专利名称：一种基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及显微成像(micro CT)领域，更具体地讲，涉及ー种新型的微血管造影剂。
背景技术：
CT (Computed Tomography)技术利用的原理是当X射线透过样本吋，样本的各个部位对X射线的吸收率不同，最终在检测器上成像。显微CT(micro computed tomography, 微计算机断层扫描技术)，是ー种非破坏性的3D成像技木，可以在不破坏样本的情况下清楚了解样本的内部显微结构。它与普通CT最大的差别在于分辨率极高，可以达到微米 (μπι)级别，因此具有良好的“显微”作用。显微CT可用于医学、药学、生物、考古、材料、电子、地质学等各个领域的研究。近年来，显微CT (micro CT)技术在医学上的应用发展十分迅速。由于其极高的空间分辨率，使得对组织、器官、甚至微血管网络的研究提供了更加直观的呈现。在肿瘤学领域，利用微血管造影技术辨别是否存在血管生成，从而为病情的确诊提供依据。与普通CT 技术不同，直接使用显微CT造影难以提供足够的对比度来分辨血管。因此，在成像过程中造影剤的使用尤其重要。造影剤(又称对比剂，contrast media)是为增强影响观察效果而注入到组织或器官的化学制品。这些制品的密度高于或低于周围的器官、组织，可将形成的对比用图像显示。X射线观察常用的造影剤有碘制剂、硫酸钡等。羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是ー种生物活性陶瓷材料，它在近代生物医学工程学领域受到越来越广泛的关注。其組成和结构与脊椎动物骨骼、牙齿中的无机成分相似，具有优良的生物相容性和生物活性。重金属元素钡具有较强的X射线吸收能力，目前已经比较成熟地应用于造影剤的合成(如医用硫酸钡)；同时，钡元素与钙同处于元素周期表第二主族，具有相似的外层电子结构；因此，它们的化学性质类似，可以用羟基磷灰石的合成方法来制备纳米钡磷灰石。目前还没有采用纳米级钡的磷灰石用作微血管造影剤方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供ー种成像清晰、細胞毒性较低、不易沉淀等特点的基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剤及其制备方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剤，其特征在干，该造影剂为以硝酸钡和磷酸氢ニ铵为原料合成的纳米级磷灰石，所述的硝酸钡和磷酸氢ニ铵的摩尔比为(1-2) 1。所述的反应物硝酸钡和磷酸氢ニ铵的摩尔比为1.67 1。一种基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剤的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤将硝酸钡溶液加入磷酸氢ニ铵溶液中搅拌混合，在混合过程中用氨水调节混合液的PH值维持在9-10，并添加1，1，1-三羟基乙烷，以提供羟基环境，在90°C下反应M小吋，所得沉淀物老化M小时以提高均一性并改善晶型，然后使用超声波清洗，并用乙醇调节至中性，离心分离、收集粉体沉积物，最后将产物冷冻干燥即得产品。所述的1，1，1_三羟基乙烷的添加量为使其在混合液中的浓度为lwt%。所述的硝酸钡溶液为硝酸钡的超纯水溶液，所述的磷酸氢ニ铵为磷酸氢ニ铵的超纯水溶液。与现有技术相比，本发明通过钡元素的磷酸化，合成ー种钡的磷灰石。另外将其制备为纳米级别颗粒，使其在水溶液中能均勻分散并稳定存在。本发明拟将纳米级钡的磷灰石用作微血管造影剤，主要是利用重金属钡对X射线的强吸收以及其磷灰石结构优良的生物相容性；与此同时，将钡的磷灰石合成为纳米结构，也从一定程度上减少了因造影剂沉积 (如硫酸钡)而导致的对比度失真，为微血管造影剤的选择提供了新方法。本纳米级钡的磷灰石具有成像清晰、細胞毒性较低、不易沉淀等特点，为微血管造影剤的发展，提供ー种新的应用可能。本发明所得显影剂获得的小鼠脑血管成像能清晰呈现传统造影剤难以进入的穿枝动脉等微小血管，整体成像清晰，分辨率高。
图1为共沉淀法合成的钡磷灰石(Ba-apatite)红外吸收光谱；图2为共沉淀法合成的钡磷灰石(Ba-aprtite)X射线衍射谱图，图中标识了三个主要特征峰的晶面指数；图3为纳米级的钡磷灰石(Ba-apatite)的扫描电镜(SEM)总体视图；图4为纳米级的钡磷灰石(Ba-apatite)的扫描电镜(SEM)局部成像，其中片状薄层厚度为40. 1纳米；图5为联合扫描电镜使用的能量散射X射线谱图(EDS)，图中标识出Ba、P、0元素的存在峰；图6为纳米级钡磷灰石对3T3細胞系毒性检测，用不同浓度的钡磷灰石(10，50， 250yg/mL)孵育ー小时后，再用无菌的PBS溶液冲洗，然后换上新鮮的培养基(含10% FBS)继续孵育24h、48h和72小时；图7为使用纳米级钡磷灰石做显影剂灌注后，小鼠脑部的整体Micro CT血管造影图像；图8为使用纳米级钡磷灰石做显影剂灌注后，小鼠大脑中动脉供血区域部分的放大图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。