下在8 μ g/ml至12 μ g/ml范围的舒洛地昔浓度下产生。这些浓度相应于通过静脉内、肌内或口服途径以20mg至高达IOOOmg/天的剂量施用而在血液中能够达到的治疗上可接受的剂量。舒洛地昔、SDX-DS、SDX-HEP以所述的浓度对MMP的作用已在离体实验中在生物样品上得以证实。具体而言，从50个健康志愿者(男和女)中收集血液样品。该样品，经处理得到的相应血浆和血清样品，在添加或不添加各种浓度的舒洛地昔SDX-DS和SDX-HEP情况下进行分析。本发明还描述了以约20%重量的浓度包含在舒洛地昔中的SDX-DS，以约80%的浓度包含的SDX-HEP，获得它们的方法，以及作为药物及用于治疗其中涉及MMP的所有病变的用途。SDX-DS和SDX-HEP可通过纯化和提取方法获得。具体地，实施例I描述了通过亲合色谱纯化从舒洛地昔获得SDX-DS及SDX-HEP的方法，其中肝素级分(fraction)被吸附至用AT III官能化的固定相中，而皮肤素级分收集在未吸附流出液(flow through)中。实施例2描述了向全血中添加递增量的舒洛地昔至约10 μ g/ml-约50 μ g/ml的终浓度以及添加约O至约10 μ g/ml终浓度的从舒洛地昔提取的SDX-DS的作用。离心后，从全血样品中收集血清，并通过明胶-酶谱法分析，如Mannello F.等人在Clin. Chem. 2003,49，339-34中所描述。为标准化不同样品中的MMP活性，将样品体积调节至相同的总蛋白量。表2显示了明胶-酶谱法的密度计结果，其中将没有添加舒洛地昔或MMP抑制剂的血清样品的MMP面积赋值为100%，并计算存在舒洛地昔及SDX-DS的MMP面积的减少。观察到在相应于约10 μ g/ml的舒洛地昔浓度下相应于MMP-9的条带面积减少至少约20%，以及相应于约50 μ g/ml的舒洛地昔浓度下小于约十分之一。MMP-2浓度没有受到添加舒洛地昔的影响。结果显示，向全血样品中添加舒洛地昔至约10 μ g/ml至约50 μ g/ml的终浓度在相应的血清样品中并以成比例的方式减少了循环MMP浓度，尤其是MMP-9，而MMP-2浓度保持不变。表2还报告了用SDX-DS处理的样品的密度计结果，其中在相应于约2. 5 μ g/ml的浓度下与MMP-9相关的条带面积减少了至少约20%，而在约10 μ g/ml的终浓度下减少至少 约 60%。从这些结果可推断出，包含在舒洛地昔中的SDX-DS的存在促进了 MMP的降低/抑制的效果，并且这些结果使得舒洛地昔为糖胺聚糖之中独特的活性成分。这些数据还得到了用试剂Ι β丨otrak MMPS Amersham进行的定量Elisa分析的确认，所述分析以相应于O. 37-0. 25 μ g/ml的检测极限(LOD)识别明胶酶的前MMP。表3证实了浓度为约25 μ g/ml的舒洛地昔减少了与MMP-9相关的条带的至少约20%的面积，以及约50 μ g/ml的浓度减少至少约60%。添加如实施例I中获得的SDX-DS，在约2. 5 μ g/ml的浓度下减少至少约20%的量的MMP，以及在约10 μ g/ml的浓度下减少至少约60%。舒洛地昔还作用于由血小板和白细胞释放的MMP的减少，这在实施例3中得以证实，其中将舒洛地昔添加至已通过离心移除全血中的细胞组分后的血浆样品中。实施例3报告了涉及添加舒洛地昔至血液样品中的结果，所述血液样品收集自平均年龄为37岁的50名健康志愿者，预先用I至10%体积的O. 13M柠檬酸钠处理，然后离心。向样品上清液中加入约10 μ g/ml至50 μ g/ml终浓度的舒洛地昔。如实施例2所述那样通过明胶酶谱法对样品进行分析。