诱导保护性抗hiv-1抗体的产生的方法

专利名称：诱导保护性抗hiv-1抗体的产生的方法
技术领域：
本发明大体上涉及用于HIV-I接种疫苗的免疫原，具体地涉及通过使用非HIV-I免疫原和HIV-I免疫原的组合来靶向B细胞生殖系和克隆中间体以诱导保护性抗HIV-I抗体的产生的方法。本发明还涉及适用于这种方法的组合物。
背景技术：
对传输/首建(transmitted/founder)HIV-I包膜的初次抗体应答是非中和的,其革巴向Env gp41,并发生在血衆病毒血症出现后的平均13天(Tomaras等人，J. Virology 82:12449-63(2008))。虽然与初次抗体应答同时发生的对HIV-I的初次T细胞应答驱动了在HIV-I的T细胞表位内的突变，但是对HIV-I的初次gp41抗体应答则不是这样。相反，它是自体同源的中和抗体应答，其被延迟到传输之后的大约3个月，这是与抗体逃避突变体有关的初次中和抗体应答(McMichael 等人，Nature Rev. Tmmunol. 10 :11-23 (2010))。结合至罕见的广泛反应性中和抗体的HIV-I包膜上的四个表位是⑶4连接位点(CD4BS) (mab (单克隆抗体)IgGlbl2) (Zwick 等人，J. Virol. 77 (10) :5863-5876 (2003))、由Amab 2F5和4E10定义的近膜端外部区(MPER)表位(Armbruster等人，J. Antimicrob.Chemother. 54 :915-920(2004) ；Stiegler 和 Katinger, J.Antimicrob. Chemother. 51 757-759(2003) ；Zwick 等人，Journal of Virology 79:1252-1261(2005) ；Purtscher等人，AIDS 10 :587(1996)),以及由人mab 2G12定义的甘露聚糖表位(Scanlan等人，Adv. Exper. Med. Biol. 535 :205-218 (2003))。这四个罕见的人mab都是与众不同的两个是IgG3 (2F5和4E10)，一个具有独特的Ig 二聚体结构(2G12)，一个具有非常疏水的CDR3 (2F5) (Ofek 等人，J. Virol. 198 :10724 (2004))，并且在这四个中，CDR3 非常长(Burton等人，Nature Immunol. 5 (3) :233-236(2004) ;Kunert 等人，AIDS Res. Hum. Retroviruses20(7) :755-762(2004) ；Zwick 等人，J. Virol. 78(6) :3155-3161(2004) ；Cardoso 等人，Immunity 22 :163-172 (2005))。其中，2F5和4E10样人mab是非常罕见的。急性HIV-1患者不会对MPER或2G12表位产生抗体，MPER可定义为HIV包膜的氨基酸652-683 (Cardoso等人，Immunity 22 163-173 (2005))(例如见 QQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIK)。CD4 结合位点(BS)抗体一般在HIV-I感染的早期形成，但是这些抗体通常不具有由mab IgGlbl2显不的广谱中和(Burton 等人，Nat. Immunol. 5(3) :233-236 (2004))。为了理解对HIV-I包膜(Env)的无效初次抗体应答的致病机理，已实施PCR来扩增源于单血细胞或骨髓浆细胞的重链和轻链(V1^PVJ基因的免疫球蛋白可变区，所述细胞取自HIV-I传输之后17-30天的5个急性感染的主体。已经测定由HIV-I感染所诱导的浆细胞应答的特异性。已经使用由所传输的HIV-I诱导的单人浆细胞的Vh和\基因的PCR扩增来对HIV-I的初始浆细胞/浆母细胞应答进行了研究。已经发现，对HIV-I的初次抗体应答被诱导至HIV-I Env gp41，而该gp41在已预先存在的记忆B细胞克隆中诱导抗体应答，产生与众多宿主和细菌分子、尤其是人类肠道菌群交叉反应的低亲和性、多反应性的抗Env抗体。本发明至少部分地源于针对鉴定初次抗HIV-I Env gp41抗体和罕见的广泛中和抗体的来源而设计的研究。本发明还源于在大多数温血脊椎动物中表达的细胞蛋白的鉴定，所述细胞蛋白在结构上与HIV-I gp41 MPER的表位2F5相似，也可能与4E10相似。本发明提供了一种HIV-I疫苗，其设计用来靶向可被驱使产生针对HIV-I的广泛中和抗体的初始B细胞池
发明内容
·本发明大体上涉及用于HIV-I接种疫苗的免疫原。本发明更具体地涉及通过使用非HIV-I免疫原和HIV-I免疫原的组合来靶向B细胞生殖系和克隆中间体以诱导保护性抗HIV-I抗体的产生的方法。本发明还涉及适用于这种方法的组合物。从以下的说明中可以清楚本发明的目的和优点。


图I :针对Hl所罗门群岛血凝素的典型流行性感冒抗体克隆；图2 :在HIV-I传输 20天后患者684_6中的浆细胞抗体谱系；图3 :所推断的中间体克隆抗体的产生；图4 :检测所推断的生殖系和克隆成员中间体与支系B gp41、自体同源的gpl40和M组共有序列gpl40的反应性，以便测定在克隆发展中在何处获得与gp41的反应。图5 :在第二中间体前体抗体处获得的克隆684-6B的反应性(也见于图4)；图6:以mg的量生产并用于分析与gp41结合的抗体的解离常数(Kd)的其他所推断的中间体抗体克隆；图7 :在患者684-6克隆684-6B生殖系和所推断的中间体抗体中的gp41反应性的获得；图8 6846克隆52生殖系和所推断的中间体gp41抗体的多反应性；图9 :需氧肠道菌群与克隆684-6B抗体的反应性；图IOA和IOB :肠道提取物相对Mojo抗体的蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(BN-PAGE)和蛋白质印迹的图；图IOA是考马斯蓝图，图IOB是蛋白质印迹图；图11 :肠道提取物相对Mojo抗体一非还原性相对HV00276的蛋白质印迹图；图12 :肠道提取物相对Mojo抗体一还原性对HV00276的蛋白质印迹图；图13A和13B : Ib12生殖系抗体结合至脂质(PC: CL脂质体)；图13A为结合至HIV89. 6 gpl20，图13B为结合至脂质(PC:心磷脂);图14 :表达4E10 Vh的B细胞的一大片段在4E10 Vh敲入小鼠的骨髓中在前B至未成熟B细胞阶段中缺失；图15 :诱导广泛中和抗体的两个障碍。第一个障碍是，目前设计用于刺激可产生罕见的广泛中和抗体的B细胞的疫苗不与需要对免疫原应答的初始B细胞的生殖系B细胞受体反应。虽然对HIV-I Env的初次B细胞应答发生在感染后的初期，但是存在gp41与宿主或预先存在的外来分子之间的交叉反应性，使得产生初次gp41抗体应答的B细胞抗体克隆由预先存在的多反应性天然B细胞克隆衍生而来，所述多反应性天然B细胞克隆的生殖系也不与gp41反应，而其与gP41的反应性之后在克隆抗体发展中获得，这是因为与gp41的交叉反应性通过宿主或外来抗原驱动的克隆扩增来获得。一旦获得gp41反应性，gp41就驱使克隆扩增。对疫苗发展的第二个障碍来自于这样的工作，其显示了这些抗体需要具有脂质反应性以进行中和的长的疏水性CDR3(Alam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 20234-9 (2009))，并且2F5和4E10 Vhs具有足够的自身反应性来促进敲入老小鼠中的缺失(Verkoczy 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 181-186 (2010))。 图16A-16F :诱导广泛中和抗体的策略。在图16A中，疫苗必须设计成通过包含结合至多反应性初始B细胞受体(BCR)的宿主(如脂质)和/或外来(如肠道菌群)抗原以刺激B细胞前体(最左箭头)，并通过包含抗原(优选Env构建体)以靶向会引起与Env的交叉反应的B细胞的中间体克隆。用于疫苗的这种成分的Env领先候选物是与支系B JRFLgpl40 Env混合的Malawi 1086支系C gpl40低聚物,其在豚小鼠中诱导了相当大广度的中和抗体，所述支系B JRFL gpl40 Env选择性地表达MPER中和表位(中间箭头)和/或传输首建Env6240、040和63521 (见图16B、16C和16D)，它们优选地表达与广泛中和单克隆抗体结合的表位。最后，为了克服受驱使来制造多反应性中和抗体的B细胞的周边缺失和/或无反应性，疫苗包含有效的TLR激动剂或其他辅助剂，以驱动多反应性B细胞被生殖系和中间体克隆靶向的疫苗活化(最右箭头)。图16E是去铁铁蛋白的SDS-PAGE图。图16F是去铁铁蛋白相对HV00274、HV00276的蛋白质印迹图。分别来自克隆684-6B和686-6A的急性HIV感染gp41推断中间体抗体276和274都与19Kd去铁铁蛋白亚单位结合。两个mab也都与原生标记物中的60Kd蛋白质结合。图17 HIV-1 Env gpl40 构建体的设计；图18 :通过BN-PAGE和SDS-PAGE对急性HIV-I Env和M组共有序列HIV-I Env的分析；图19A和19B :图19A显示了 M组共有序列HIV-1 Env，C0N-S和C亚型急性HIV-1Env，1086C、B亚型慢性HIV-1 Env，JRFL的致免疫性；图19B显示了方法；图20 :通过肽N-糖苷酶(PNGase)的JRFL Env gpl40 CF的去糖基化作用；图 21A 和 21B =ELISA 中的 JRFL HIV Env gpl40CF 的抗原性；图22 :SPR 中的 JRFL gpl40 Env 的抗原性；图23 :由广泛中和抗体靶向的HIV-1 gp41的融合中间体状态；图24A和24B :图24A显示了膜锚定gp41中间体的设计；图248显示了 2F5和4E10mAb以nM Kd和几乎不可逆的解离率结合到膜稱合的gp41中间体；图25 :领先的候选免疫原；图26 :具有TLR配体和包覆的免疫调节配体的Gp41中间体脂质体；图27 =HIV-I传输首建Env 1086. C、089. C、040_C9和63521的氨基酸序列，以及密码子优化的编码序列；图28 :支系B JRFL和6240 gpl40 Env序列和编码序列；图29 :对HIV-I的早期B细胞应答原生B细胞的角色；图30 2F5和4E10广泛中和抗体与种系保守的自体抗原反应；图31 :蛋白质印迹上的2F5特异性地结合至43kDa、50kDa、70kDa和350kDa3T3(小鼠)细胞蛋白；图32 :运载2F5名义表位的保守自体抗原；图33 :高度保守的犬尿氨酸酶(KYNU)的Η3结构域；图34 :人KYNU (PDB 2ΗΖΡ)的结构和ELDKWA基序的位置；
