专利名称：一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种肾小球硬化模型的建立方法，具体地，涉及一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法。
背景技术：
IgA肾病是以肾小球系膜区IgA沉积为特征的肾小球肾炎，有学者将其归为系统性疾病的范畴，但大多数学者将IgA肾病分为原发和继发，常见的继发性IgA肾病为紫癜性肾炎、狼疮性肾炎和乙肝/肝硬化相关性肾炎。IgA肾病是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病，即使是IgA肾病发病率比较低的美国，20 -39岁的成人中，IgA肾病仍占原发性肾小球病的第一位。由于IgA肾病具有多样的临床表现、复杂的病理改变和不同的预后， 越来越多的学者认为IgA肾病不是单一的疾病，而是一个综合征。过去认为IgA肾病是一种预后良好的疾病，现在认为IgA肾病是一种进展性疾病， 只有5 %-30%的IgA肾病患者尿检异常能完全缓解，大多数患者呈慢性进行性发展。从首发症状起，每10年约有20 %的患者发展到终末期肾病。关于IgA肾病进展的危险因素，学术界意见比较一致的是肾小球硬化、肾间质纤维化、高血压、大量蛋白尿和肾功能损害。由于肾小球硬化和肾间质纤维化是不可逆的损害，因此是预后不良的强力危险因素。对IgA肾病的确切发病机理目前尚未清楚，因此，针对本病的发生缺乏特异性的治疗。由于肾纤维化是本病进展至终末期肾脏病的中间环节，因此如何阻断或延缓肾纤维化的发生及发展是目前学术界关注的热点。应用比较生物学的方法，建立适当的动物模型， 不仅能促进药物作用机制的研究和临床药物开发，而且为研究IgA肾病的病因、发病机制和病理生理改变提供重要线索。目前，有关IgA肾病动物模型根据建立方法不同可基本分为诱发性，继发性，复合性，自发性和基因工程性等五类
1.诱发性IgA肾病动物模型。本类型模型出现最早，并且被广大肾脏病研究人员广泛采用，根据其诱导方法又可初步分为以下几类免疫复合物诱导、微生物及其成分诱导、异种蛋白诱导。国外较为经典的模型是利用差速离心法提取副流感嗜血杆菌外膜蛋白抗原，经口服免疫或腹腔注射以诱发小鼠IgA肾病。病理检查发现口服抗原40周、腹腔注射30周均可有肾小球内IgA沉积，实验动物同时出现蛋白尿，IgA沉积与系膜增生程度相关。国内较为经典的模型是刘志红制作的金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)诱发的 IgA肾病模型和韩庆烽制作的大肠杆菌诱发的IgA肾病模型，他们分别从肠道感染等角度对IgA肾病的发病机理作出探讨。韩庆烽等实验表明，BALB/c小鼠经腹腔注射大肠杆菌全细胞或细胞壁成分后可以出现肾小球系膜区IgA为主的免疫沉积及电子致密物的沉积，即出现IgA肾病的病理学改变，但实验中未出现系膜区C3的沉积，同时实验小鼠也未出现蛋白尿或血尿。异种蛋白诱导，一般使大(小)鼠口服牛血清白蛋白(BSA)，常与其他方法联合应用，例如BSA加尾静脉注射葡萄球菌肠毒素(SEB)复合感染法、BSA合并行肝左叶部分切除， 其基本原理可能为SEB静脉注射后通过损伤肠壁毛细血管内皮使肠粘膜的通透性增加，或人为破坏部分肝脏清除IgA能力，以增强食物抗原BSA刺激机体IgA分泌量增加，清除量减少，最终增强IgA在肾脏的沉积。2.继发性IgA肾病动物模型。继发病变型主要指某些全身性疾病发展时可导致肾内IgA免疫复合物沉积，出现 IgA肾病的临床表现。此类模型多采用肝脏切除或诱导动物肝硬化的方法使肝脏IgA清除减少，另外狼疮性肾炎、过敏性紫癜肾炎也可见到继发性系膜区IgA沉积，但由于继发性肾脏改变常受原发病的影响，限制了其实际应用。3.复合性IgA肾病动物模型。本类模型系综合采用不同种类诱导方法制作，例如刘志红等制作的继发于肝硬变的IgA肾病混合模型，分别腹腔注射10%四氯化碳，尾静脉注射SEB，结果发现出现肾脏IgA 沉积，并且出现较重蛋白尿。4.自发性IgA肾病动物模型。人类IgA肾病具有一定的家族遗传倾向，其发病可能与血管紧张素转换酶等多种基因多态性有关。与之类似，自发病变型IgA肾病动物模型中某些纯系动物具有IgA肾病易感性，有学者将HIGA小鼠施行部分肾切除，结果这些小鼠出现进行性肾小球硬化，局部 TGF-β升高，该模型被认为可用于研究进行性硬化性IgAN。5.基因工程IgA肾病动物模型。利用转基因、基因敲除、基因替换等手段，使用某种或某些遗传性状通过基因工程技术而被人为改造过的动物制作IgA肾病动物模型是近年来这一领域的新兴前沿。较有代表性的有子宫蛋白缺陷模型、Fl-bcl-2转基因小鼠模型、FcaRI (⑶89)转基因小鼠模型等， 他们分别证实了 IgA肾病发病的某方面因素，并在一定程度上发生了 IgA肾病特征的病理改变。由于实验动物与人类的差异性，且对于IgA肾病的病因至今尚无确切解答，因此目前存在的多种IgA肾病实验动物模型很难完全令人满意。