专利名称：新型可降解聚合物为载体的抗乳腺癌Her2疫苗的制作方法
技术领域：
本发明公开了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征包括将HER2/neu342-350多肽和E75多肽囊缩到聚乳酸-羟基乙酸共聚物形成的纳米颗粒中，形成大小约500纳米到2微米之间的纳米疫苗。这样的疫苗能高效的被抗原递呈细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)摄取，从而能显著提高her2抗原肽的免疫原性。
背景技术：
:每年约有120万妇女发生乳腺癌，约50万妇女死于乳腺癌。北美、北欧是乳腺癌的高发地区，其发病率约为亚非拉国家的4倍。我国虽是乳腺癌的低发地区，但其发病率正在逐年上升，发病的增长速度却高出高发国家I到2个百分点，尤其是沪、京、津及沿海地区是我国乳腺癌的高发区。更令人担忧的是，与西方国家比较，我国乳癌患者发病年龄较轻，发病高峰年龄在40-49岁，比西方妇女早10-15年。基于严峻的形势，乳腺癌的治疗与防复发引起了人们的广泛关注。乳腺癌的传统治疗方法:1.手术治疗:手术适应症Halsted首创乳癌根治术，因手术合理，疗效明确，近百年来成为人们治疗乳癌所遵循的标准方式。近半个世纪以来，对乳癌术式进行了不少探索性修改，总的趋势不外保守和扩大两方面，至今仍争论不休。乳房局部切除和全乳切除是保守手术的代表性手术。2.放射治疗:可以提高手术切除率使部分不能手术的患者再获手术机会，由于放射抑制了肿瘤细胞的活力可降低术后复发率及转移率从而提高生存率，由于放射延长了术前观察时间有使部分已有亚临床型远处转移的病例避免一次不必要的手术。3.化疗:通过化疗科尽早控制微转移灶使原发癌及其周围扩散的癌细胞产生退变或部分被杀灭以减少术后复发及转移，进展期乳癌以及炎症型乳癌限制了手术治疗的实施术前化疗可使肿瘤缩小以便手术切除，可以根据切除肿瘤标本评价术前化疗效果作为术后或复发时选择化疗方案的参考。4.乳腺癌的最新治疗方法:肿瘤生物治疗技术是近年来因生物技术发展而兴起的一种全新的肿瘤治疗手段，被认为是除了手术、化疗、放疗之外的第四种肿瘤治疗模式，具有副作用小、抗肿瘤活性高、适应症广等特点。将生物技术用于肿瘤治疗是提高和改变患者自身机体免疫功能的治本的方法，被认为是攻克肿瘤的最终办法，其应用前景广阔。自从人类肿瘤分子特征的提高导致肿瘤相关抗原可以被人体的T淋巴细胞所识别后，发展抗肿瘤疫苗已成为一种趋势。肿瘤的疫苗是通过诱导肿瘤患者自身的免疫监测和杀瘤功能，有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤，预防复发和转移和最终根治肿瘤的目的，具有特异性强，副作用轻等特点，正逐步成为肿瘤综合治疗中的一个重要环节，也是当前肿瘤治疗基础研究和临床应用的热点与发展方向
发明内容
:一种新型的抗乳腺癌Her2多肽疫苗的研制方法，其特征包括将HER2/neu342-350多肽和E75多肽等抗原肽囊缩到聚乳酸 -羟基乙酸共聚物形成的纳米颗粒中，形成大小约500纳米到2微米之间的纳米疫苗，这样的疫苗能高效的被抗原递呈细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)摄取，从而显著提高her2抗原肽的免疫原性，该疫苗的研制方法为:①通过固相方法合成HER2/neu 342-350多肽和E75多肽，具体固相合成步骤是氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团Fmoc-保护的氨基酸共价连接在固相载体上，20% pipe的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了，DIEA提供一个碱性的反应环境，HBTu作为缩合剂，将第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽，重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，脱去保护基Fmoc-，水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽；②多肽在可降解聚合物纳米颗粒中的囊缩，取0.6ml含多肽的水溶液(10mg/mlin PBS),加入到4mlPLGA的二氯甲烷溶液中(15mg PLGA/ml 二氯甲烷)，用探头式的超声波破碎仪超声乳化40秒，乳化过程中用冰浴冷却，然后将此乳浊液加入到60ml含聚乙烯醇的水溶液中(2.5wt%PVA的水溶液)，超声乳化2分钟，然后搅拌过夜，让有机溶剂挥发干净，3000g低速离心25分钟去掉大颗粒，然后21000g超速离心25分钟收集产物，洗三次，冻干得到纳米疫苗。
具体实施方式
:实施例1:合成新型树枝状化合物载体的抗乳腺癌Her2疫苗1.固相合成Her2抗原肽2.1.称取树脂于DCM( 二氯甲烷)，氩气鼓动5min ；2.2.称取 Fmoc-Leu-OH 0.3mmol ；2.3.Fmoc-Leu-OH: DIEA = 1: 2 (n) IS气鼓动 90min ；2.4.DCM 洗涤 5 次(次 /min)；2.5.封闭树脂活性 DCM: DIEA: MeOH = 3.4ml: 0.2ml: (X4ml 氩气鼓动IOmin ；2.6.DCM洗涤5次(次/min)，再DMF (二甲基甲酰胺)洗涤5次(次/min)，后20% pipe30min ；2.7.20% pipe洗涤一次，再DMF洗涤5次(次/min)，以脱出白色Fmoc粉末为宜；2.8.Fmoc-Met-OH (0.3mmol): HBTu: DIEA=I: I: 2 (η)氩气鼓动 90min ;2.9.DMF 洗涤 5 次(次 /min)；2.10.20% pipe IS气鼓动 30min ；2.11.20% pipe洗漆一次,DMF洗漆5次(次/min);依次加入后续Fmoc-氨基酸，重复8-12的操作，按文献顺序连接多肽，最后用95% TFA, 2.5% H20，2.5% TIS将合成好的肽段与固相树脂脱离。2.抗原多肽在可降解聚合物PLGA纳米颗粒中的囊缩。2.1配置抗原多肽的PBS水溶液(10mg/ml in PBS)2.2配置可降解聚合物PLGA的二氯甲烷溶液(15mg PLGA/ml 二氯甲烷)2.3取0.6ml含多肽的水溶液，加入到4ml PLGA的二氯甲烷溶液中2.4用探头式的超声波破碎仪超声乳化40秒，乳化过程中用冰浴冷却。2.5将此乳浊液加入到60ml含聚乙烯醇的水溶液中(2.5wt% PVA的水溶液)，超声乳化2分钟.