图35 :人KYNU中的DKW残基(ELDKffA)的图示；图36 2F5抗体对人KYNU的结合可能需要H3结构域的畸变；图37 =KYNU 二聚体可能使潜在2F5结合位点不明显；图38 :在蛋白质印迹中2F5以及可能还有4E10抗体结合至重组体人KYNU ；图39 =KYNU由2F5族抗体识别；图40 :在标准ELISA中2F5抗体与rhKYNU强烈反应；图41 2F5抗体与含有2F5表位的肽(DP178-Q16L)反应，而抗KYNU不与其反应；图42 :在标准ELISA中，2F5结合到rhKYNU上和结合到DP178-Q16L上类似；图43 :结合在ELISA板中的抗体是抗原特异性的；图44 :13H11 不与 rhKYNU 结合；图45 13H11 与 DP178-Q16L 反应，但不与 MPER-656 反应；图46 2F5结合至rhKYNU受到JRFL、DP178-Q16L和R4A的竞争性抑制；图47 2F5结合至rhKYNU和JRFL的类似抑制；图48 :可溶性KYNU结合至2F5 ；图49 rhKYNU结合至表面捕获的mAb ；图50A-50C 2F5 mAb和2F5 RUA (回复的未突变祖先)抗体结合至KYNU，图50A为2F5,图 50B 为 2F5-GL1,图 50C 为 2F5-GL3 ；图51 :2F5至3T3细胞的结合受到重组体HIV-1 gp140 (JRFL)、DP 178和R4A肽的抑制；图52A-52D :在可与mAb HV00276反应的肠内细菌裂解物中的蛋白质带的富集和鉴定。图52A:在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)运行之后的蛋白质印迹分析。图52B :根据尺寸排阻色谱(SEC)选择的分子量为 500kDar细菌裂解物的蛋白质片段。图52C :SEC片段显示了通过考马斯蓝(I)和银染色(2)和蛋白质印迹(3，箭头)的520kDa蛋白质的富集。图52D:等电聚焦分离；图53A-53C =RNA聚合酶的液相色谱-质谱(LC-MS)鉴定。图53A =RNA聚合酶β亚单元的LC-MS鉴定。图53Β =RNA聚合酶β '亚单元的LC-MS鉴定。图53C =RNA聚合酶α亚单元的LC-MS鉴定；图54 Mab HV00276结合至RNA聚合酶核心蛋白；图55 Mab HV00276结合至RNA聚合酶核心蛋白的α亚单元；图56 :初始记忆B细胞培养基的中和筛选。将取自CHAVI08慢性HIV-I感染的志愿者707-01-021-9的外周血的记忆B细胞以8个细胞/孔的密度在⑶40配体、oCpG和CHK-2抑制剂的存在下进行EBV转化和刺激14天。在刺激作用结束时，测试上清液对受体2级支系CCAP45病毒的中和活性。实心点代表3600个培养基中的各培养基的中和百分数。将单克隆抗体CH01-CH05从以空心点符号表示的培养基中分离出来。阳性对照(HIV Ig)显不为最右边的空心圆；图57A-57C :单克隆抗体CH01-CH05的可变重链和可变轻链比对。CH01-CH05可变重链(图57A)、CH01-CH04(图57B)和CH05可变轻链(图57C)的序列比对。推定的回复未突变祖先序列用作可变重链和CH01-CH04可变轻链比对的模板。由于CH05具有不相关的VkI 6链，所以其单独显示；图58 CH01-CH05单克隆抗体的可变重链的系统树；图59 :所推断的推定回复未突变祖先抗体的比对；通过使用可变重链推断的所有 推定的回复未突变祖先抗体的比对通过“ ”从可变轻链中分开；图60 :CH01、CH02、CH03四元广泛中和抗体对A244 gp 120的结合；图61 CH0U CH02、CH03四元广泛中和抗体的回复未突变祖先对A244 gp 120的
结合；图62 PG9 和 PG16 结合至 A244 gp 120 和 6420T/F gp 140 ；图63 :与A244gD+gpl20包膜相比，CHOl单克隆抗体与A244gD-gp 120包膜的结合亲和性减少；图64 :48%抗gD IgA疫苗应答(99个主体);图65 :81 %抗gD IgG疫苗应答(99个主体)；图66 :gD致免疫性的潜在关联性；图67 HEP-2 结合；图68 kifunensine处理对CHOl介导中和的能力的影响；图69 CH01 (在此称为1-27-G2)序列与PG 16 Fab的叠加。
具体实施例方式本发明涉及在主体(例如人类主体)中诱导产生针对HIV-I的广泛中和抗体的方法。该方法包括向主体施用结合至生殖系B细胞受体的非HIV-I抗原，其以一定的量并在一定条件下施用，使得产生了会分泌与HIV-1 Env交叉反应的抗体的B细胞中间体克隆。该方法进一步包括在一定条件下向主体施用一定量的HIV-I抗原，使得产生了会分泌广泛中和抗HIV-I抗体的初始B细胞或其B细胞中间体克隆。对于gpl20上的一些表位来说，可能存在能与这些表位结合的罕见的初始B细胞，而对于其他表位来说，可产生广泛中和抗体的初始B细胞将不能与Env结合，因此需要由其他的非Env表位来刺激。诱导广泛中和抗体的障碍已在图15中描述，而用于克服这些障碍的本发明策略在图16A中描述。适用于本发明的非HIV-I抗原包括宿主和/或外源性抗原。非HIV-I抗原例如包括脂质，例如心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰肌醇、鞘磷脂，及其衍生物，例如I-棕榈酰基-2-油酰基-Sn-丙三基-3-[L-磷酸丝氨酸](POPS)、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，或其片段。使用六角形II相磷脂是有利的，优选容易形成六角形II管状相的六方结构柱体(例如在生理学条件下)的磷脂，这是因为磷脂可在六角形II相中稳定化(见Rauch等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4112-4114(1990) ；Aguilar 等人，J. Biol. Chem. 274 25193-25196(1999))。其他合适的非HIV-I抗原例如包括藻红蛋白(PE)、C-藻蓝蛋白(C-PC)或其他藻胆蛋白、去铁铁蛋白，以及厌氧或需氧肠道菌群或其组分(例如，520Kd抗原(或RNA聚合酶全酶或RNA聚合酶核心蛋白或其亚单元，例如RNA聚合酶核心蛋白的α亚单元或其包括结合至mAb HV00276的表位的部分)，或者60Kd或50Kd抗原)。实施例2中的数据表明，mAb HV00276结合至大肠杆菌RNA聚合酶核心蛋白的α亚单元上。在大肠杆菌RNA聚合酶核心蛋白的α亚单元和来自其他细菌(例如枯草杆菌、痢疾志贺菌、肠道沙门菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和流感嗜血杆菌)和真核生物(例如与酿酒酵母Rpb3和Rpbll有关的人蛋白和小鼠蛋白)的α同源染色体之间具有高度的序列同源性(Zhang和Darst，Science 281:262-266(1998))。因此，本发明包括使用来自除大肠杆菌以外还有来自真核生物和细菌的520Kd抗原(或其亚单元，例如RNA聚合酶核心蛋白的α亚单元或其包括结合至mAb HV00276的表位的部分)(例如见大肠杆菌RNA聚合酶α亚 单元NP_289856(gi/15803822);痢疾志贺菌YP_404940 (gi :82778591);流感嗜血杆菌NP_438962(gi :16272744) ；Rpb3 Swiss-Prot P37382. 2 ；Rpb3(智人)NP_116558. l(gi 14702171))。犬尿氨酸酶(KYNU)是通常所说的天冬氨酸转氨酶总科的依赖吡哆醛Y -磷酸盐(PLP)酶家族中的成员。真核构成的犬尿氨酸酶优先催化3-羟基-I-犬尿氨酸的水解分裂，产生3-羟基邻氨基苯甲酸盐和I-丙氨酸。已经报道了智人KYNU的克隆化、表达、纯化、表征和晶体化(Lima等人,Biochemistry 46(10) :2735-2744(2007))。如以下实施例3所描述的，KYNU在其保守H3结构域中携带核心2F5表位。基于实施例3所提供的数据，可以预计该内源性配体用于耐受B和T淋巴细胞，因此抑制了在被施用HIV-1 gp41 MPER表位肽的人体中针对HIV-I的有效免疫应答的产生。在一个实施方案中，本发明提供了针对HIV-I产生免疫的方法，包括施用可特异性地破坏这种耐受性、即不会影响针对其他无关自体抗原的耐受性的交叉反应性抗原。合适的抗原例如包括在具有ELDKWA序列或突变体gp41的CHO或293T细胞中所表达的重组体KYNU分子，或者具有ELEKWA序列的的KYNU序列(ELEKWA不存在于人蛋白中，因此不会有耐受性)。可以使用的其他免疫原包括具有ELEKWA或ELDKWA序列的脂质体中的传输/首建或野生型的慢性包膜gpl40或gpl60或MPER肽。有利的是将具有ELDKWA序列的免疫原与强效佐剂如基于鲨鱼烯的单磷酰脂质A、寡核苷酸(oCpG)和R848 (TRL-7/8激动剂)一起施用。也可使用带有这些TLR激动剂和IFNa的脂质体(也见以下说明)。