给没有任何添加的血清样品(对照)的条带赋予相应于100%的值，并确定针对血清样品中递增舒洛地昔量的比例面积减少。观察到与MMP-9蛋白水解活性相关的明胶消化的清晰条带在添加舒洛地昔后保持不变，如实施例3的表4所报告的那样，并且这一结果证实了一旦MMP已经释放至血浆中，则舒洛地昔不会干扰该酶的活性。当如实施例4报道的那样将舒洛地昔添加至血清样品时，得到了相似的结果，在实施例4中添加了递增量的舒洛地昔。具体而言，实施例4描述了将约10μ g/ml至约50 μ g/ml的递增量的舒洛地昔添加至血清样品的作用，所述血清是在将收集自50名健康志愿者(平均年龄37岁)的血液样品离心后得到的。在如实施例2所描述的酶谱法中分析得到的血清样品。表5报告了与MMP-2和MMP-9明胶分解条带相关的明胶分解面积的相对密度值，其中没有观察到相对于未添加舒洛地昔的样品条带而言的减少。具体而言，从实施例2获得的结果证实舒洛地昔以及舒洛地昔中包含的SDX-DS通过选择性地作用于MMP-9的可诱导形式的作用机制阻止了血液中MMP的升高并降低血液中的MMP，由此鉴定了可能的治疗用途，用于治疗其中MMP-9的存在直接或间接与疾病进程相关的所有病变。实施例5报告了舒洛地昔、帕肝素和从舒洛地昔中提取的SDX-DS对血清中存在的MMP的作用比较。如实施例2那样处理从健康志愿者中收集的全血样品，一组样品用约25 μ g/ml终浓度的舒洛地昔处理，一组用约5 μ g/ml终浓度的硫酸皮肤素处理，以及一组用约20 μ g/ml终浓度的低分子量肝素(帕肝素)处理。表8和表9分别报告了在酶谱法和Elisa中获得的结果，其中相对于没有任何添加的对照样品，舒洛地昔显示了 50%至70%的MMP-9降低、帕肝素的为约20%至30%以及SDX-DS的为约50%至70%。舒洛地昔在MMP释放中的独特特性归因于构成舒洛地昔的GAG的天然混合物。实施例6提供了与市售的两种不同的硫酸皮肤素相比较，SDX-DS减少MMP的特性的证据。在5 μ g/ml的相同浓度下，SDX-DS导致超过50%的MMP-9减少，而两种市售硫酸皮肤素(Sigma和Calbiochem)导致低于10%的减少。 发现SDX-DS减少MMP，尤其是MMP-9，至少比市售DS制备物高三倍。实施例7证实了 SDX-HEP也具有独特特性，实际上，包含在舒洛地昔中的低分子量肝素和硫酸皮肤素的混合物与通过将帕肝素添加至市售硫酸皮肤素及SDX-DS而制备的合成的混合物作用不同。更具体地，将舒洛地昔与低分子量肝素及硫酸皮肤素的混合物相比较，所述混合物中低分子量肝素与硫酸皮肤素约以舒洛地昔中存在的相同比例即约80%帕肝素及约20%硫酸皮肤素混合。表11中报告的数据表明舒洛地昔显示出比帕肝素/DS混合物及帕肝素/SDX-DS混合物显著更高的抑制百分比。具体地，观察到舒洛地昔就混合物肝素/SDX-DS而言具有更高的活性，这证实了包含在舒洛地昔中的肝素组分也具有影响循环MMP水平的独特特性。还在作为静脉内壁的生物样品上证实了舒洛地昔对MMP的能力。静脉内壁尤其重要，因为这是MMP的作用位点，从而引起与细胞外基质的蛋白水解重塑相关的多种病变。实施例8显示了在免疫组织化学实验中，舒洛地昔、SDX-DS、帕肝素对静脉壁上的MMP的作用比较。这一实验证实了舒洛地昔和SDX-DS在其中涉及MMP的所有病变中的作用，并且尤其是在降低和/或抑制MMP表达浓度中的作用。将分别约25、5及20 μ g/ml浓度的舒洛地昔、SDX-DS、帕肝素添加至人隐静脉片段，所述隐静脉片段从进行静脉曲张的隐静脉切除术的10名健康妇女(平均年龄42岁)经手术获得。