实施例一、所用原材料和设备1、原材料硝酸钡，纯度> 99.5% (上海化专实验ニ厂)；磷酸氢ニ铵，纯度> 99.0% (国药基团药业股份有限公司)。氨水(联试化工试剂有限公司，其中NH3含量 25% -28. 0% )。三羟甲基乙烷(TME，分析纯AR)。DMEM干粉培养基(高糖)、胎牛血清、非必需氨基酸、青-链霉素、0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA消化液、四甲基偶氮哇蓝(MTT)，96孔板等生物试剂及材料购自Corning Costar公司。2、主要设备扫描电镜形貌分析在上海交大分析测试中心电镜室进行，电镜型 FEI Siron 200 (20kV, 1. Oam)场发射扫描电子显微镜(美国FEI公司)，并配套使用INCA X-Max80能谱仪(牛津仪器)。使用德国Bruker公司的EQUINOX 55型傅立叶变换红外光谱仪测定FIlR光谱，样品扫描范围4000到400CHT1，扫描模式为透射谱。电感耦合等离子体发射光谱仪采用美国Thermo公司的kientific iCAP6300ICP Spectrometer，用于样品中的金属元素检测。X射线衍射仪采用德国Bruker公司的D8advance diffractometer,辐射源为Cr靶。使用上海交通大学Med-X研究院的Micro-CT (美国)(radia公司，Micro)(CT-200) 进行小鼠脑部血管显微成像。ニ、本发明造影剤的制备及其动物实验1.纳米级钡磷灰石的制备纳米级钡的磷灰石采用共沉淀法合成。整个实验过程中均采用超纯水。向圆底烧瓶中加入溶质为0.0334mol Ba(NO3)2的溶液，然后缓缓加入同样体积、溶质为 0. 02mol (NH4) 2ΗΡ04的溶液。同吋，用氨水调节溶液的PH值，并使之維持在9到10。添加浓度为(wt)的1，1，1_三羟基乙烷作助剂，以提供羟基环境。以上过程均在剧烈搅拌中进行。反应温度90°C下反应对小吋。将反应后所得沉淀物老化M小时以提高均一性并改善晶型，然后使用超声波清洗，并用乙醇调节至中性，最后将产物冷冻干燥。2、細胞培养3T3細胞系培养在有10%胎牛血清的DMEM培养液(含200u/mL青霉素、链霉素) 中。复苏的细胞按常规培养操作置于37°C、5%C02(相対湿度90%)培养箱中培养，约2至 3天更换一次培养液。3、细胞毒性钡磷灰石的相对细胞毒性通过使用MTT法检测正常的3T3細胞系而获得。取对数生长期的細胞接种于96孔培养板，每孔含介质200微升，細胞个数为8 X IO3个。培养M小时后，再向每个孔中加入50微升的磷酸盐缓冲液(PBS)，继续培养M小吋。之后，每孔加入 20微升含5mg/ml四甲基偶氮哇蓝(MTT)原液的磷酸盐缓冲液(PBS)。接下的操作在暗室中进行继续培养4小时后，移除孔中与未反应的四甲基偶氮哇蓝(MTT)相结合的介质，并用磷酸盐缓冲液(PBS)仔细冲洗三次。黄色的四甲基偶氮哇蓝(MTT)溶液在活细胞的线粒体中被还原为紫色的甲臜。向每孔中加入200微升的ニ甲基亚砜(DMSO)并振荡十分钟，以溶解所获得的甲臜晶体。使用美国Biotek ELxSOO光吸收酶标仪测量吸光度，波长选择为 490纳米。4、小鼠脑部Micro CT成像六只成年雄性ICR小鼠经腹腔注射过量水合氯醛处死后，打开胸腔。夹闭腹主动脉后剪开右心耳。以总量为Iml的羟基磷酸钡悬浊液经左心室灌注。取脑后马上进行 micro-CT (Xradia,MicroXCT-200)造影。选择χ射线的能量为40kvp，单张图片的曝光时间为2秒。三、实验结果和讨论本实例使用红外光谱(FTIR)和X射线衍射仪(XRD)表征所合成的产物成分。同吋，使用扫描电镜(SEM)确认产物的纳米结构，并结合X射线能谱仪鉴定样品表面的元素成分。在細胞毒性实验中，采用MTT法并结合酶标仪检测。最后以此产物(钡磷灰石)作显影剂，进行小鼠脑部的Micro CT血管成像。FIlR光谱是鉴别功能基团的重要方法，因此，采用FIlR来分析样品表面基团的成分。图1是通过红外光谱测定纳米级钡磷灰石的结构特征3427(3!^1的宽峰是-OH的峰； 996cm—1处的强峰以及紧邻的1093cm—1中强峰是P043—的伸縮振动造成的，同时561cm—1处磷酸根变形振动的尖峰也证实了 P043_的存在。1409CHT1处出现的清晰峰表明样品表面存在与羟基结合的C032—，说明大气中的ニ氧化碳对晶格中的羟基造成了影响。图2是钡磷灰石的X射线衍射图谱(XRD)。谱图中标识出三个清晰的强峰，分別位于 2Θ = 28.08°C，31.95°C 和 38. 52°C 处，晶格常数分别为(015), (110)以及(009)。