适合用于本发明的HIV-I抗原包括近膜端外部区(MPER)抗原(Armbruster等人，J.Antimicrob.Chemother.54 :915-920 (2004) ；Stiegler 和 Katinger,J.Antimicrob. Chemother. 512 :757-759(2003) ;Zwick 等人，Journal of Virology 79:1252-1261 (2005) ;Purtscher 等人，AIDS 10 :587(1996))及其变体，例如使 MPER Mab 2F5和4E10或对其他广泛中和Env (例如在MPER中含有L669S突变的MPER突变体Env肽脂质复合体)具有更高的中和敏感度的变体(Shen等人，J. Virology 83:3617-25(2009))。优选的免疫原包括在图25和图26以及图16B、16C、图17、图18和图20中所示的那些。在另一个优选实施方案中，所述变体是具有使MPER mAb 2F5和4E10具有更高的中和敏感度的L669S 突变的 MPER 表位肽(Shen 等人，J. Virology 83 :3617-25 (2009))。适合用于本发明的HIV-I抗原还包括传输/首建HIV-1 Env或其片段。这些片段可以是 gpl20 的 CD4 结合位点的部分(Chen 等人，Science 362(5956) : 1123-7 (2009))、MPER 序列、gpl20 的包含 gpl20 的 V2、V3 域的部分(Walker 等人，Science 326(5950)285-9(2009)，2009年9月3日电子出版)以及其他(例如见图27和28中列出的1086、089、6240、040_C9和63521序列)的代表。优选的Env抗原包括如前所述(Liao等人,Virology30 :268-282(2006))地产生的 Malawi 1086 支系 C，6321 和 US 支系 B 040_C9 gpl40 寡聚物(图 17 和 18) (Keele 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 :7552-7 (2008))，其在豚小鼠中诱导了相当大广度的中和抗体(图19A)，并与选择性表达了 MPER中和表位的支系B JRFLgpl40 Env或其片段混合(见图28)。JRFL gpl40 Env寡聚物(图19B、20、21A和21B)结构性地结合至2F5mAb。用500U的PNgase糖类内切酶去糖基化的JPFL寡聚物(美国马里兰州Ipswich的New England BioLabs公司)增强了 2F5的结合和4E10 mAb的新结合(gp41上的4E10表位的暴露)(图21A和21B)。4E10对去糖基化JRFL的增强的结合也在图22的表面等尚子共振(SPR)分析中不出。 本发明的方法可通过如下来执行向主体施用包括非HIV-I免疫原的初次免疫，随后再施用一次或多次的HIV-1 Env抗原的加强免疫。如上述所指出的，合适的非HIV-I免疫原包括脂质(例如心磷脂、磷脂酰丝氨酸或其他阴离子脂质)、厌氧或需氧肠道菌群细菌的组分、藻胆蛋白(如PE)和KYNU或其片段。如上述还指出的，合适的HIV-1 Env抗原包括来自Malawi的传输首建Env 1086. C、来自Malawi的089. C、来自U. S.的040_C9和来自支系B急性HIV-I感染的美国患者的63521。适用于本发明方法中的初免和加免可包括非HIV-I免疫原和HIV-I免疫原。本领域的技术人员可以很容易地对初免/加免的方式。可以在使得于体内产生蛋白质成分的条件下施用这种方式的DNA序列编码的蛋白质成分。如下实施例5所述，已经将5个克隆相关的B细胞从产生了广泛中和抗体的单个患者中分离出来(CH01-CH05)。克隆相关的抗体的可能的回复未突变祖先已被推断并表达为真实的抗体。已重构这些抗体的系统树。自然的和所推断的祖先抗体均用它们与一组HIV包膜蛋白质相结合以及中和一组HIV分离物的能力来表征。重要的是应注意，回复未突变祖先(RUA)结合至A244gD+包膜。因此，这种包膜或所描述的被RUA中和的其他包膜可在本发明的优选疫苗策略中用作“初免”。根据该策略，例如可用结合至这里所述的成熟抗体上的包膜来实现“加免”。进一步的“加免”例如可用6420或63521 (或所结合的其他蛋白质、肽或多肽)来实现。当使用DNA初免或加免时,合适的配方包括DNA初免和重组体腺病毒加免，以及DNA初免和重组体分枝杆菌加免，其中DNA或载体编码例如HIV-I包膜或蛋白质类的非HIV-I抗原，例如肠道细菌或KYNU组分。这些载体的其他组合可用作初免或加免，可带有或不带有HIV-I抗原和/或非HIV-I抗原。根据本发明，非HIV-I抗原可存在于带有HIV-1 Env抗原和一种或多种佐剂的脂质体中。备选的是，该非HIV-I抗原可例如通过使用诸如DSSP的异双官能团试剂来耦合至HIV-1 Env抗原,并用一种或几种佐剂来配制。用或不用Toll样受体(TLR)激动剂的脂质体表达的MPER抗原(Dennison等人，J. Virology 83:10211-23(2009))已有介绍(例如见于 WO 2008/127651)。gp41 中间体态蛋白质(图 23)已在(Frey 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105-3739-44(2008))中有报道。gp41中间体可与脂质体配制(图24A和24B)，以形成能很好地结合至2F5和4E10的稳定的免疫原(图25)。本发明的gp41MPER免疫原可通过包含例如单磷酰基脂质A(MPL-A)(美国阿拉巴马州Alabaster的Avanti Polar Lipids公司)和TLR9激动剂来辅助(图26)，TLR9 激动剂例如为 oCpGs 10103(5' -TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT-3')和 R848TLR 7 激动剂(美国新泽西州Farmingdale的Enzo Life Sciences公司)。此外，B细胞类型转换的细胞因子刺激剂、例如 BAFF(BLYS)和 / 或 APRIL (He 等人，Immunity 26 :812-26(2007)；Cerutti和Rescigno, Immunity 28 :740-50 (2008))可包含于脂质体中，用于最佳的B细胞刺激作用。适用于本发明中的脂质体包括但不限于POPC、POPE、DMPA(或鞘磷脂(SM))、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和胆固醇(Ch)。虽然本领域的技术人员可确定最优的比率，但是一些例子包括 POPC POPE (或 POPS) SM Ch 或 POPC POPE (或 POPS) DMPA Ch为45 : 25 : 20 : 10。可使用的脂质体的备选配方包括以9 7. 5 I的摩尔比配制的DMPC(I，2- 二肉豆蘧酰基-sn-丙三基-3-胆碱磷酸)(或溶血磷脂酰胆碱)、胆固 醇(Ch)和DMPG(1，2-二肉豆蘧酰基-sn-丙三基-3-磷酰-rac-(l-丙三醇))(Wassef等人，ImmunoMethods 4 :217-222 (1994) ；Alving 等人，G. Gregoriadis (ed.), Liposometechnology 2nd ed. , vol. Ill CRC Press, Inc. , Boca Raton, FL(1993) ;Richards 等人，Infect. Immun. 66(6) :285902865 (1998))。上述脂质组合物可以与脂质A复合并用作免疫原，以诱导针对磷脂的抗体应答(Schuster等人，J. Immunol. 122 :900-905 (1979))。优选的配方包括根据Schuster等人,J. Immunol. 122 :900-905 (1979)的与脂质A复合的比率为60 30 10的POPC POPS Ch。肽对总脂质的最佳比率可例如随着肽和脂质体而变化。在本发明中可使用多种佐剂(包括以上所提到的)。上述肽-脂质体免疫原和配合体可与能促进加强的免疫应答(Rao等人，Immunobiol. Cell Biol. 82 (5) :523(2004))的佐剂、例如基于角 S烯的佐剂(Kaldova, Biochem. Biophys. Res. Communication, 2009年12月16日先于印刷而电子公开)和/或TLR激动剂(例如TRL3、TRL5、TRL4、TRL9或TRL7/8激动剂或其组合)配制和/或施用。可使用的其他佐剂包括矾和Q521。也可使用油类乳液如Emulsigen (水包油乳液)中的低聚糖CpG (Tran等人，Clin. Immunol. 109 (3)278-287 (2003)) ο其他合适的佐剂包括在2005年12月14日提交的USl 1/302505中所公开的，包括其中公开的TRL激动剂(还可以见于Tran等人，Clin. Immunol. 109 278-287(2003);美国专利公开 20030181406、20040006242、20040006032、20040092472、20040067905、20040053880、20040152649、20040171086、20040198680 和 200500059619)。免疫应答增强的TLR配体如脂质A、低聚糖CpG和R-848可单独地或以组合物的形式配制到具有耦合到其中的HIV-1 Env的脂质体中。负载有强效佐剂(例如强力TRL激动剂)的脂质体是可用来克服B细胞的可驱使以制造多反应性中和抗体的外周缺失和/或无反应性的免疫原的例子。HIV-1 gp41肽至脂质体的跨膜结构域锚定可用来实现功能性表位显示。HIV-1gp41的跨膜结构域可用来将肽锚定至包括合成脂质的脂质体内。TMD三聚作用的诱导可促进gp41 MPER的三聚形式的形成。备选的是,Env gpl40的组氨酸标记的(c端)变体可锚定至所述的脂质体内，用于HIV-1 gp41的中间体形式(gp41中间体)。