在恰当的组织包含后，用单克隆抗体抗MMP-9温育约5 μ m厚的系列片段，并在用生物素化二抗温育后，根据标准方法通过过氧化物酶反应检测复合物。根据标准方法，通过用抗生物素蛋白-过氧化物酶检测温育后的复合物。与对照及肝素处理的样品相比，用舒洛地昔处理的组织样品显示染色面积的表面减少，证实了 MMP的更低的局部浓度。表12证实，当给未作任何添加的样品赋予相应于100的值时，约25 μ g/ml浓度的舒洛地昔降低了 MMP-9染色面积的强度，相应于约60% ;约5 μ g/ml浓度的SDX-DS将强度减少了约70%，而约20μ g/ml浓度的帕肝素未降低MMP-9的强度。这些舒洛地昔以及SDX-DS的体外结果可转移至体内应用并且可应用于在涉及MMP的所有病变中降低MMP。实施例9通过原位酶谱法(细胞化学)显示了舒洛地昔、SDX-DS和帕肝素对静脉壁上的MMP的作用。将分别约25、5及20 μ g/ml浓度的舒洛地昔、SDX-DS和帕肝素添加至人隐静脉片段，所述隐静脉片段从进行静脉曲张的隐静脉切除术的10名健康妇女(平均年龄42岁)经手术获得。在该处理后，用荧光 明胶底物温育静脉片段，并且通过比较530nm下静脉部分的显微镜照片观察蛋白水解活性。在这些实验中，荧光水平与组织上的MMP活性成比例，并且原位酶谱法的结果显不于表13中。表13证实，当将未作任何添加的样品赋予相应于100的值时，约25 μ g/ml浓度的舒洛地昔将MMP-9的强度降低约50% ;约5 μ g/ml浓度的SDX-DS将MMP-9强度减少约80%,而约20 μ g/ml浓度的帕肝素将MMP-9强度减少约40%。舒洛地昔、SDX-DS和SDX-HEP在静脉组织上的降低和/或抑制作用可扩展至其中涉及MMP的所有组织。例如，舒洛地昔、SDX-DS和SDX-HEP可用于治疗肠溃疡以及其他可归因于MMP的损伤，而没有任何限制。为获得降低MMP、尤其是MMP-9的体内有效浓度，舒洛地昔可通过静脉内途径施用，注射I至4小瓶含有约60mg/ml舒洛地昔及可药用赋形剂的溶液。备选地，舒洛地昔可通过肌内或口服途径以治疗剂量的等价剂量施用。在后者情形下，可施用达IOOOmg/天及更高的剂量，不会有任何副作用，如EP 1292315所描述。舒洛地昔降低循环MMP的特性以及尤其是对MMP-9的选择性作用是未知的以及预料不到的作用，尤其是可用于其中涉及MMP(并且尤其是MMP-9)的所有病变，诸如血管疾病、慢性静脉功能不全(CVI)、静脉曲张、静脉性溃疡、肺病、肿瘤的增长和进展、原发肿瘤的生长、血管形成、肿瘤细胞的外渗和内渗。所报道的非限制性实验证实了舒洛地昔、SDX-DS和舒洛地昔的肝素级分用于降低/抑制由白细胞和血小板释放的MMP (尤其是MMP-9)的释放以及抑制静脉内壁中MMP值的新用途。借助药物组合物可将所述离体结果完全转化为舒洛地昔SDX-DS和舒洛地昔的肝素级分的体内用途，所述药物组合物包含约20至IOOOmg及更高的舒洛地昔；约4mg至约200mg及更高的SDX-DS ;约16至约700及更高的SDX-HEP。此外，舒洛地昔、SDX-DS和SDX-HEP的施用可通过注射途径(肌内和/或静脉内)、或口服途径施用，没有任何限制。活性成分舒洛地昔、SDX-DS和SDX-HEP的剂量可很大地改变，取决于施用模式、患者年龄、体重和患者的一般状况，以及疾病的严重程度，并且可通过标准技术确定。此外，可任选地应用体外和动物测试来帮助确定最佳剂量范围。优选地，该药物组合物是可用于口服施用的形式。本发明中的舒洛地昔、SDX-DS和舒洛地昔的肝素级分可包含在片剂、胶囊齐U、颗粒剂、混悬剂、溶液剂或气雾剂形式的组合物中。口服药物组合物可提供受控释放。口服药物组合物可提供生物粘附特性，以增加粘膜粘着性。