根据 PDF衍射卡(PDF 25-00 ),峰形接近磷酸钡，这表明产物可能形成ー种钡的磷灰石。使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)測定合成物的元素成分，结果显示，产物中存在Ba、P两种金属元素，且其原子比值为1.47(磷酸钡中Ba P比为1. 5)。另外，采用热重分析法研究钡磷灰石的热稳定性。在温度从274摄氏度上升至890摄氏度过程中， 样品质量损失为2. 88%，这是由于温度上升造成钡磷灰石中羟基的丢失。钡磷灰石表面的形貌呈现以及元素分析使用扫描电镜(SEM)并配套能谱仪(EDS) 进行測定。图3展示了钡磷灰石样品的整体ニ维视图，颗粒大小由0. 2微米至2微米不等。 通过图4可以得出，样品为片状的纳米结构，图中标识出的薄片厚度为40. 1纳米。能量弥散X射线(EDS)谱图见图5，结果确认了样品中Ba、P、0元素的存在。结合以上分析可以得出，合成的产物为钡的磷灰石，并且已经达到片状的纳米结构。細胞毒性是由細胞或者化学物质引起的单纯的細胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的細胞死亡机理。由于钡的磷灰石与钙磷灰石具有一定的形态相似性，同时羟基磷酸钙又具有较好的生物相容性，因此本实例通过小鼠的胚胎成纤维細胞系(ΝΙΗ/3Τ;3)检测钡磷灰石的細胞毒性。MTT法经常用于检测化学物质对細胞增增值数量和細胞代谢活动的影响， 因此使用MTT法检测钡磷灰石对细胞的增值代谢过程的影响。如图6所示，对于添加10 μ g/ mL钡磷灰石的3T3細胞系，与对照组相比，在孵化M小时后細胞毒性已经显现，細胞数量存在一定量的減少。这种趋势随着孵化时间的延长和剂量的加大而更加明显。结果表明，对于3T3細胞系，钡磷灰石在高剂量和长时间孵化的情况下，存在较高的細胞毒性；短时间孵化和小剂量使用的情况下，細胞毒性较小。本实例使用钡磷灰石作为造影剤具有清晰的血管成像效果。图7为使用钡磷灰石灌注后小鼠的脑部整体视图，图中主要血管以及威尔斯环清晰可辨。大脑中动脉供血区域的部分放大图见图8，标尺为250微米，图中可见清晰的皮层穿枝动脉(约为20微米)。四、结论本实例制备的纳米级磷灰石合成エ艺简便，造影剤悬浮度好，不易沉淀，能清晰显影传统硫酸钡不能进入的穿枝动脉等微小血管；同时细胞毒性较低，不易沉淀，成像清晰； 由此推断，纳米级钡的磷灰石在微血管造影剤的发展中具有较大的应用潜力。
权利要求
1.一种基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剤，其特征在干，该造影剂为以硝酸钡和磷酸氢ニ铵为原料合成的纳米级磷灰石，所述的硝酸钡和磷酸氢ニ铵的摩尔比为(1-2) 1。
2.根据权利要求1所述的ー种基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剤，其特征在干，所述的硝酸钡和磷酸氢ニ铵的摩尔比为1.67 1。
3.—种如权利要求1所述的基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剤的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤将硝酸钡溶液加入磷酸氢ニ铵溶液中搅拌混合，在混合过程中用氨水调节混合液的PH值维持在9-10，并添加1，1，1-三羟基乙烷，以提供羟基环境，在 90°C下反应M小吋，所得沉淀物老化M小时以提高均一性并改善晶型，然后使用超声波清洗，并用乙醇调节至中性，离心分离、收集粉体沉积物，最后将产物冷冻干燥即得产品。
4.根据权利要求3所述的ー种基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剤的制备方法，其特征在于，所述的1，1，1_三羟基乙烷的添加量为使其在混合液中的浓度为lwt%。
5.根据权利要求3所述的ー种基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剤的制备方法，其特征在于，所述的硝酸钡溶液为硝酸钡的超纯水溶液，所述的磷酸氢ニ铵为磷酸氢ニ铵的超纯水溶液。
全文摘要
本发明涉及一种基于纳米级钡磷灰石的微血管造影剂及其制备方法，该造影剂为以硝酸钡和磷酸氢二铵为原料合成的纳米级钡磷灰石，所述的硝酸钡和磷酸氢二铵的摩尔比为(1-2)∶1。与现有技术相比，本发明造影剂细胞毒性较低，悬浮度高，不易沉淀，能清晰地显影传统造影剂难以进入的穿枝动脉等微小血管，为新型微血管造影剂的制备提供了一种新的选择。
文档编号A61K49/04GK102526768SQ201210007638
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月11日 优先权日2012年1月11日
发明者何琳, 朱新远, 朱邦尚, 王永亭, 薄洋, 袁晓亚, 金承钰, 马晓飞 申请人:上海交通大学