非HIV-I免疫原和/或HIV-I蛋白质/多肽/肽或编码序列的给药模式可随着免疫原、患者、所寻求的效果以及类似地还有给药剂量而变。典型地，给药途径可以是肌肉的、静脉内的、腹膜内的或皮下的注射。此外，可以通过鼻内途径，或如栓剂样运载体经直肠或阴道的途径给药。一般而言，脂质体悬浮在诸如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PH7.0)的水性液体中。本领域的技术人员可以容易地确定最佳的给药方式。优选用于预防性使用的免疫原，然而向感染个体施用免疫原可能减少病毒量。人单克隆抗体(hu mAb) 2F5和4E10以高特异性和纳摩尔(nM)的亲和力结合至对应于HIV-1 gp41MPER的多肽。这两种hu mAb也与离散的人和小鼠的细胞状抗原反应，如通过免疫荧光显微镜法和蛋白质印迹所确定的那样。这些性质表明，2F5和4E10对于细胞蛋白的分离来说是理想的，包括从哺乳动物细胞中生化提取并通过标准免疫沉淀反应方法恢复的变性的形式和多肽。2F5和4E10的相同性质使它们适合用于通过标准质谱方法对所提取的细胞蛋白/多肽的鉴定。简言之，特异性地结合至2F5或4E10的免疫沉淀的细胞蛋白/多肽可受到酶消化，所得片段的质量和电荷可用于鉴定母分子。·在以下的非限制性实施例中对本发明的某些方面进行了更具体的描述(还可见于 Maksyutov 等人，J. Clin. Virol. Dec,31 Suppl I S26-38(2004) ；Haynes 等人，Science 308 :1906(2005) ;Gurgo 等人，Virology 164 :531-536(1988)；美国专利7，611，704 ；2007年6月22日提交的美国专利申请11/812，992 ；2007年4月13日提交的美国申请专利11/785，077 ；2006年4月12日提交的PCT/US2006/013684 ；PCT/US04/30397(W02005/028625) ；W02006/110831 ；W0 2008/127651 ;美国专利公开2008/0031890 和 2008/0057075 ;2008 年 12 月 22 日提交的美国专利申请 11/918，219 ；2007年2月28日提交的美国临时专利申请60/960,413 ;2009年4月3日提交的美国临时专利申请61/166，625,61/166, 648和61/202，778 ；2010年2月25日提交的美国临时专利申请61/282，526 ;2010年7月27日提交的美国临时专利申请61/344，457 ;2010年8月25日提交的美国临时专利申请(代理人案号 01579-1597) ；PCT/US2010/01018 ；PCT/US2010/030011和PCT/US2010/01017 ;它们的所有内容通过引用而并入本发明中)。实施例I试验细节感染急性HIV-I的患者。为研究而选择的患者为传输后17至30天的患者，传输日期根据既往病历和Fiebig分类(Fiebig等人，AIDS 17 :1871-1879(2003))估算。患者065-0 和 FIKE 处于 Fiebig 阶段 1，而患者 068-9,684-6 和 MCER 处于 Fiebig 阶段 2。对照主体。对未感染的主体和那些接种了三价灭活(TVI)的流行性感冒疫苗(FLUZ0NE 2007或2008)的主体的骨髓、白细胞分离产物或外周血单核细胞(PBMC)进行单个浆母细胞/浆细胞分选。免疫后7天对那些用TVI免疫的主体进行研究(Liao等人，J. Virologic Methods，158 :171-9 (2009) ；fframmert 等人，Nature 453:667-71(2008)；Smith 等人，Nature Protocols 4:372-84(2009))。流式分选策略。使PBMC、白细胞分离产物或骨髓样品与如之前所述的抗B细胞抗体反应(Liao 等人，J. Virologic Methods 158:171-9(2009))。Wrammert 等人(Nature453 :667-71(2008))已经指出，在人PBMC中是抗体分泌细胞的细胞是那些在⑶19+、⑶38hi+、IgD_、⑶201<)+/_8细胞中的细胞。因此，在急性HIV感染(AHI)和接种了流行性感冒疫苗的对照体中，为了分离单个抗体分泌浆母细胞/浆细胞的，通过流式细胞术将CD19+、⑶38hi+、IgD_、⑶201<)+/_分选到含有所述RNA提取缓冲剂的单个96孔板中(Liao等人，J. Virologic Methods 158:171-9(2008) ;Wrammert 等人，Nature 453 :667-71 (2008))。作为用于确定正确的浆母细胞/浆细胞细胞群体的成功分离的阳性对照，在接种了三价流行性感冒疫苗(FLUZ0NE 2007或2008)后的第7天分离出同样的群体。已经证明，如所预料的那样，75%的所分选的细胞确实是流行性感冒特异性抗体(Wra_ert等人，Nature 453 667-71(2008))。传输/首建包膜的鉴定和表达。通过如前所述的单基因组扩增和Env基因测序(Keele 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 :7552-7 (2008))来鉴定患者 684-6 和 FIKE 的传输/首建Env。通过所述的293T细胞的瞬时转染(Liao等人,J. Virologic Methods 158 171-9(2008))来表达Env gpl40C(变异的gp 120/41切割位点)、gpl20和gp41蛋白质。
浆母细胞/浆细胞免疫球蛋白VH和VL基因的PCR扩增。通过单细胞PCR和如下 述产生的重组体抗体(Liao 等人，J. Virologic Methods 158:171-9(2009) Jrammert 等人，Nature 453 :667-71(2008) ;Smith 等人，Nature Protocols 4 :372-84(2009))来将所分选的B浆母细胞/浆细胞的VH和VL Ig链分离出来。Ig VH和VL序列的测序、序列注解、质量控制和数据管理。用Qiagen (美国加州Valencia) PCR纯化试剂盒来纯化Ig VH和VL基因的所有PCR产物，然后用ABI 3700仪和BigDye 测序试剂盒(美国加州Foster City的Applied Biosystems公司)进行正向和反向排序。使用Phred对每个样品进行碱基读出(Ewing等人,Genome Res. 8 :175-85 (1998)；Ewing和Green, Genome Res. 8 :186-94(1998))。使用基于各位置处的质量评分的新颖装配算法来将抗体基因的正向和反向链装配至一个最终的核苷酸序列中Ofepler等人，已提交)。所估计的PCR产品率是O. 28，或者是大约每5个扩增基因有I个PCR产品。通过局部比对算法来确定免疫球蛋白的同型(Smith和Waterman, J. Mol. Biol. 147 :195-7 (1981))。使用SoDA来测定质量确定的抗体序列的生殖系重排(Volpe等人，Bioinformatics 22 438-44(2006))。衍生于SoDA的染色体组信息、例如基因片段的使用、体细胞突变和⑶R3域被保存在ORACLE数据库中，以便于存取。为了确定来自相同主体的抗体是否是克隆相关的，使用如下三项标准。首先，所讨论的抗体的重链必须使用相同的VH和JH基因片段。由于D片段的长度和高突变，所以这些较难以鉴别。因此，D片段的相似性不用来作为克隆关联性的标准。类似地，两条轻链必须使用相同的V K /V λ和J K /J λ。第二，所讨论的抗体的重链必须具有相同的⑶R3长度。这点也适用于轻链。第三，重链的⑶R3的核苷酸序列必须具有70%的同一性。这点同样适用于轻链的⑶R3。符合这三项标准的抗体称为是克隆相关的。以从SoDA推断的生殖系作为根，使用PHYLIP 3. 63软件包来构造最大似然树，以测定克隆之间的系统发育关系(Felsenstein, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 360 1427-34(2005))。还使用同样的软件包来推断祖先序列。所推断的生殖系和中间体抗体的设计和产生。对抗体克隆家族的每一个成员，使用最大似然性分析来推断生殖系抗体前体和多种抗体中间体形式(Felsenstein, J. Mol.Evol. 17 :368-76(1981) ;Volpe 等人，Bioinformatics 22:438-44(2006))。通过上述重组技术来合成这些VH和VL基因(美国新泽西州Piscataway的GeneScript公司)，并表达为IgGl mAb0作为重组体mAb的表达。使用所述方法(Liao等人,J. Virol. Methods 158 171-9 (2009))，通过PCR将孤立的Ig Vh和\基因对组装到线性全长Ig重链和轻链基因表达盒中，以通过在人胚肾细胞株293T (美国弗吉尼亚州Manassas的ATCC公司)中的转染来生产重组体mAb。使用PolyFect (美国加州Valencia的Qiagen公司)和制造者推荐的方案，将配对的Ig重链和轻链基因表达盒的纯化PCR产物共转染到生长在6孔(每孔2 μ g)组织培养板(美国新泽西州Franklin Lakes的Becton Dickson公司)中的80-90%融合的293T细胞中。在转染后六至八小时，将293T细胞供给增补了 2%胎牛血清(FCS)的新鲜培养介质，然后在37°C下在5% CO2培养箱中进行培养。转染后3天获得培养上清液，然后量化所表达的IgG水平，并筛选抗体特异性。为了通过筛选试验鉴别的精选抗体的未来表征，使用标准分子协议来将线性Ig重链和轻链基因构建体克隆到PcDNA 3. 3中，以生产纯化的重组体mAb。