用于口服制剂的赋形剂选自ligants、助流剂、崩解剂、稀释剂、天然剂中的一种或多种。用于口服应用的赋形剂可包括崩解剂、稀释剂及其组合。崩解剂可选自交聚维酮、淀粉羟乙酸钠、玉米淀粉、纤维素衍生物及其组合。稀释剂可选自乳糖、甘露醇、木糖醇、微晶纤维素、糖、糊精、亲水碳水化合物及其组合。口服药物形式可包含生物粘附性赋形剂。片剂可进一步包含包衣，其包含羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、糊精、麦芽糖糊精、基于聚醋酸乙烯酯的化合物、羟丙基纤维素、醋酸纤维素、邻苯二甲酸纤维素(cellulos印htalate)、其衍生物、或其组合。口服形式还可包含矫味剂、着色剂或增甜剂。与已知的和已研究的用于降低/抑制MMP的受控释放的化合物相比，包含舒洛地昔或SDX-DS及SDX-HEP的药物组合物提供了许多优势且解决许多问题，诸如对MMP-9的专
本发明涉及与市售舒洛地昔用于预防具有血栓形成风险的血管疾病的用途不同的新治疗用途。在药物实践中，舒洛地昔、SDX-DS及SDX-HEP可应用本领域技术人员公知的常规技术与可接受的赋形剂组合。组合物可以以单剂量或多剂量、一天一次或多次以受控释放组合物施用。现有技术描述了舒洛地昔在与糖尿病相关的病变中的用途，诸如糖尿病肾病，但直到现在，在本发明之后，才使得舒洛地昔具有新药物用途成为可能。本发明的目标还有包含SDX-DS和SDX-HEP的药物组合物，其可用于治疗其中涉及MMP尤其是MMP-9的所有病变，而没有任何限制。本发明的特别方面是用于治疗其中涉及静脉松弛的病变例如静脉曲张形成、慢性静脉功能不全、胃肠溃疡、肺病以及肿瘤病变的上述用途。本发明的另一特别且重要的方面是从舒洛地昔分离的SDX-DS，及其在体外和体内抑制和/或降低MMP释放的用途。本发明的另一方面是用纯化方法从舒洛地昔获得的SDX-DS。另一特别方面是应用AT III官能化的柱子用亲合色谱的SDX-DS。分离SDX-DS的方法包括以下步骤a)以5至10mg/ml凝胶的浓度用AT III制备亲合色谱柱；b)在包含TRIS 50mM、Na Cl 50mM,pH 7. 4的缓冲液中以O. I至5mg/ml凝胶的浓度将舒洛地昔上样至步骤a)的所述柱上；c)收集洗出的在未吸附级分中的硫酸皮肤素级分且任选冻干所述收集的硫酸皮肤素；d)任选地将所述硫酸皮肤素转化为其可药用盐、溶剂化物、水合物、包含物。本发明的另一方面是用纯化方法从舒洛地昔获得的SDX-HEP。另一特别方面是应用AT III官能化的柱子用亲合色谱的SDX-HEP。分离SDX-HEP的方法包括以下步骤a)以5至10mg/ml凝胶的浓度用AT III制备亲合色谱柱；b)在包含TRIS 50mM、Na Cl 50mM,pH 7. 4的缓冲液中以O. I至5mg/ml凝胶的浓度上样舒洛地昔；c)用包含TRIS 50mM、NaCl 3M、pH 7. 4的缓冲溶液从所述色谱柱洗脱低分子量肝素；d)收集洗出的低分子量肝素级分且任选冻干所述收集的肝素；e)任选地将所述低分子量转化为其可药用盐、溶剂化物、水合物、包含物。本发明的另一特别且重要的方面是SDX-HEP，及其在体外和体内抑制和/或降低MMP释放的用途。另一方面是包含舒洛地昔的药物组合物，其为固体形式、混悬剂、颗粒剂、气雾剂，用于治疗其中涉及MMP且需要降低MMP的病变。