2.6搅拌过夜，让有机溶剂挥发干净。2.7在3000g下低速离心25分钟去掉大颗粒.
2.8在21000g下超速离心25分钟收集产物，洗三次，冻干得到纳米疫苗。·
权利要求
1.一种新型的抗乳腺癌Her2多肽疫苗的研制方法，其特征包括将HER2/neu 342-350多肽和E75多肽等抗原肽囊缩到聚乳酸-羟基乙酸共聚物形成的纳米颗粒中，形成大小约500纳米到2微米之间的纳米疫苗，这样的疫苗能高效的被抗原递呈细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)摄取，从而显著提高her2抗原肽的免疫原性，该疫苗的研制方法为:①通过固相方法合成HER2/neu 342-350多肽和E75多肽，具体固相合成步骤是氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团Fmoc-保护的氨基酸共价连接在固相载体上，20% pipe的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了，DIEA提供一个碱性的 反应环境，HBTu作为缩合剂，将第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽，重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，脱去保护基Fmoc-，水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽；②多肽在可降解聚合物纳米颗粒中的囊缩，取0.6ml含多肽的水溶液(10mg/ml in PBS)，加入到4ml PLGA的二氯甲烷溶液中(15mg PLGA/ml 二氯甲烷)，用探头式的超声波破碎仪超声乳化40秒，乳化过程中用冰浴冷却,然后将此乳浊液加入到60ml含聚乙烯醇的水溶液中(2.5wt%PVA的水溶液)，超声乳化2分钟，然后搅拌过夜，让有机溶剂挥发干净，3000g低速离心25分钟去掉大颗粒，然后21000g超速离心25分钟收集产物，洗三次，冻干得到纳米疫苗。
2.根据权利要求1所述的PLGA肽囊的抗乳腺癌纳米疫苗的制备方法，其特征在于:将Her2多肽囊缩到可降解聚合物PLGA中，制成粒径在500纳米到2微米之间的纳米疫苗，可显著提高抗原肽的免疫原性。
3.根据权利要求1所述的PLGA肽囊的抗乳腺癌纳米疫苗的制备方法，其特征在于:所使用的Her2蛋白上的抗原肽包括HER2/neu 342-350多肽和E75多肽。
4.根据权利要求1所述的PLGA肽囊的抗乳腺癌纳米疫苗的制备方法，其特征在于:Her2抗原肽纳米疫苗制备过程中，将合成好的Her2抗原肽通过双乳化的方式囊缩到可降解的聚合物PLGA中。
全文摘要
本发明公开了新型抗乳腺癌多肽疫苗的研制方法，其特征包括将HER2/neu 342-350多肽和E75多肽囊缩到聚乳酸-羟基乙酸共聚物形成的纳米颗粒中，形成大小约500纳米到2微米之间的纳米疫苗。这样的疫苗能高效的被抗原递呈细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)摄取，从而能显著提高her2抗原肽的免疫原性。我们通过纳米技术对Her2抗原肽进行处理，将其囊缩到纳米大小的由可降解聚合物PLGA制成的纳米颗粒中。该纳米疫苗在体内能被抗原递呈细胞巨噬细胞和树突状细胞高效摄取，具有很强的免疫原性，且PLGA可降解聚合物作为FDA批准的药用辅料，在体内可以完全降解，无毒性。该纳米疫苗制备简单，物理性质稳定，免疫原性高，可同时刺激体液免疫和细胞免疫，是理想的抗乳腺癌的Her2疫苗。
文档编号A61K39/00GK103191419SQ20121000116
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者洪章勇, 尹芝南 申请人:南开大学