为了生产源自所分离的VH和VL基因以及所推断的生殖系和中间体前体抗体序列的纯化重组体mAb，使用在增补了 2% FCS的DMEM中培养的PolyFect (美国加州Valencia的Qiagen公司)对在T175烧瓶中培养的293T细胞与含有重链和轻链Ig基因的质粒进行共转染。使用抗人Ig重链特异性抗体琼脂糖珠(美国密苏里州St. Louis的Sigma公司)来从所转染的293T细胞的培养上清液中提纯重组体mAb。通过ELISA和Luminex试验筛选抗体特异性。使用所述方法(Liao等人，J. Virol. Meth. 158 :171-179(2009))来测定上清液中的重组体mAb浓度。为确定针对HIV-I抗原和针对一组非HIV-I抗原的抗体反应性，测试所表达的重组体mAb的特异性。HIV 抗原包括 Env 肽 gp41 免疫显性区域(RVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAWSNKSLNK)、gp4IMPER 区域(QQEKNEQELLELDKWASLWN)、HIV-1MN gp41 (美国马萨诸塞州 Woburn的 Immunodiagnostics 公司)、HIV-IM 组共有序列 gpl20(Liao 等人，Virology 353 268-82 (2006))、HIV-IM 组共有序列 gpl40CFI (Liao 等人，Virology 353 :268-82 (2006))、p66 (美国新泽西州Lakewood的Worthington Biochemical公司)、p55 (美国康捏狄格州 Meriden 的 Protein Sciences 公司)、p31 (美国加州 San Diego 的 Genway 公司)、nef (美国加州San Diego的Genway公司)、tat (美国马里兰州Kensington的AdvancedBioscience 公司)以及 AT-2 灭活的 HIV-1ADA 病毒粒子(Rutebemberwa 等人，AIDS Res.Human Retrovirol. 23 :532-42(2007));源自 Jeffrey Lifson,NIH,NCI,Frederick CancerResearch Facility的捐赠。此外，针对自身同源的gpl40、gpl20和gp41测试684-6的mAb,而针对自身同源的gpl40和gpl20测试FIKE的mAb。非HIV-I抗原包括三价流行性感冒疫苗2007 (FLUZ0NE 2007)、来自Hl A/所罗门群岛/03/2006的重组体流行性感冒HA蛋白质(美国康涅狄格州Meriden的Protein Sciences公司)、破伤风类毒素(美国加州 San Diego 的 Calbiochem 公司)、HEP-2 细胞(美国新泽西州 Princeton 的 InvernessMedical Professional Diagnostics 公司)、心憐脂(美国阿拉巴马州 Alabaster 的 AvantiPolar Lipids 公司)(Haynes 等人，Science 308 :1906-8 (2005))和脂质 A(美国阿拉巴马州Alabaster的Avanti Polar Lipids公司)。如下所述地制备称为肠道菌群的厌氧和需氧细菌提取物的全细胞裂解物。简单地说，从来自患者的4份粪便试样中移出细菌，并在30°C下的厌氧或需氧条件下种植在琼脂板上。收获融合的细菌，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，然后用市售细菌蛋白提取剂(美国依利诺斯州Rockford的Pierce公司)处理。得到的提取物用O. 22 μ m的过滤器过滤,并在使用前保存在_80°C下(Kawatsu等人，J. Clin.Microbiol. 46 :1226-31 (2008))。对 FLUZONE 、流行性感冒 HA、gp41 免疫显性区域和MPER区域以及肠道菌群的全细胞裂解物进行ELISA试验(Tomaras等人，J. Virology 82 12449-63 (2008))和 Luminex 珠试验(Tomaras 等人，J. Virology 82 :12449-63 (2008))。对破伤风类毒素、心磷脂(美国密苏里州St. Louis的Sigma公司)、灭活的隐球菌和白念珠菌进行ELISA试验。与H印-2上皮细胞的反应性的试验是间接免疫萤光试验(Mietzner等人，Proc. Natl. Acad. · Sci. USA 105 :9727-32 (2009))。抗体反应性的表面等离子体共振(SPR)分析。对保持在20°C下的BIAcore3000(美国新泽西州Piscattaway的BIAcore公司)进行SPR结合试验。通过上述的标准胺类偶合法(Alam 等人，J. Immunol. 178 :4424-35 (2007))来将 HIV-1 gp41 或寡聚 gpl40 蛋白(Con S gpl40,自体同源的Env gpl40)固定到CM5传感器芯片上。人mAb被捕获到抗人Fe抗体偶合表面上，然后各人mAb被捕获至约200-500RU。减去对照表面上的非特异性结合(对于Env固定表面来说为HIV-1 gpl20，对于mAb捕获表面来说为人类IgG、IS6)后获得mAb结合的特异性结合应答。使用二价分析物模型来测量速率常数(为了说明二价Ig分子的亲和力)，并从mAb滴定中获得对结合曲线的整体曲线拟合。以30 μ L/min的速率注入mAb达2-6分钟，使用甘氨酸-HCl (pH2. O)和表面活性剂P20 (O. 01% )作为再生缓冲剂。结果流行性感冒疫苗。对源自单细胞分选的浆细胞/浆母细胞的接种了流行性感冒疫苗的主体的抗体克隆进行研究，发现应答是高度克隆的。克隆成员几乎均与所测试的流行性感冒抗原反应。图I显示了针对Hl所罗门群岛血细胞凝集素的代表性流行性感冒抗体克隆。从三个接种了流行性感冒疫苗的主体的浆细胞/浆母细胞中分离出总共450个抗体，其中57. 7%是流行性感冒特异性的。从流行性感冒感染主体中分离出来的所有265个抗体中，克隆相关的抗体中的20个独立克隆被鉴定，并且其中115个抗体(92% )与流行性感冒抗原反应。急性HIV感染中的克隆抗体应答。相比于其中 75%的浆细胞/浆母细胞是流行性感冒特异性的流行性感冒疫苗接种，在来自总共1074个已从5个AHI患者的浆母细胞/浆细胞中分离出来的重组体抗体中，89个或8. 3%的表达抗体(3. 3-13. 4%的范围)是HIV-I特异性的，而其余的大部分mAb是针对非HIV抗原( 6% )的，或具有未知的特异性(882个或82. 1% )0通过一组非HIV-I相关的抗原试验，可以证明对H印-2上皮细胞(27个或2.5% )、肠道菌群(5个或0.5% )、心磷脂(4个或0.4% )、流行性感冒(9个或O. 8 %)、隐球菌(4个或O. 4 %)、白念珠菌(2个或O. 2%)和破伤风类毒素(8个或O. 7%)的高亲和性抗体。其他38个或3. 5%与这些抗原中的至少2种反应。这些患者中有三个具有脂质A，而一个患者具有肠道菌群抗体，表明了肠道损伤、微生物迁移以及抗脂质A和肠道菌群抗体的诱导很早就开始了。明显的是，在HIV传输后17-30天内，这些早期AHI患者中没有一个具有除了 gp41外的任何检测到具有HIV-I特异性的mAb。已经报道，在检测针对gp41的AHI应答中，一致性Env等同于自身同源性Env (Tomaras 等人，J. Virology 82:12449-63(2008))。然而，为排除应答在 AHI B 细胞分析中被遗漏的可能性，用其自身同源性重组体gpl40 Env来筛选来自684-6和FIKE的mAb。一般而言，对自身同源性gpl40 Env的应答比对支系B gp41的要少得多。因此，针对传输/首建病毒的初次浆母细胞/浆细胞库应答、例如血浆抗体应答(Tomaras 等人，J. Virol. 82 :12440-63(2008))集中在 Env gp41 表位。此外，HIV-1 激活和驱使来自先前接种疫苗或致病原抗原(例如隐球菌、白念珠菌和破伤风类毒素)的预先存在的记忆B细胞的终端分化。此外，在AHI的过程中，Hep-2细胞自身反应性B细胞的多反应性克隆被触发而参与初次浆母细胞/浆细胞应答。AHI浆母细胞/浆细胞库中的抗体克隆的分析。一般而言，相比于所报道的通过流行性感冒接种疫苗来诱导的衆母细胞/衆细胞库(Wrammert等人，Nature 453 667-72(2009))或者在于血浆中具有广泛中和抗体活性的主体中的gpl40+B细胞的记忆B细胞库(Scheid等人，Nature 458 :636-40 (2009))，从AHI浆母细胞/浆细胞库中分离出来的克隆很少。在具有广泛中和抗体的六个患者的慢性HIV-I感染中，Scheid等人(Nature458 :636-40(2009))发现，在从这六个患者中分离出来的502个抗体中，B细胞克隆的数目在患者之中在22-50的范围内变化。 在AHI的研究中，在从5个AHI患者中分离出来的1074mAb中，只发现了抗体的8个克隆。这些包括了在于AHI患者之一中鉴定的抗体的6个独立克隆中的会与gp41反应的抗体的3个克隆。令人关注的是，在3个AHI gp41克隆的所有52个克隆成员中，只有17个(37% )与gp41反应。这与94%的流行性感冒反应性的流行性感冒克隆成员形成了对比。图2 显示了 AHI 克隆 684-6B :带有 52 个成员的显著的 VH3-7、DH1_26、JH5、VK1_39、JK4、IgG3变异克隆，不带有未突变的成员。在57个抗体中，只有4个(8%)与gp41反应。gp41与克隆推断的生殖系和中间体抗体的反应性的分析。可以推论，HIV-1 gp41会与初始B细胞的生殖系B细胞受体反应，并以较差的抗原驱动来刺激低亲和力的克隆，或者是，gp41可与记忆B细胞的预先存在的克隆交叉反应，并且迫使克隆成员受到同时的gp41和自体抗原驱动。为了区分这两种可能性，采用最大似然性分析来推断生殖系未突变的抗体，而采用部分突变的克隆中间体来测定其与gp41的反应性(图3)。