基于肽的体内siRNA递送系统的制作方法
【专利摘要】本发明是针对用于在体内将RNA干扰(RNAi)多核苷酸靶向递送至肝细胞的组合物。靶向性RNAi多核苷酸是与联合靶向的蜂毒素递送肽一起施用。递送肽提供用于将所述RNAi多核苷酸自该细胞外部移动至该细胞内部的膜渗透功能。可逆修饰提供对所述递送肽的生理响应。
【专利说明】基于肽的体内SiRNA递送系统
【背景技术】
[0001]将多核苷酸及其它实质上细胞膜不可渗透性化合物向活细胞内的递送高度受限于细胞的复杂膜系统。用于反义、RNAi及基因疗法的药物是相对较大的亲水性聚合物且常带较高负电荷。这两种物理特征都严重限制这些药物跨细胞膜直接扩散。因此，多核苷酸递送的主要障碍是多核苷酸跨细胞膜向细胞质或核的递送。
[0002]已用于体内递送小核酸的一种手段是将核酸连接于小靶向分子或者脂质或固醇。尽管用这些共轭物已观测到一定的递送及活性，但利用这些方法所需要的极大核酸剂量是不切实际的。
[0003]也已开发出能在体外实现适度有效递送多核苷酸至细胞内的众多转染试剂。然而，使用这些相同转染试剂在体内传递多核苷酸很复杂且因体内毒性、不利的血清相互作用或不良靶向而变得无效。在体外良好作用的转染试剂、阳离子聚合物及脂质通常形成较大的阳离子静电粒子且使细胞膜去稳定。体外转染试剂的正电荷有助于通过电荷-电荷(静电)相互作用与核酸缔合，由此形成核酸/转染试剂复合物。正电荷亦有益于载体非特异性结合细胞且有益于膜融合、去稳定或破坏。膜的去稳定有助于实质上细胞膜不可渗透性多核苷酸跨细胞膜传递。尽管这些性质有助于体外核酸转移，但其会在体内引起毒性及无效靶向。阳离子电荷导致与血清组分相互作用，引起多核苷酸-转染试剂相互作用的去稳定、不良生物可用性及不良靶向。转染试剂在体外可有效的膜活性常常在体内导致毒性。
[0004]对于体内递送，载体(核酸及相关递送剂)应较小，直径小于IOOnm且优选小于50nm。小于20nm或小于IOnm的更小的复合物将更有用。大于IOOnm的递送载体在体内极少达到除血管细胞以外的细胞。通过静电相互作用形成的复合物在暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或分开。此外，体内递送载体上的阳离子电荷导致不利的血清相互作用且因此导致不良的生物可用性。有趣的是，高的负电荷亦可通过干扰靶向所必需的相互作用即靶向性配体与细胞 受体的结合来抑制靶向性体内递送。因此，体内分布及靶向需要接近中性的载体。在不仔细调控的情况下，当体内使用时，膜破坏或去稳定活性是毒性的。在体外比在体内更易于平衡载体毒性与核酸递送。
[0005]Rozema等人在美国专利公开20040162260中说明一种可逆调控膜活性聚胺的膜破坏活性的手段。膜活性聚胺提供一种破坏细胞膜的手段。PH依赖性可逆调控提供一种限制进入靶细胞内体的活性由此限制毒性的手段。其方法依赖于聚胺上用2-丙酸-3-甲基顺丁烯二酸酐进行的胺修饰。
[0006]
【权利要求】
1.一种用于体内递送RNA干扰多核苷酸至肝脏细胞的共轭物递送系统组合物，其包含:RNA1-A+ 蜂毒素-(L-Gal)x 其中， 蜂毒素是蜂毒素肽: L是生理上不稳定的键， Gal是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)配体， X是整数，数值大于蜂毒素伯胺的80%， RNAi是RNA干扰多核苷酸，且 A为具有至少20个碳原子的疏水性基团或半乳糖簇。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述RNA干扰多核苷酸选自下组:DNA、RNA、dsRNA、siRNA 及微 RNA。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述肝脏细胞由肝细胞组成。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述ASGPr配体可逆连接于多个蜂毒素肽上至少90%的胺上。
5.如权利要求1所述的 组合物，其中所述蜂毒素肽选自下组:Seq.1Dl、Seq.1D7、Seq.1DlUSeq.1D51、Seq.1D57 及 Seq.1D58、Seq.1D92 和 Seq.1D96。
6.如权利要求1所述的组合物，其中该蜂毒素肽由D型氨基酸组成。
7.如权利要求1所述的组合物，其中L为双取代的顺丁烯酰胺酸酯。
8.如权利要求1所述的组合物，其中L为酰胺基苯甲基氨基甲酸酯。
9.如权利要求7所述的组合物，其还包含共价连接于所述蜂毒素肽的氨基末端的聚乙二醇(PEG)。
10.如权利要求7所述的组合物，其还包含共价连接于所述蜂毒素肽的氨基末端的ASGPr配体-PEG共轭物。
11.如权利要求8所述的组合物，其还包含共价连接于所述蜂毒素肽的氨基末端的聚乙二醇(PEG)。
12.如权利要求8所述的组合物，其还包含共价连接于所述蜂毒素肽的氨基末端的ASGPr配体-PEG共轭物。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述ASGPr配体选自下组:乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺及N-异丁酰基半乳糖胺。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述RNAi是通过生理上不稳定的键L2连接于A。
15.如权利要求14所述的组合物，其中L2与L正交。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述半乳糖簇由N-乙酰基半乳糖胺三聚体组成。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述疏水性基团由胆固醇组成。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是在药学上可接受的载体或稀释剂中提供。
19.一种抑制基因表达的方法，所述基因在哺乳动物肝脏细胞内表达，所述方法包括: a)形成序列与所述基因的部分序列一致或接近一致的RNAi多核苷酸；以及 a)向所述哺乳动物的脉管内注射入权利要求1所述的组合物。
20.一种制造RNA干扰多核苷酸递送组合物的方法，所述方法包含: a)形成蜂毒素肽: b)形成多个不带电荷的掩蔽剂，其各自包含共价连接于双取代的顺丁烯二酸酐或二肽酰胺基苯甲基的胺反应性碳酸酯的ASGPr配体； c)用步骤b所述掩蔽剂修饰蜂毒素肽群体上超过80%的伯胺， d)将所述RNA干扰多核苷酸连接于具有至少20个碳原子的疏水性基团或半乳糖三聚体； f)将所述RNA干扰多核苷酸 及经修饰的蜂毒素肽以适于体内施用的溶液形式提供。
【文档编号】A61K31/713GK103547272SQ201180059394
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2011年12月16日 优先权日:2010年12月17日
【发明者】D·B·罗泽玛, D·L·刘易斯, D·H·维基菲尔德, E·基塔斯, P·海德威格, J·A·沃尔夫, I·鲁尔, P·莫尔, T·霍夫曼, K·杨-霍夫曼, H·M·穆勒, G·奥托, A·V·布罗金, J·D·本森, J·C·卡尔森 申请人:箭头研究公司