另一方面是包含药物组合物的试剂盒，其中所述药物组合物包含舒洛地昔、SDX-DS 和 SDX-HEP。另一方面是包含适于施用至少约5mg/天剂量的舒洛地昔或其组分之一(尤其是SDX-DS或SDX-HEP或其混合物)的药物组合物的用途。日剂量的实例是5至IOOOmg/天、15至800mg/天、50至200mg/天、20至IOOOmg/天或更高,一次或多次施用，没有任何限制。优选的SDX-DS的日剂量是I至300mg或更高，尤其是4至300mg，一次或多次施用，没有任何限制。优选的SDX-HEP的日剂量是16至900mg或更高，尤其是19至800mg，一次或多次施用，没有任何限制。包含舒洛地昔、SDX-DS和SDX-HEP的药物组合物可施用给接受伴随治疗的患者，没有任何副作用。本发明描述的舒洛地昔、SDX-DS和SDX-HEP的用途应当被认为是新的医药用途，用于治疗其中涉及MMP且要求降低和/或抑制MMP的所有病变。与之前本领域所研究的化合物相比，舒洛地昔、SDX-DS和舒洛地昔的肝素级分的用途克服了许多且重要的问题，诸如对MMP-9的特异选择性，顺从性以及容易施用。以下实施例详细地显示了本发明，所述实施例不应认为是对本发明的限制。MM图I :舒洛地昔的凝胶渗透图。图2 :从舒洛地昔获得的硫酸皮肤素的凝胶渗透图。图3 :从舒洛地昔获得的肝素的凝胶渗透图。实施例I从舒洛地昔获得硫酸皮肤素级分的方法将相应于8mg的一定量的从动物肠粘膜提取的舒洛地昔溶解于由TRIS 50mM和NaCl 50mM构成的结合缓冲液(pH 7.4)中，并将其上样至通过偶联7. 5mg ATI I I/mlCNBr-活化的Sepharose凝胶(GE)从而制备的亲合柱上。用相同的缓冲溶液洗涤柱子，并用由TRIS 50mM、NaCl 3M组成的、pH 7. 4的缓冲溶液洗脱吸附的物质。在流出液中存在的未吸附物质中收集硫酸皮肤素级分，而肝素级分则在洗脱级分中收集。硫酸皮肤素和肝素级分可储存于-20°C，或任选地冻干。
在凝胶渗透色谱(GPC)和在琼脂糖凝胶中分析所收集的肝素级分和收集的硫酸皮肤素级分。在装备有GPC 柱 TSK 凝胶，G2000SWXL (7. 8X 300mm)的 HPLC 系统 HP 1090 中获得色谱图，用Na2SO4O. 2M, pH 5以相应于O. 2ml/分钟的流速洗脱，并用Refraction Index检测器检测。图I显示了上样至亲合色谱中的舒洛地昔的色谱图，其具有宽的色谱GPC曲线，在相应于30分钟的RT处具有最大尖峰。图2显示了亲合色谱流出液(flow-through)中存在的硫酸皮肤素级分,其在约27分钟的RT处具有最大的较短峰。图3显示了通过亲合色谱洗脱的肝素级分，特征为宽峰。通过将琼脂糖以0.6% (w/v)的浓度溶解于醋酸钡缓冲液O. 04M pH 5.8中获得琼 脂糖凝胶分析。将温热溶液置于具有约7. 5cm X 4. 5cm尺寸的玻璃板上，并将包含少量染料甲酚红的浓度约为10mg/ml的舒洛地昔、SDX-DS和SDX-HEP上样至该琼脂糖凝胶上。以两个步骤进行电泳分离第一步在醋酸钡缓冲液O. 04M pH 5. 8中，100V电泳约25分钟，以及第二步在1，3-二氨基丙烷0.0511，？!1 9中，IlOV电泳约30-40分钟。然后将该板投入由氯化十六烷基吡啶O. 1% (w/v)水溶液组成的固定溶液中约3小时。温风下将板干燥后，将其投入由Tolnidine Blue的0.1% (w/v)乙醇/水/乙酸50 : 50 : l(v/v/v)溶液组成的染色溶液中，在没有染料的相同溶液中脱色，并在温风下干燥。舒洛地昔、其分离的组分SDX-DS和SDX-HEP以及商购硫酸皮肤素的相对运动性(Rf)显不于表I。表I
组分 (pg/ml)__Rf_ 舒洛地昔0.86 0.75...........