为了测定在克隆发展中在何处获得与gp41的反应性(即生殖系VH+VL或者后来的中间体)，检验所推断的生殖系和克隆成员中间体与支系B gp41、自体同源的gpl40和M组共有序列gpl40的反应性(图4)。已经发现，在第二个中间体前体抗体中获得了克隆684-6B的反应性(图4和图5)。下一个要问的问题是，与gp41的反应性是否代表gp41的抗原驱动。图6显示了更多所推断的中间体抗体克隆以mg量生产出来，并用于分析结合至gp41的抗体的离解常数(Kd)。图7显示了带有绘制成Kd的IoglO值的离解常数的热图曲线，表明确实由于中间体向实际分离的抗体发展，存在着为了结合至gp41的亲和性成熟的过程。考虑到在AHI期间的多反应性非HIV-1 gp41克隆的诱导，那么下一个要问的问题是，克隆684-6B成员是否通过与心磷脂和Hep-2上皮细胞的反应性而具有多反应性。在Hep-2间接免疫荧光试验中，在与gp41反应性相同的推断中间体前体阶段获得克隆684-6B的反应性(图8)。684-6B的所有克隆成员与心磷脂反应，包括生殖系未突变的抗体，并且尽管在克隆发展期间Hep-2反应性有高有低，但是与心磷脂的反应性在整个中间体中是相对稳定的，直到最终的克隆307和350。生殖系和其他克隆成员与心磷脂的多反应性强烈地表明，对HIV的初次抗体应答源自HIV gp41刺激天然抗体的预先存在的多反应性克隆，而一旦原始克隆通过体细胞超突变获得对gp41的交叉反应性，那么gp41将吸收B细胞的克隆，从而变成多反应性的gp41克隆。该发现对HIV疫苗设计具有相当大的影响。对非HIV-I抗原的生殖系反应性的性质。考虑到684-6B克隆的多反应性不是在各克隆的生殖系抗体中、而是在所推断的克隆中间体中获得的意外结果，进行了尝试以鉴定生殖系可能与之反应的宿主抗原，从而鉴定在HIV中激活的抗体克隆的可能起源。可以假定，因为在肠道中因AHI引起了早期的肠道微生物迁移，以及因为AHI中的许多初始抗原刺激到达粘膜表面，那么初次抗体应答可能以某种方式与肠道微生物抗体应答相联系或相关。为了研究这一点，测定是否存在来自684-6B克隆的克隆抗体和推断生殖系以及推断中间体对厌氧和需氧肠道菌群的全细胞裂解物的可测量的反应性。此外，采用EBV转化来从AHI或未感染主体的肠、骨髓或血液中分离出一组五聚IgM mAb。首先，从AHI中分离出一系列IgM抗体，而从gpl40反应性的或gpl40非反应性的·未感染主体中分离出两个。要提出的问题是，与gp41有反应性的IgM是否也与肠道菌群具有反应性。表I显示了确实所有与gp41具有反应性的mAb与肠道菌群抗原也具有反应性，而那些与gp41无反应性的mAb与肠道菌群抗原也无反应性。
*1从惑染纖未感染主体中分离SS来的所有WV-1 Env gp41 IgM Mab 也结合至厌氧或需氧肠道细菌全蝤臌裂解物
MAbHIV-1 Envgp41—SI
_WCL_
_Uiminax单淹中的反应性_
2 Β 01732721012AH*
2C314S2W591AH_
F31776712237AHI 肠
FS10233725433ANi 肠
1E717153259133AH 丨骨健
「 2Β924Β88742347AH丨骨髓
ALLS1303118161584AHi 觸
C14-22500M2>80未感染■鼹
G083673241>80来感染翁I液
XM-I<80<80<80未感染 MM
XM-2<S0<80<B0AHi !i#
_XM-3__<θΟ_<80_AHi '騰_
戍抑=急性./￥. ^队1感染 Mab=单宪隆抗体 WCL =全_跑襄鮮物
<80 = ^Lumjnex试验营景中与gp41或顥遒细菌全_廳獲解犓无反较性很明显，当用厌氧和需氧肠道菌群的全细胞裂解物来检验来自所测试的所有克隆的生殖系和中间体前体时，所有克隆中的所有抗体均与肠道菌群全细胞裂解物反应。图9显示了在各mAb中与需氧全细胞裂解物(WCL)反应的684-6B克隆的热图。与厌氧WCL反应时得到相似的结果。当为测定由肠道菌群介导的抗原驱动而进行分析时，发现在AHI克隆中的确存在与进行性体细胞超突变一致的抗体亲和性的增加，尽管不如gp41明显。使用厌氧和需氧肠道菌群全细胞裂解物的AHI gp41 mAb的蛋白质印迹。下面，在BN-PAGE(图IOA和B)和SDS_PAGE(图11和12)中用厌氧和需氧WCL来测定图6中的推断的中间体#2 (HV00276)的反应性。在BN-PAGE分析中，684-6B克隆mAb与厌氧和需氧肠道样品中的520000Da分子均反应(图IOA和10B)。此外，mAb 276也与480KDa MW标记物、即藻红蛋白反应(图IOA和10B)。图11和12显示了，在SDS-PAGE非还原性条件(图11)和还原性条件(图12)下,在 520000Da处再次观察到很强的条带。在还原性条件下,在大约60和50Kd处以及在原生标记物中也能观察到更小的条带(图12)。原生标记物仍是684-6B克隆mab会对其显示出多反应性的藻红蛋白(PE)。重要的是，体细胞突变的原始2F5和4E10广泛中和抗体也与肠道菌群WCL中的蛋白质条带反应，其中2F5与需氧WCL中的 300000 Da分子和 80000 Da分子反应，而4E10与需氧WCL中的 80000 Da分子和100000 Da分子反应。在图12(还原条件下的SDS-PAGE)中可以看到，HV00276(中间体684-6ab#2)结合至需氧和厌氧WCL中的 520000Da条带，而2F5与需氧WCL中的 80000 Da条带反应，4E10与需氧WCL中的约60000 Da条带反应。之前已经证明，广泛中和抗体2F5、4E10和lbl2是结合至多个宿主抗原的多反应 性抗体。因此问题是，如果对HIV的初始应答是通过多反应性抗体应答，那么为何不是多反应性抗体制造该广泛中和呢？对此已考虑了两种可能性。首先，已经指出，lbl2、2F5和2G12的生殖系不结合至HIV gpl20或gp41，而体细胞高突变的抗体则会(Xiao 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 390 :404-9(2009))。因此，观念是，对于广泛中和抗体的许多表位来说，其域已被使用的免疫原不会靶向其靶向的初始B细胞的B细胞受体。现在已经研究了 lbl2生殖系对脂质的反应性和对肠道菌群全细胞裂解物的活性，并已发现，的确，生殖系lbl2对HIV gpl20包膜的反应性是阴性的,而体细胞突变的lbl2对HIV gpl20的反应性非常高(图13)。相比之下，lbl2生殖系对心磷脂的反应性非常高，而体细胞突变的多反应性原始lbl2 mAb对心磷脂的反应性尽管不是阴性的但非常低(图13)。此外，lbl2生殖系与肠道菌群全细胞裂解物同样具有反应性，而成熟的原始体细胞突变的1B12 mAb仅具有弱反应性(表2)。
表2厂_泛中和単兒隆.抗体2F5、4E10、1612和_2<512与肠道菌群的反風性以及它《的 糸抗体
与肠道菌群的反应性
wigp4igpi20 厌氧SB*菌群需氧的撕道菌群
WCLWCL
_LiimingX单元中的反应性_
1bT2 原始NA5106 483β4
1b12 生殖系NA<805241127
r -.2F5 Mm327179237103100
L0132-I系NANANANA
4E10 Jl始
4E10 生殖系NANAHANA
2012原始
2612 生殖系<80<80<80<80
‘17b 麗始1433<80<80<80
CCR5结脅位点掷体其次，已假设2F5、4E10和lbl2的多反应性靶向B细胞，使这些类型的抗体缺失或无反应性(Haynes 等人，Science 308 1906-8 (2005) ;Haynes 等人,Human Antibodies 14:59-67(2005) ;Alam 等人，J. Immunol. 178 :4424-35 (2007))。这个假设最近在 2F5H1 纯合子敲入小鼠(Verkoczy 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 :181-6(2010))和现在在 4E10VH纯合子敲入小鼠中针对2F5VH得到证实(图14)。在广泛反应性的体细胞突变VH敲入的两种动物模型中，突变VH具有足够的自体反应性来引起骨髓中的缺失，以及调用外周中的多重耐受机制。总之，上述结果证明了 对HIV的初次抗体应答集中在非中和Env gp41表位。 初次gP41抗体应答由预先存在的体细胞突变的多反应性“天然”抗体克隆所引起，该“天然”抗体克隆的生殖系Ab不与gp41反应,但其推断中间体Ab会与gp41反应。 虽然gP41抗体反应性克隆的抗体成员是多反应性的，并且与脂质和其他自体 细胞抗原交叉反应，但是抗gp41抗体的亲和性由于体细胞超突变的发生而增加，这表明了gp41抗原驱动。 然而初次HIV诱导克隆发展既非有效的也非高亲和性的(可能是因为自模仿)，这产生了 HIV Env反应性和非反应性的抗体克隆成员的混合物。 广泛中和抗体lbl2、2F5和2G12生殖系似乎不与其推断生殖系抗体反应。 从AHI或未感染主体中分离出来的、结合至gp41的IgM抗体也结合至肠道菌群，而gp41阴性IgM不结合肠道菌群抗原。_lbl2生殖系与脂质和肠道菌群反应，意味着起源于产生初始B细胞的预先存在的多反应性天然抗体，初始B细胞可能来源于最初靶向肠道菌群的B细胞克隆。 体细胞突变的2F5、4E10和lbl2广泛中和抗体均与肠道菌群全细胞裂解物中的抗原反应，表明这些抗体可能来源于起初靶向肠道菌群的初始B细胞的克隆。实施例2图52显示了在与mAb HV00276反应的肠内细菌裂解物中的蛋白质条带的富集和鉴定。采用N-PAGE凝胶法和随后的蛋白质印迹分析显示了 mAb HV00276结合至厌氧和需氧肠内细菌裂解物中的 520kDa的蛋白质条带。在进行尺寸排阻色谱法(SEC)之后收集来自细菌裂解物的具有 500kDa分子量的蛋白质片段。SEC片段显示了通过用mAb HV00276的考马斯蓝(I)、银染色(2)和蛋白质印迹(3，箭头)的520kDa蛋白质的富集。等电变焦分离显示了 mAb反应蛋白向pH6. 