专利名称：醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用。
背景技术：
随着社会工业化和生活方式的改变，糖尿病的发病率逐年升高,死亡率仅次于肿瘤和心血管疾病，成为第三大威胁人类健康的疾病。尤其是在我国，目前糖尿病的发病率非常高，在成年人达到随着民众生活水平的提高，国内糖尿病人群正在快速增长。我国《2010糖尿病专题调查》结果显示，我国2010年糖尿病患病率，男性为10.24%，女性为9.05%。糖尿病包括I型糖尿病，2型糖尿病，其它特殊类型糖尿病及妊娠期糖尿病,其中，I型糖尿病的治疗主要依赖于胰岛素治疗，而2型糖尿病的治疗则又丰富的选择，但各有其优缺点。游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)是生物体的一种重要能量来源，同时也是一种信号分子，具有多种生理作用。FFA的生理功能及其对机体内的营养代谢疾病的调控作用长期以来受到人们的关注，但由于FFA的特异性膜受体一直未被发现，关于其分子机制的认识无法进一步深入。而最新研究找到并鉴定了 FFA的特异性膜受体，使科学家们重新认识了 FFA在健康人及患者体内发挥作用的分子机制。游离脂肪酸受体(FFAR)属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族，而鉴于目前30%以上的药物靶标都是GPCR，因此开发基于FFA受体的高亲和力的药物进而治疗如糖尿病等的复杂的疾病，将有着很大的应用潜力。短链脂肪酸是肠道菌群消化食物过程的产物，而短链脂肪酸亦受体属于游离脂肪酸受体家族。其中，脂肪酸受体2 (FFAR2)又名GPR43，于1997年首次被克隆，但直到2003年之后才被逐渐重视，之后不断有重要发现发表；尤其是2010年，新发表论文数量和质量都是历年之最，足见目前FFAR2的研究已成为国际上一个新的研究热点。文献查阅发现FFAR2在肠道、胃、骨髓、脾脏、外周血单个核细胞、脂肪等组织均有表达，而在免疫相关组织、肠道、脂肪组织中表达较高，因此目前其研究主要集中在免疫、肠炎、脂肪分化领域。文献报道，短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids, SCFAs)均能一定程度上结合FFAR2并激活下游信号通路但亲和力有明显差异，具体顺序为亲和力C2 = C3 > C4 > C5 = C6 (数字代表短链脂肪酸中碳原子数)，而长链脂肪酸则不能激活其下游信号通路。在炎症相关研究方面，文献报道在硫酸葡聚糖(Dextran sulphate sodium, DSS)诱导的肠炎模型中，通过在造模小鼠饮水中添加FFAR2激动剂醋酸钠(Sodium Acetate)能够显著抑制肠道炎症反应，并缓解肠道损伤指数。而FFAR2基因敲除小鼠中，醋酸钠处理并不能够显著缓解DSS诱导的肠炎。上述发现提示FFAR2与SCFA的相互作用可能将食物、胃肠道微生物代谢、免疫系统及炎症反应在分子机制上的相互作用联系起来，并发挥着重要的调节作用。在脂肪相关研究方面，文献报道FFAR2与脂肪细胞分化有密切联系，但在不同实验条件下对高脂喂养及自发性肥胖动物模型的脂肪含量具有不同的调节作用。上述研究表明，FFAR2在正常及肥胖状态下对脂肪细胞 分化及脂肪酸代谢的调节具有不同的特点，其具体机制还需要进一步深入研究。然而，上述研究虽然对FFAR2的功能有重要的提示作用，但是有关FFAR2的功能及其作用的分子机制方面还有很多有待探索之处。鉴于FFAR2可能发挥着重要的生理功能，尤其是对炎症反应及糖代谢的调节作用，我们利用文献中报道的FFAR2的配体-醋酸盐，在糖尿病小鼠模型中通过醋酸盐激活FFAR2信号通路，进而发现醋酸盐对糖尿病小鼠模型具有显著的改善作用。当前我国糖尿病的治疗已经有丰富的临床用药，如各种短效、中效、长效胰岛素，
二甲双胍，罗格列酮，格列美脲，艾塞那肽等。而醋酸盐是人体代谢及肠道菌群代谢的产物之一，但是在人体血液中浓度较低。醋酸盐(分子式为C00-，分子量为59.05)由于其为人体正常代谢产物，且化学成分简单，毒性低，便于吸收，因此醋酸盐对糖尿病的保护作用，可以利用其作为糖尿病治疗的辅助药物，可以减少其它临床用药的用量，并减轻对其他临床用药的依赖性，对改善目前糖尿病患者的用药显著具有一定的促进作用，具有非常重要的社会意义。