硫酸皮肤素级分(SDX-DS)__0.84___肝素级分(SDX-DS)_____0.75商购疏酸皮肤素(Sigma)__0.86实施例2舒洛地昔对血液样品中的循环MMP的作用从50名健康志愿者(25名女性、25名男性，年龄为25至58岁，平均年龄37岁)收集血液样品，将其置于试管中并制备两组样品；向第一组添加不同量的舒洛地昔，直到获得相应于0、12、24、48μ g/ml的终浓度，向第二组添加不同量的实施例I获得的皮肤素，达到相应于O、2. 5、5和10 μ g/ml的终浓度。将没有添加舒洛地昔和皮肤素的样品用作对照，并将这些样品的MMP条带标记为100%的强度任意值。将经处理的样品的MMP条带强度报告为相对于未处理样品的百分比。在4°C下、1550g离心总样品10分钟,通过酶谱法_明胶分析相应于150 μ g总蛋白(通过Bradford方法确定)量的血清样品(S)上清液。将样品上样至凝胶酶谱法中，并在非还原条件下将电泳分离与MMP标准品相比较，其中所述MMP标准品通过将来自健康志愿者的毛细血管血用15体积的Laemmli U. K缓冲液(Nature，227 (1970)，680-685)稀释而制得。通过在含有O. 2% (p/v)的分离自猪(swine cute)的明胶(Type A 90Bloom,Sigma)的7. 5% (p/v)聚丙烯酰胺制备在明胶中的酶谱。在35mA下电泳75分钟，用2. 5% (v/v)浓度的Triton X-100溶液洗涤凝胶，并在由 50mM Tris-HCl(pH 7. 5)、5mM CaCl2UOOmM NaCl、ImMZnCl2、0，3mM NaN3>O. 02% (p/v)洗涤剂.Brij -35e 0. 25% (v/v) di TritonX-100构成的溶液中于37°C温育24小时。通过用O. 2% (p/v)浓度的考马斯亮蓝R-250染色，并随后用体积比为80/20的甲醇-乙酸溶液漂洗，从而原位检测明胶酶活性。舒洛地昔以及在实施例I中获得的SDX-DS仅对与MMP-9相关的条带起作用，而 MMP-2的条带强度相对于对照保持不变并且赋予100%的值。用带有图像分析仪的密度计计算面积。表I报道了有或没有舒洛地昔、有或没有皮肤素级分的血清样品中与MMP-9相关的明胶分解消化的面积百分比。表2明胶-酶谱法在用舒洛地昔和实施例I中获得的硫酸皮肤素处理后血清MMP-9的浓度
減P—II实施例1中获#兩"]
^ , f面积％疏酸皮肤素面积％
_/ml)__MMP-9__(jLtg/ml)__MMP-9
0100 士 7 _0_ 100 ±7
12 ^ 57 ±42.546 ±3 —
口 24_ 41 ±5530 ±7
~48~7士 I10丨 4±7还在Elisa中确定样品中的MMP-9浓度，所述Elisa用于应用BiotrakMMPs测试(Amersham)测量金属蛋白酶的酶活性，所述Biotrak MMPs测试识别明胶酶的前-MMP形式，对MMP-9和MMP-2具有O. 37-0. 25 μ g/L的L0D，获得的结果显示于表2中。Elisa结果显示出与酶谱法所见明胶分解活性没有统计学显著差异。表3Elisa测试法在用舒洛地昔和实施例I中获得的硫酸皮肤素处理后血清MMP的浓度
权利要求
1.用于治疗其中涉及基质金属蛋白酶(MMP)的病变的舒洛地昔，或其组分之一，或其混合物，或其可药用盐、溶剂化物、水合物以及包合物。
2.根据权利要求I的舒洛地昔，其中所述组分是硫酸皮肤素。
3.根据权利要求I的舒洛地昔，其中所述组分是低分子量肝素。
4.根据权利要求1-3任一项的舒洛地昔，其中所述MMP是MMP-9。
5.根据权利要求1-4任一项的舒洛地昔，其中所述病变是感染或肿瘤疾病。