2-7的凝胶区A4的迁移。对来自富集片段的520kDa条带进行LC-MS分析，以作蛋白质鉴定。鉴定了 RNA聚合酶β、β '和α亚单位(见图53)。在N-PAGE凝胶上运行大肠杆菌RNA聚合酶核心蛋白和全酶(核心蛋白+ σ亚单位)(美国威斯康星州Madison的Epicentre Biotechnologies公司),并且用蛋白质印迹来检测mAb HV00276的反应性。检测到对核心蛋白和全酶的反应性，表明mAb HV00276结合至RNA聚合酶核心蛋白。在还原性(Red)条件和非还原性(NR)条件(左组)下在变性SDS-PAGE凝胶上运行大肠杆菌RNA聚合酶核心蛋白(美国威斯康星州Madison的EpicentreBiotechnologies公司)。在变性SDS-PAGE上，核心蛋白的单个亚单位(β、β '、α和ω)溶解，并在考马斯蓝着色之后显现出来(右组)。转移凝胶的蛋白质印迹分析显示了 276mAb只结合至RNA聚合酶核心蛋白质的37 kDa的α -亚单位。未观察到对肠内细菌裂解物蛋白质为阴性的HV00503 mAb与任何核心蛋白亚单元之间的反应性。实施例3为了理解自体耐受性如何影响对HIV-I的保护性体液应答，确定哪个自体抗原被HIV-I表位模仿和这些自体抗原何处/何时暴露于T淋巴细胞和B淋巴细胞下是至关重要的。图30显示了 HIV-1 gp41MPER特异性的单克隆人抗体也与存在于丙酮固定的小鼠3T3细胞中的自体抗原反应。如图31所示，至少四种离散的分子可从小鼠3T3细胞中通过生物素化的2F5抗体免疫沉淀出来。所沉淀出的优势种具有约50-54 kDa的表观分子量。保守的哺乳动物蛋白KYNU携带核心2F5表位，并具有51kDa的分子量(图32)。2F5核心表位存在于许多脊椎动物的KYNU中(图33)，且存在于KYNU的保守H3结构域中(图34)。如图35所示，ELDKffA区域处于有序的α螺旋中。DKW基序不是表面暴露的。
2F5抗体至人KYNU的结合可能需要Η3结构域的扭曲，这潜在地会导致减缓的Km。如图36所示，在H3中，D和W残基可能暴露侧链，但K却被埋藏。2F5抗体可能必要地“扭曲” H3螺旋以结合ELDKWA表位。在生理学条件下，KYNU被认为是同型二聚体。ELDKWA基序可用于KYNU单体，但是当KYNU形成二聚体时就不可用(图37和38)。推定的生殖系2F5抗体也与rhKYNU反应(图39和40)。这是重要的一点，因为其表明KYNU可以是能最后产生突变的高亲和性2F5抗体的B细胞的原始配体。如图41所示，2F5抗体可与包含2F5表位的肽(DP178-Q16L)激烈地反应，但是抗KYNU抗体则不如此(还可见于图42和43)。识别邻近于2F5决定基的表位的非中和小鼠HIV-1 MPER单克隆抗体13H11不与rhKYNU结合(图44)。图45提供了可区别2F5和13H11单克隆抗体的结合位点的残基与HIV-1 gp4IMPER的匹配。图46显示的数据表明，2F5对rhKYNU的结合受到重组体HIV-Igpl40env (JRFL)、DP178-Q16L和不相关的肽抗原R4A的竞争性抑制。JRFL重组体HIV-1 gpl40同等地抑制2F5对JRFL (同源性抑制)和对rhKYNU (异源性抑制)的结合(图47)。抑制曲线的相似性表明，单个共有表位是造成2F5结合至JRFL和rhKYNU的原因。如图48所示，2F5单克隆抗体同等地结合于板的和可溶的rhKYNU。表面等离子体共振研究表明，2F5及其未突变的前体能够激烈地结合至rhKYNU (图49)。较慢的Km与扭曲了原生KYNU结构的2F5抗体一致，以实现最大化的交互作用。Ktjff速率非常低，表明所结合的KYNU能与所有2F5类型稳定地相互作用。SPR 结合分析显示，2F5 mAb 及其 RUA(2F5_GL1 和 2F5-GL3)结合至 KYNU (图 50)。每一个抗体被捕获在人抗Fe固定的传感器表面上，然后注入50、30、20和10μ g/mL浓度的可溶性KYNY。结合曲线的重叠显示了 KYNU对各个抗体的特异性结合。用显示出与KYNU无结合的对照mAb (Synagis,抗RSV)来测量非特异性结合。实施例4为了测定2F5对所固定的3T3细胞是否会被包含2F5 MPER核心表位(ELDKWA)的蛋白质/多肽所抑制，将2F5单克隆(lOyg/ml)抗体与渐增摩尔浓度的同源性(JRFL和DP178)或异源性(R4A)抑制剂反应(I小时，25°C )。随后将这些混合物加入到用由乙醇/丙酮固定的3T3细胞所覆盖的含水/锁水的载片上(2小时，25°C)。漂洗载片，然后在250ml含有O. I %吐温20和O. 5% BSA的PBS中清洗过夜。用山羊抗人IgG-FITC (I 400于含有O. I %吐温20和O. 5% BSA的PBS中)涂覆清洗后的载片。I小时后清洗载片，盖入Fluoromount-G中。24小时后，使用Zeiss Axiovert 200M共焦显微镜在200x的放大倍数和固定的300晕秒的曝光时间下获得突光图像。同源性抑制剂JRFL蛋白质和DP178多肽可抑制2F5结合至3T3细胞(后者程度更小)。不相关的多肽R4A显示出无抑制(见图51)。这些数据表明，2F5对所固定的3T3细胞的大部分反应性由蛋白-蛋白交互作用、而不是通过非特异性的脂质结合而定。因此，诸如KYNU的蛋白质可能是2F5的主要自配体。实施例5如上所述，本发明涉及一种疫苗策略，包括首先对表达可以产生成熟的广泛中和抗体的未突变祖先抗体的目标B细胞施用HIV包膜蛋白质(肽或多肽)，然后通过用所选择的HIV包膜蛋白质(肽或多肽)对经受体细胞成熟的B细胞进行加强而驱动B细胞克隆朝向所期望的中和广度的成熟。该策略的发展包括该成熟路线的重建。从产生广泛中和抗体·的患者中分离出所期望的最终(成熟)抗体，然后对其进行表征。推断各自的推定祖先抗体并将其表达成真实抗体，并测定它们与什么相结合。观念是，当使用适当的蛋白质(肽或多肽)触发时，表达未突变的“祖先抗体”和中间体抗体的B细胞将是亲和力成熟的，以产生在患者中可观察到的分泌广泛中和抗体的B细胞。交叉支系中和单克隆抗体CHOI、CH02、CH03、CH04和CH05的选择和分离将从主体707-01-021-9的冷冻PBMC中获得的大约30000个记忆B细胞进行筛选，发现有28个培养基可中和> 50%的CAP45感染性(图56)。从这些培养基孔中的四个(l-27-G2、l-27-Gll、l-19-F10 和 1-19-B7)中分离出单克隆抗体 CH01、CH02、CH03、CH04 和CH05 (CH01-05)(图 56)。对从在筛选时冷冻的之后用RNA处理的记忆B细胞中获得的可变重链和可变轻链进行扩增和测序。培养基1-27-G2和1-19-F10只包含一个配对(3 20A 3 20 ;分别为CHOl和CH02单克隆抗体)，这表明了培养基是单克隆的，并且CHOl和CH02是天然抗体。相反，1-27-G11和1-19-B7包含多个可变重链和可变轻链，这表明了培养基是寡克隆的。为了鉴别来自后者培养基的自然配对，对在最初筛选时收集的单细胞分选的记忆B细胞进行扩增并测序。CH03和CH04(均为3 20/ κ 3 20)是分别从培养基1-27-G11和1-19-Β7中分离出来的自然配对。通过连续的有限稀释来进一步扩增和克隆记忆B细胞大约4周，从培养基1-19-Β7中产生了人B细胞杂种细胞。通过这种方式，获得了 CH04天然抗体，并鉴定了 CH05，其由所扩增的记忆B细胞的较少群体产生，并且表达同样的CH04的3 20可变重链，但与不同的K I 6可变轻链配对。通过将可变重链和可变轻链对转染到293Τ细胞中而获得CH01-CH03单克隆抗体，并在 IgGl 主干中表达，如前所述(Liao 等人，J Virol Methods. 158(1-2) : 171-9 (2009))。单克隆抗体CH04和CH05却是从杂种细胞B细胞株中纯化出来。这些数据表明，该策略能够在大约2个星期内快速鉴定中和单克隆抗体，并最早在一个月内就能产生天然单克隆抗体。此外，该方法解决了与精确表征单克隆抗体有关的经典抗菌素展示库适用于在体内谱系中表示的天然抗体的不确定性。最后，首次报道了可广泛中和HIV-I的两种天然人类B细胞杂种细胞的产生。CH01-CH05抗体的基因组表征基于下列因素确定了 CH01-CH05抗体都是同一克隆家族中的成员，所述因素为
(I)V (D) J家族；(2) HCDR3的长度；(3) HCDR3区域和η-插入子的核苷序列。重链分析显示，CH01-CH05是IgGl抗体，共享相同的V 3 20*1/J2*01重排(表3)。它们还共享相同的D区域，其由3 10*1和20F15*2/inv区域的D-D融合产生(表3)。HCDR3为26个氨基酸的长度(表3)。N-插入子也具有相同的长度，并共享核苷组成，这与CH01-CH05单克隆抗体是克隆相关的观点一致(图57A)。CH04和CH05的可变重链序列相同(图57A)，这说明发生可变轻链外围编辑的时刻被截断了。表3 CH01-CH05VH和VL序列的主要特征
可变重链可变轻链
HCDR3 突变口灿功丨LCDR3
VD J长度率*同种型 V J M 长度突变率
CH3-3,
3-202 26 0.120 IgGl 3-20 I k 9 0.091
0120F15/inv
CH3~3
3-20， 2 26 0.118 IgGl 3-20 I k 9 0.116
0220F15/inv
CH3-3,
3-202 26 0.152 IgGl 3-20 I k 9 0.138
0320F15/inv
CH3~3
3-20’ 2 26 0.153 IgGl 3-20 Ik 9 0.110
0420F15/inv
CH3~3
3-20, 2 26 0.153 IgGl 1-6 2 k 9-