发明内容
本发明的目的是提供醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用。一种改善糖尿病药物，该药物中含有醋酸盐。所述醋酸盐为碱金属醋酸盐中的一种或几种的任意组合。所述醋酸盐为醋酸钠。所述药物的剂型为片剂、胶囊、注射剂的一种。醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用。所述醋酸盐为碱金属醋酸盐中的一种或几种的任意组合。所述醋酸盐为醋酸钠。本发明利用小剂量多次链脲菌素注射引发的糖尿病小鼠模型(Mult1-Low Doseof Streptozocin模型，MLDS),首次揭示醋酸盐处理可以显著抑制MLDS引起的小鼠随机血糖的升高，显著改善MLDS引起的小鼠糖耐量的异常，显著增加MLDS处理后小鼠血清中胰岛素的含量，并显著抑制MLDS引起的小鼠脾脏中炎症因子的表达；本发明的实验结果表明，醋酸盐在临床上对糖尿病具有一定的改善作用。
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图1:MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠随机血糖的曲线图。图2:MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠的糖耐量的曲线图。图3: MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠的糖耐量实验中血糖的曲线下面积。图4: MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠在外源胰岛素注射条件下的血糖的曲线图。图5:MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠在进食状态下血清中的胰岛素含量曲线图。图6: MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠脾脏中炎症因子IL_6在mRNA水平的表达的曲线图。
具体实施方式
:下面结合具体实施方式
，详细描述本发明。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用，醋酸盐用于改善糖尿病，醋酸盐可抑制血糖的升高，改善糖耐量的异常，增加血清中胰岛素的含量，并可抑制脾脏中炎症因子的表达，所述醋酸盐为碱金属醋酸盐，如醋酸钠、醋酸钾、醋酸铯中的一种或几种的任意组合，本实施例以醋酸钠为例研究醋酸盐的用途。本发明的下列实验显示了醋酸盐在多次小剂量链脲菌素注射诱发的糖尿病模型中，对糖尿病有明显的保护作用。1、为了观察醋酸盐对于链脲菌素诱发的小鼠糖尿病的改善作用，我们通过给小鼠腹腔注射50mg/kg链脲菌素，并连续5天注射，造成小鼠因胰岛P细胞损伤诱发的糖尿病模型(即MLDS模型)。实施例1: (1),选择6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠共42只(购自上海斯莱克实验动物有限公司)。标准饮食，适应性喂养I周后，分为4组，分别为生理盐水溶剂组(Vehicle，共6只，分2笼，每笼三只)，单纯醋酸盐组(Acetate，共6只，分2笼，每笼三只)，模型组(MLDS+Vehicle，共15只，分5笼，每笼三只)，模型醋酸盐处理组(MLDS+Acetate，共15只，分5笼，每笼三只)。(2)，在MLDS模型造模前三天，给药组通过腹腔注射500mg/Kg醋酸钠，200ul每只。在第三天注射醋酸钠2h后，腹腔注射左脲菌素(50mg/kg，用柠檬酸缓冲液，10mmol/L，PH值4.5);用同样方法，连续注射醋酸钠与左脲菌素处理5天。(3)，连续注射左脲菌素5天后，各组单独给予溶剂或者醋酸盐处理。