例如，继发性和混合性模型搀杂了较多其他因素，不能很好的模拟IgA肾病原发过程；基因工程性模型和自发性模型价格过于昂贵价格，国内难以推广等等。目前，只有SEB (或以SEB为主)诱导的模型接近人类 IgA肾病发病过程，反映其部分病理改变特点，但是该模型的不足之处在于肾小球纤维化形成的时间较长。进一步探索、寻找一种近似人类IgA肾病发病规律并且肾纤维化出现时间早的动物模型无疑是IgA肾病研究过程当中一个迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于IgAN肾小球硬化模型的建立方法，将采用微生物和复合蛋白共同进行诱导的复合感染法和通过部分肾切除建立自发性肾小球硬化动物模型的方法相联合，并对该造模方法进行检验。为了达到上述目的，本发明提供了一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，该方法包含以下步骤步骤1，选取SD (Sprague Dawley)雄性大鼠饲养1周后，隔日给予牛血清蛋白(BSA)酸化水溶液灌胃，第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素(SEB)溶液以及从腹腔注射完全弗氏佐剂(一种免疫佐剂，成分为石腊油+羊毛脂+ 卡介苗)；步骤2，将步骤1所得的大鼠在第5周和第6周分两次进行手术肾切除，两次手术共切除肾脏的5/6。上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步骤1所述的牛血清蛋白酸化水溶液的浓度为40mg/ml，隔日给药一次，给药周期为第1_15周，即在第1_15周给药。上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步骤1所述的金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液浓度为0. 08mg/ml，每周给药一次，给药周期为第2_4周，即在第2_4周给药。上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步骤1所述的完全弗氏佐剂剂量为0. 2ml/只.qw，给药周期为第2_4周，即在第2_4周、每周给药一次、每只给药0. 2ml (qw 每周一次，每次时间固定)。上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，步骤2所述的两次手术肾切除，第一次手术切除左肾的2/3，一周后行第二次手术，切除右肾。上述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其中，所述的建立方法还包含对IgAN肾小球硬化大鼠模型建立的检验方法，包含进行大鼠血清尿素氮(BUN)、血肌酐 (Scr)、血清胱抑素C (血清CysC)、尿沉渣红细胞测定(尿沉渣RBC测定)、M小时尿蛋白定量(24hUP)、尿胱抑素C (尿CysC)的动态变化数据的测定，以上数据均增加，即出现血尿、 蛋白尿现象，则说明所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型已建立。其中，血清尿素氮、血肌酐通过全自动生化分析仪测定，血清胱抑素C通过ELISA法测定，尿沉渣红细胞测定通过尿沉渣仪，24小时尿蛋白定量通过考马斯亮蓝法测定，尿胱抑素C通过ELISA法测定。本发明具有以下优点
通过本发明所采用方法建立的IgAN肾小球硬化模型，其肾小球IgA沉积的强度及硬化发生的时间早于目前国内外常用的复合感染的方法。由于缩短了模型制作时间、强化了纤维化的发生、发展，故该模型能够更好地服务于IgA肾病医学科研工作，缩短实验周期，并在此基础上探讨相关药物延缓或逆转IgAN肾小球硬化发生发展，推迟其进入终末期肾脏病的时间，进而减少透析所带来的巨额医疗开支。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
作进一步地说明。实施例一
1.复合感染。将SD雄性大鼠适应性饲养1周后，开始隔日给予40mg/ml BSA酸化水溶液灌胃， 第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射SEB 0. 08mg/ml. qw和从腹腔注射完全弗氏佐剂0. 2ml/ 只· QWo2. 5/6 肾切除。第五周进行左肾2/3切除，麻醉后取俯卧位固定于手术台上，在背部手术区常规消毒，铺巾，取背左侧直切口切开皮肤，分开腰大肌，进入腹膜后，找到肾脏，并用止血钳分离肾周围脂肪囊和肾蒂，逐层切开皮下组织和包膜，特别小心的分离开肾上腺，避免损伤， 充分暴露左侧肾脏，暴露肾蒂，用纤维止血钳夹住肾蒂，用眼科手术剪分别剪除左肾上下个1/3左右皮质，用吸收性明胶海绵压迫止血，开止血钳，观察有无出血，复位残肾，腹腔注入青霉素预防感染，关闭腹腔，缝合肌肉和皮肤，术后常规给予青霉素肌肉注射3d，喂水并观察。一周后，即第6周行第二次手术，将右肾切除。同样充分暴露右侧肾脏后，用止血钳在肾门下夹闭肾蒂，摘除肾脏，然后清理腹腔，提取未剪除的肾蒂结扎线头，并将结扎的肾蒂放入腹腔。确定无出血后剪短结扎线头，腹腔注入青霉素，关腹，缝合。术后常规给予青霉素肌肉注射。两次手术共切除5/6的肾脏，手术全过程均有一人执刀完成。实施例二
1. IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立。将SD雄性大鼠96只适应性饲养1周后，根据体重按随机数字表分为4组，即假手术组(A组)、5/6肾切除组(B组)、复合感染组(C组)、复合感染联合5/6肾切除组(D组) 各组M只。(1) . A组假手术组，灌胃和静脉注射时给予等量的生理盐水，进行假手术，即大鼠腹腔注射麻醉药后，游离双侧肾脏、剥离肾周脂肪后，将肾脏复位，其余操作与实施例一中5/6肾切除方法相同。(2). B组5/6肾切除组，灌胃和静脉注射时均给予等量的生理盐水，5/6肾切除操作过程与实施例一中相同。(3). C组复合感染组，对该组动物进行复合感染，具体操作与实施例一中复合感染部分相同。(4). D组复合感染联合5/6肾切除，具体操作与实施例一相同。2. IgAN肾小球硬化大鼠模型的检验。(1).观察第0、4、8、12周大鼠血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)和血清胱抑素C (血清CysC)的动态变化情况。血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)，采用全自动生化分析仪(HITACHI 7600-010) 进行检测，日本HITACHI公司生产。血清胱抑素C (血清CysC)的检测方法为ELISA法。所得结果如下所示。表1 不同时间点血清BUN的结果(Z 士S)。
权利要求
1.一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，该方法包含以下步骤 步骤1，选取大鼠饲养1周后，隔日给予牛血清蛋白酸化水溶液灌胃，第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液以及从腹腔注射完全弗氏佐剂；步骤2，将步骤1所得的大鼠在第5周和第6周分两次进行手术肾切除，两次手术共切除肾脏的5/6。
2.如权利要求1所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，步骤1所述的牛血清蛋白酸化水溶液的浓度为40mg/ml，隔日给药一次，给药周期为第1_15周。
3.如权利要求1或2所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，步骤 1所述的金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液浓度为0. 08mg/ml，每周给药一次，给药周期为第 2-4 周。
4.如权利要求3所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，步骤1所述的完全弗氏佐剂剂量为0. 2ml/只.qw，即每周给药一次、每只大鼠给药0. ^il,给药周期为第2-4周。
5.如权利要求1所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，步骤2所述的两次手术肾切除，第一次手术切除左肾的2/3，一周后行第二次手术，切除右肾。
6.如权利要求1所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，其特征在于，所述的建立方法还包含对IgAN肾小球硬化大鼠模型建立的检验方法，包含进行大鼠血清尿素氮、血肌酐、血清胱抑素C、尿沉渣红细胞测定、M小时尿蛋白定量以及尿胱抑素C的动态变化数据的测定，以上数据均增加，说明所述的IgAN肾小球硬化大鼠模型已建立。
全文摘要
本发明公开了一种IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，该建立方法包含步骤1，选取大鼠饲养1周后，隔日给予牛血清蛋白酸化水溶液灌胃，第2-4周每周从大鼠阴茎静脉注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素溶液以及从腹腔注射完全弗氏佐剂；步骤2，将步骤1所得的大鼠在第5周和第6周分两次进行手术肾切除，两次手术共切除肾脏的5/6。本发明提供的IgAN肾小球硬化大鼠模型的建立方法，缩短了IgAN肾小球硬化大鼠模型的制作时间、并强化了肾组织纤维化的发生、发展，故该模型能够更好地服务于IgA肾病医学科研工作。
文档编号A61K39/39GK102499179SQ20121000257
公开日2012年6月20日 申请日期2012年1月6日 优先权日2011年11月24日
发明者付文成, 刘育军, 吴芳, 姚卫国, 彭文, 朱冰冰, 李琦, 殷佩浩, 王云满, 王浩, 程蔚蔚, 金周慧 申请人:上海市普陀区中心医院