0520F15/inv*突变率根据从各单独的单克隆抗体的序列中独立地推断出来的推定回复未突变祖先的可变重链和可变轻链中计算。表面上对于可变重链来说，H01-CH04共享相同的VLk 3 20/JLk I重排(图57B)、相同长度(9个氨基酸)的LCDR3和相似的η-插入子(图57Β)。单克隆抗体CH05的可变轻链却是不相关的(图57C)，其具有不同的VLk 1/JL κ 2重排、IXDR3长度和η-插入子。可以预计，作为可变轻链与VH3 20链配对的生物学基础是VH3 20/VL κ 3 20链对(CH01-CH04)先于VH3 20/VL κ I 6对(CH05)，这是因为较高的VL κ数更接近于J κ基因座，因此，祖先抗体将必须首先重排VLk 3，然后重排VLk I。此外，低序号的Jk基因座必须在高序号的Jk基因座之前出来。因此，从VLk 3/JLk I至VLk 1/JLk 2的转变与简单编辑是一致的。最后，如图58所示且在下文讨论的系统树提供了进一步非常强有力的证据，就是VL κ 3/JL κ 2重排首先发生。接下来，通过构造可变重链的系统树(图58)来测定CH01-CH05单克隆抗体的遗传关系。为此，通过对所观察的抗体作为一个整体应用最大似然性分析来推断CH01-CH05抗体的推定的回复未突变祖先。使用这种方法预测了两种可能的RUA(0219-RUA1和0219-RUA2)，其差异只在于位置329处的单个沉默核苷取代(G或T)(图59)。还通过独立地分析每一个所观察的单克隆抗体来预测推定的RUA。通过这种方法鉴定了 9个RUA抗体候选一个用于CHOl (CH01-RUAI)，两个用于CH02 (CH02-RUA1和CH02-RUA2)，四个用于CH03 (CH03-RUAU CH03-RUA2、CH03-RUA3 和 CH03-RUA4)以及两个用于 CH04 (CH04-RUA1 和CH04-RUA2)。图59显示了所有计算出的推定RUA的比对。可变重链的系统树(图58)显示了 CH02和CH03在遗传上彼此相邻，而CH03是家族中的最大体细胞突变的单克隆抗体。综合起来，这些数据表明，CH01-CH05是克隆相关的严重体细胞突变的单克隆抗体，它们共享长的HCDR3，并具有D-D融合重排。此外，这是对在人类中编辑的外周轻链的首次记述。CH01-CH05单克隆抗体广泛地中和2级HIV-I分离物并结合至有限的一组单体gpl20/gpl40 HIV-I 包膜蛋白。
对一组96份HIV-I初级分离物测试CH01-CH05抗体的中和广度。该组包括4份IA级分离物，3份IB级分离物(2份支系B和I份支系AE)，以及89份2级分离物(包括10份支系A、21份支系B、27份支系C、4份支系D、7份支系G、I份支系AE、I份支系AD、9份CRFO 1_AE 和 9 份 CRF02_AG 病毒)。如遗传分析所预测的那样，CH01-CH05共享非常相似的中和模式(表4)。所有抗体都中和了来自多个支系的病毒，中和广度从CHOl的44. 9% (43/96分离物)至CH02的34. 7% (33/95 分离物)。CH03、CH04 和 CH05 分别中和了 43. 2% (41/95) ,43. 2% (41/95)和44. 2% (42/95)的分离物。没有抗体中和了 IA级分离物。IB级分离物只被CHOl (2/3)、CH02和CH03(l/3)中和，但不被CH04或CH05中和。相反，CH01-CH05显示出针对2级病毒更大的中和广度。CHOl优先中和CRF02_AG分离物(7/9 ；77. 8% )，然后是支系A(7/10 ；70% ), CRFO 1_AE(5/9 ；55. 6% )、支系 B(9/21 ；42. 9% )、支系 C(ll/27 ；40. 7% )和支系G(l/7 ;14. 3% )分离物。支系D病毒不被中和。相反，重要的是需要注意，CH01-CH05单克隆抗体强烈地中和AE. CM244. eel (表4)。2级病毒相比于I级病毒的优先中和是重要的，因为先前的工作证明了易于中和的I级分离物的广泛中和不会转变成针对较难于中和的2级分离物的广度，因此这些种类的抗体在预防或控制HIV-I感染中只有有限的帮助。
权利要求
1.一种用于在主体中诱导针对HIV-ι的广泛中和抗体的产生的方法，包括 i)对所述主体施用结合至生殖系B细胞受体的非HIV-I抗原，所述非HIV-I抗原在能产生会分泌与HIV-I Env交叉反应的抗体的B细胞的中间体克隆的量和条件下施用，和 )对所述主体施用HIV抗原，其在能产生会分泌所述广泛中和抗HIV-I抗体的初始B细胞或B细胞的所述中间体克隆的量和条件下施用。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述主体是人。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非HIV-I抗原是脂质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脂质是心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰肌醇、鞘磷脂或其衍生物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脂质是I-棕榈酰基-2-油酰基-sn-丙三基-3- [L-磷酸丝氨酸](POPS)、I-棕榈酰基_2_油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脂质是磷脂的六角II相。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非HIV-I抗原是藻红蛋白(PE)、C-藻蓝蛋白(C-PC)、去铁铁蛋白，或者厌氧或需氧的肠道菌群或其组分。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非HIV-I抗原包括细菌或真核生物的RNA聚合酶核心蛋白的α亚单元。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非HIV-I抗原是犬尿氨酸酶(KYNU)或其抗原片段。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述KYNU是在CHO或293Τ细胞中表达的重组体KYNU，或者是其抗原片段。
11.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括施用佐剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述佐剂是基于鲨鱼烯的佐剂、TRL激动剂、寡核苷酸(oCpG)或R848。
13.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述HIV-I抗原是近膜端外部区(MPER)抗原或其变体。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述HIV-I抗原是如图16B、16C、17、.18、20、25或26所示的免疫原。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述变体是具有L669S突变的MPER表位肽。
16.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述HIV-I抗原是传输首建HIV-IEnv或其抗原片段。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述片段包括gpl20的一部分CD4结合位点、MPER序列，或者包括gpl20的V2或V3区域的gpl20的一部分。
18.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法通过对所述主体施用包括所述非HIV-I抗原的初次免疫，随后施用一次或多次包括所述HIV-I抗原的加强免疫来实现。
19.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非HIV-I抗原包括脂质、厌氧或需氧的肠道菌群细菌的成分、藻胆蛋白或KYNU或其片段，而所述HIV-I抗原包括选自来自Malawi 的传输首建 Envl086. C、来自 Malawi 的 089. C、来自 U. S.的 040_C9 和来自 Clade B急性HIV-I感染的美国患者的63521。
20.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非HIV抗原或所述HIV抗原包括蛋白质，对所述主体施用编码所述蛋白质的DNA序列，施用条件是所述DNA序列被表达并且因此产生所述蛋白质。
21.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，施用A244gD+包膜作为初次免疫，而施用与CHOI、CH02、CH03、CH04或CH05结合的包膜作为加强免疫。
22.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非HIV-I抗原存在于带有所述HIV-I抗原和至少一种佐剂的脂质体中。
23.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述非HIV-I耦合至所述HIV-I抗原上，并与一种或多种佐剂配制。
24.一种选自CHOI、CH02、CH03、CH04和CH05的抗体，或结合有其片段的抗原。
全文摘要
本发明大体上涉及用于HIV接种疫苗的免疫原，更具体地涉及通过使用HIV包膜和非HIV免疫原的组合物靶向B细胞生殖系和克隆中间体来诱导预防性抗HIV抗体的产生的方法。本发明还涉及适合用于这样的方法中的组合物。
文档编号A61K39/42GK102892783SQ201180021030
公开日2013年1月23日 申请日期2011年2月25日 优先权日2010年2月25日
发明者巴顿·F·海恩斯, H·X·廖, 乔治娅·托马瑞斯, 托马斯·B·开普勒, K·K·黄, S·穆内尔·阿拉姆, Y·刘, T·麦特·霍尔, G·杨, 加内特·凯尔索, 马蒂亚·邦西尼奥里 申请人:杜克大学