期间，在对应时间点，通过刀片取小鼠尾端静脉血，于上午9:0(T10:00用强生公司Life Scan快速血糖仪检测血糖浓度并记录随机血糖，如图1所示，为随机血糖随时间变化的曲线图。结果如图1所示，单纯醋酸盐处理组随机血糖水平与对照组没有显著差异，而单纯模型组(链脲菌素处理)小鼠随机血糖与对照组相比显著升高，同时，给予醋酸盐处理的模型组，随机血糖水平与单纯模型组相比显著降低，上述结果显示醋酸盐处理的糖尿病小鼠模型随机血糖状态有显著改善。2、本发明通过给MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠糖耐量进行研究，各组小鼠进行腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)。实施例2:腹腔葡萄糖耐量试验，于实验前天下午6:00撤食，实验当天8:00开始，刀片切尾静脉，用强生Life Scan快速血糖仪测各点血糖，葡萄糖耐量实验用浓度20%(m/v)的2g/Kg葡萄糖溶于生理盐水，并腹腔注射，分别于注射前(Omin)，注射后15min、30min、60min、90min和120min测血糖,测得其血糖随时间变化的曲线。如图2所示，单纯醋酸盐处理组葡萄糖负荷后，血糖水平与对照组没有显著差异(未在结果中显示)，而单纯模型组(链脲菌素处理)小鼠葡萄糖负荷后，血糖与对照组相比显著升高。同时，给予醋酸盐处理的模型组，葡萄糖负荷后，血糖水平与单纯模型组相比显著降低。上述结果显示醋酸盐处理的糖尿病小鼠模型葡萄糖耐受有显著的改善作用。经对葡萄糖负荷后，计算了单纯模型组与醋酸盐处理的模型组葡萄糖曲线下面积，如图3所示，其为本发明的MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠的糖耐量实验中血糖的曲线下面积，各组小鼠血糖曲线下面积用软件GraphPad Prism计算,各组间统计学分析亦用GraphPad Prism计算,*/ <%仍；醋酸盐处理组葡萄糖曲线下面积显著低于单纯模型组。结果显示，醋酸盐处理能够显著改善MLDS诱导的糖尿病小鼠模型的葡萄糖耐量。3、为了观察醋酸盐对于链脲菌素诱发的小鼠糖尿病改善作用的机理，通过给各组小鼠进行腹腔胰岛素耐量试验(ITT)。如图4所示，其为本发明的MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠在外源胰岛素注射条件下的血糖的曲线图。实施例3:胰岛素耐量试验，于实验当天上午8:00撤食，实验当天下午2:00开始，刀片切尾静脉，用强生Life Scan快速血糖仪测各点血糖，胰岛素耐量实验用浓度0.75U/Kg的胰岛素溶于生理盐水(胰岛素Humulin购自礼来公司)，并腹腔注射，分别于注射前(Omin),注射后 15min、30min、60min、90min 和 120min 测血糖。图4中胰岛素耐量实验中各组小鼠血糖的统计学分析亦用GraphPad Prism计算， <0.05，***p〈0.0Olo如图4所示，单纯醋酸盐处理组葡萄糖负荷后，血糖水平与对照组没有显著差异(未在结果中显示)，而单纯模型组(链脲菌素处理)小鼠葡萄糖负荷后，血糖与对照组相比显著升高。同时，给予醋酸盐处理的模型组，葡萄糖负荷后，血糖水平与单纯模型组相比显著降低。但经过对每组小鼠的Omin血糖的归一化处理，发现醋酸盐处理后，模型组小鼠的胰岛素敏感性与单纯模型组相比，没有显著变化。上述结果显示醋酸盐处理的糖尿病小鼠模型胰岛素敏感性没有显著的影响，但对小鼠在未进食状态下的血糖具有显著的改善作用。结果显示，醋酸盐处理能够显著降低MLDS诱导的糖尿病小鼠在未进食状态下的血糖水平。如图5所示，其为本发明的MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠在进食状态下血清中的胰岛素含量曲线图。实施例4:⑴小鼠给与溶剂或者醋酸盐处理4周后，于实验当天10:00用Iml —次性无菌注射器自眼眶静脉丛取血，约200ul每只小鼠。(2)，小鼠全血(无抗凝剂)于4°C冰箱放置I小时后，4°C离心IOOOg 10分钟，取血清检测血清中Insulin含量。