6.根据权利要求1-4任一项的舒洛地昔，其中所述病变选自血管疾病、胃肠溃疡、由糖尿病引起的心血管疾病、炎症的发病、静脉松弛、肿瘤的增长和进展、原发肿瘤的生长、血管发生、肿瘤细胞的外渗和内渗，及其组合。
7.根据权利要求6的舒洛地昔，其中所述血管疾病选自慢性静脉功能不全(CVI)、静脉曲张、心肌梗死之后的心脏损伤、腹主动脉瘤。
8.根据权利要求I的舒洛地昔，其用于以超过20%的量抑制或降低MMP。
9.根据权利要求8的舒洛地昔，其用于以超过20%的量抑制或降低MMP-9。
10.由舒洛地昔获得的硫酸皮肤素和低分子量肝素。
11.获得权利要求10的硫酸皮肤素的方法，其包括以下步骤 a)以5至10mg/ml凝胶的浓度用ATIII制备亲合色谱柱； b)在包含TRIS50mM、Na Cl 50mM、pH 7. 4的缓冲液中以O. I至5mg/ml凝胶的浓度将舒洛地昔上样至步骤a)的所述柱上； c)收集洗出的在未吸附级分中的硫酸皮肤素级分且任选冻干所述收集的硫酸皮肤素； d)任选地将所述硫酸皮肤素转化为其可药用盐、溶剂化物、水合物、包含物。
12.获得权利要求10的低分子量肝素的方法，其包括以下步骤 a)以5至10mg/ml凝胶的浓度用ATIII制备亲合色谱柱； b)在包含TRIS50mM、Na Cl 50mM、pH 7. 4的缓冲液中以O. I至5mg/ml凝胶的浓度上样舒洛地昔； c)用包含TRIS50mM、NaCl 3M、pH 7. 4的缓冲溶液从所述色谱柱洗脱低分子量肝素； d)收集洗脱的低分子量肝素级分且任选冻干所述收集的肝素； e)任选地将所述低分子量转化为其可药用盐、溶剂化物、水合物、包含物。
13.权利要求10或11的硫酸皮肤素，其用作药物。
14.权利要求10或12的低分子量肝素，其用作药物。
15.药物组合物，其包含与至少一种可药用赋形剂和/或载体混合的权利要求10的硫酸皮肤素和/或低分子量肝素。
16.根据权利要求15的药物组合物，其以适于施用约5至200mg/天或更高的剂量包含所述硫酸皮肤素和/或低分子量肝素。
17.根据权利要求15的药物组合物，其以适于施用至少约5mg/天的剂量包含所述硫酸皮肤素和/或低分子量肝素。
18.根据权利要求16的药物组合物，其以适于在体外或体内以至少10%的量降低MMP水平的剂量包含所述硫酸皮肤素和/或低分子量肝素。
19.根据权利要求15-18任一项的药物组合物，其用于口服、肠胃外或静脉内施用。
20.根据权利要求15-19任一项的药物组合物，其为片剂、胶囊、丸剂、糯米纸囊剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、气雾剂。
21.根据权利要求20的药物组合物，其中所述赋形剂包括一种或多种ligants、稀释剂、助流剂、结合剂、生物粘附剂、缓冲剂以及任选的着色剂和矫味剂。
22.根据权利要求15-21任一项的药物组合物，其中所述硫酸皮肤素的量为约I至300mgo
23.根据权利要求15-21任一项的药物组合物，其中所述低分子量肝素的量为约19至900mgo
24.根据权利要求15-23任一项的药物组合物，其与其它药物组合。
全文摘要
本发明描述了用于降低循环基质金属蛋白酶(MMP)尤其是MMP-9的舒洛地昔或其至少一种组分。舒洛地昔及其组合物可用于治疗其中涉及MMP的病变，诸如心血管疾病、由糖尿病引起的心血管疾病、静脉曲张、慢性静脉功能不全(CVI)、胃肠溃疡、肺病以及肿瘤病变。
文档编号A61K31/726GK102883728SQ201180020126
公开日2013年1月16日 申请日期2011年4月20日 优先权日2010年4月23日
发明者G·C·维斯科米, F·曼尼罗, C·布鲁诺 申请人:意大利阿尔法韦士曼制药公司