(3)，Insulin检测用酶联免疫吸附法测，试剂盒采购自R&D公司小鼠Insulin ELISA试剂盒，实验操作完全按照试剂盒说明进行。(4)，图5中各组小鼠血清中胰岛素含量的统计学分析亦用 GraphPad Prism 计算，<0.05。结果如图5所示，单纯模型组(链脲菌素处理)小鼠血清中胰岛素水平与对照组相比显著降低，表明小鼠胰岛P细胞受到了一定程度的损害，而给予醋酸盐处理的模型组，血清中胰岛素水平与单纯模型组相比显著增加。上述结果显示，在进食状态下，醋酸盐处理能够对MLDS诱导的糖尿病小鼠的胰岛^细胞的损伤具有一定的保护作用。6、为了观察醋酸盐对于链脲菌素诱发的小鼠糖尿病改善作用的机理，研究小鼠脾脏中炎症因子IL-6在mRNA水平的表达。如图6所示，其为本发明的MLDS诱导的糖尿病小鼠模型中小鼠脾脏中炎症因子IL-6在mRNA水平的表达的曲线图。各组小鼠脾脏，因为脾脏中有大量的免疫细胞。通过实时定量PCR检测脾脏中炎症因子的表达情况。实施例5: (I)， 用戊巴比妥钠麻醉小鼠后，开腹，迅速取出小鼠脾脏，并迅速置于液氮罐中待用。(2)，从液氮容器中取小鼠脾脏，每只小鼠取脾脏约5mg，与TRIzoI中剪碎(TRIzol购自Invitrogen公司),并与勻衆仪中捣碎。(3),脾脏组织荣勻衆通过常规的总RNA抽提方法(TRIzol提供方法),并用逆转录试剂盒得到cDNA (Promega公司产品)。(4),用SYBR green检测试剂盒Real-Time PCR检测组织中相关基因含量(TAKARA公司产品)。
(5),图6中各组小鼠血清中胰岛素含量的统计学分析亦用GraphPad Prism计算,05。如图6所示，单纯醋酸盐处理组脾脏中IL-6的mRNA表达水平与对照组没有显著差异，而单纯模型组(链脲菌素处理)小鼠脾脏中IL-6的mRNA表达水平与对照组相比显著升高。同时，给予醋酸盐处理的模型组，小鼠脾脏中IL-6的mRNA表达水平与单纯模型组相比显著降低。上述结果显示醋酸盐处理对糖尿病小鼠脾脏中的炎症状态有显著改善作用。本发明显示了醋酸盐对低剂量多次链脲菌素注射诱发糖尿病小鼠模型糖尿病的改善作用。本发明还公开一种改善糖尿病药物，该药物中含有醋酸盐，所述醋酸盐为碱金属醋酸盐中的一种或几种的任意组合，其剂型为片剂、胶囊、注射剂的一种。醋酸盐是人体正常的代谢产物，具有成本低，副作用小等特点，具有很好的辅助治疗糖尿病的应用潜力。参考目前动物模型上的结果，推荐应用成人每天2次，20mg/kg次的
剂 量。
权利要求
1.一种改善糖尿病药物，其特征在于，该药物中含有醋酸盐。
2.根据权利要求1所述的改善糖尿病药物，其特征在于，所述醋酸盐为碱金属醋酸盐中的一种或几种的任意组合。
3.根据权利要求1或2所述的改善糖尿病药物，其特征在于，所述醋酸盐为醋酸钠。
4.根据权利要求1所述的改善糖尿病药物，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、注射剂的一种。
5.醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述醋酸盐为碱金属醋酸盐中的一种或几种的任意组合。
7.根据权利要求5或6所述的醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述醋酸盐为 醋酸钠。
全文摘要
本发明公开醋酸盐在制备改善糖尿病药物中的应用。利用小剂量多次链脲菌素注射引发的糖尿病小鼠模型，发现醋酸盐处理可以显著抑制MLDS引起的小鼠随机血糖的升高，显著改善MLDS引起的小鼠糖耐量的异常，显著增加MLDS处理后小鼠血清中胰岛素的含量，并显著抑制MLDS引起的小鼠脾脏中炎症因子的表达。本发明首次提供了醋酸盐用于治疗MLDS诱发的糖尿病在动物模型上的证据，提示醋酸盐可能在临床上对糖尿病具有一定的改善作用。
文档编号A61K31/185GK103211804SQ201210018250
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者宁光, 石国军, 顾卫琼, 杨明兰, 章晓芳 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院